Artigo de investigação

Mecanismo da Decocção Jianpi Shengxue no alívio da mielosupressão induzida por ciclofosfamida em camundongos

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DOI:

10.3791/69542

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2 de janeiro de 2026

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1Hunan University of Chinese Medicine, 2Department of Traditional Chinese Medicine /Integrative Oncology, Hunan Cancer Hospital/The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University

Autores correspondentes: Yang Li <liyang@hnca.org.cn>

Neste artigo

Resumo

Este protocolo elucida sistematicamente como a decocção Jianpi Shengxue mitiga a mielosupressão induzida por ciclofosfamida por meio de uma abordagem integrada de farmacologia em rede e experimentos em animais, revelando seus mecanismos multi-alvo e potencial como terapia adjuvante.

Resumo

O artigo tem como objetivo investigar como a Decocção Jianpi Shengxue (JPSXD) alivia a mielossupressão induzida pela quimioterapia por meio de farmacologia em rede e experimentos com animais. Para isso, componentes-chave e alvos foram analisados, e a Rede de Interação Proteína-Proteína (PPI) e redes erva-componente-alvo foram construídas. A Gene Ontology (GO) e o enriquecimento da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) identificaram as principais vias. Um modelo de miossupressão induzido por ciclofosfamida (CTX) foi estabelecido em 60 camundongos C57/BL6. O JPSXD foi administrado em doses diferentes por 7 dias. Foram avaliados hemogramas periféricos, citocinas (trombopoietina [TPO], eritropoietina [EPO], fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos [GM-CSF]), índice do timo, morfologia da medula óssea, células CD34+ e expressão de AKT1, JAK2 e EGFR. A análise de rede identificou 172 compostos e 454 alvos, destacando as vias PI3K-Akt e JAK-STAT. In vivo, CTX reduziu os níveis de leucócitos e proteínas sinalizadoras, enquanto o JPSXD restaurou as contagens, aumentou o AKT1, JAK2 e EGFR, e melhorou o índice do timo (p < 0,05). JPSXD em doses médias e altas aumentaram TPO, EPO, GM-CSF, CD34+ e melhoraram a estrutura da medula óssea, sendo a dose alta o que mostrou o efeito mais forte. De forma conclusiva, o JPSXD alivia a mielosupressão por meio da regulação multi-alvo e múltiplas vias, apoiando seu potencial como terapia auxiliar para leucopenia induzida pela quimioterapia.

Introdução

A quimioterapia é uma pedra angular no tratamento de várias malignidades, principalmente inibindo a proliferação e a sobrevivência das célulascancerígenas 1,2, ampliando assim a sobrevivência do paciente. No entanto, devido à falta de seletividade no direcionamento dos tecidos normais, os medicamentos quimioterápicos frequentemente causam danos graves a células e tecidos saudáveis, levando a uma série de efeitosadversos 3. Um dos efeitos colaterais mais comuns e graves da quimioterapia é a mielosupressão, caracterizada pela redução da produção de glóbulos sanguíneos, incluindo glóbulos brancos (glóbulos brancos), glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos) e plaquetas (PLTs)2,4. A mielossupressão prejudica gravemente o sistema de defesa imunológica, aumentando o risco de infecções, sangramentos, anemia e outras complicações. Também diminui significativamente a qualidade de vida dos pacientes e pode até ser potencialmente fatal5. Assim, aliviar e prevenir a mielosupressão induzida pela quimioterapia é fundamental para melhorar a tolerância dos pacientes à quimioterapia e a sobrevivência geral.

Os tratamentos clínicos atuais para mielosupressão envolvem principalmente fatores de crescimento hematopoiéticos, como fator estimulante de colônias de granulócitos [G-CSF], eritropoietina [EPO]) e terapiatransfusional 6,7. No entanto, essas abordagens frequentemente estão associadas a altos custos, potenciais efeitos colaterais e eficácia limitada. Como resultado, explorar métodos mais seguros e eficazes para prevenir e aliviar a mielosupressão continua sendo um foco principal de pesquisa. Nos últimos anos, a medicina tradicional chinesa (MTC) tem recebido grande atenção por seu papel no tratamento do câncer e no manejo dos efeitos colaterais induzidos pelaquimioterapia 8,9. Acredita-se que muitas formulações de MTC tenham efeitos tonificantes e reguladores do sistema imunológico, como a decocção 10 de Shengxuebao,comprimidos 11 de Dihuang Shengbai e compostos de ginsenósídeos12, que não apenas protegem as células normais e reduzem efeitos colaterais tóxicos, mas também aumentam a eficácia antitumoral.

A Decocção Jianpi Shengxue (JPSXD) é uma fórmula clássica da MTC que exemplifica os princípios terapêuticos de tonificação do Qi e nutriçãodo sangue 13. Esta fórmula é uma modificação sofisticada da Decocção Sijunzi combinada com Er Zhi Wan, integrando os efeitos sinérgicos de múltiplas ervas para tratar a deficiência de Qi esangue 14. A fórmula consiste em ginseng (Ren Shen), astrágalo (Huang Qi), epimedium (Yin Yang Huo), atractylodes (Bai Zhu), inhame (Shan Yao), sálvia (Dan Shen), rehmannia preparada (Shu Di Huang), semente de dodder (Tu Si Zi), loba (Gou Qi Zi), ligustrum (Nv Zhen Zi), angélica (Dang Gui), cevada frita (Chao Mai Ya), moela de frango frito (Chao Ji Nei Jin), casca de tangerina seca (Chen Pi), semente de coix (Yi Yi Ren) e várias outras ervas. Cada erva desempenha um papel específico na fórmula, seguindo o princípio da MTC de ervas soberanas, ministras, assistentes e guias, o que garante um efeito terapêutico equilibrado e direcionado.

A Decocção Sijunzi, uma fórmula fundamental na MTC, é renomada por sua capacidade de tonificar o Qi e fortalecer o baço. Tem sido amplamente utilizado para tratar condições associadas à deficiência de Qi e sangue, como fadiga, apetite fraco e imunidade enfraquecida. Estudos farmacológicos modernos demonstraram que a Decocção Sijunzi melhora a função imunológica, promove a hematopoiese e melhora a capacidade de autorreparação docorpo 15,16. Com base nessa base, o JPSXD incorpora ervas adicionais para aumentar ainda mais sua eficácia na nutrição do sangue e tratar deficiências mais complexas. Por exemplo, rehmannia preparada e angélica são ervas essenciais que nutrem o sangue17, enquanto astrágalo e ginseng atuam sinergicamente para aumentar o Qi e melhorar a vitalidadegeral 18.

Estudos recentes destacaram os potenciais efeitos antitumorais do JPSXD, sugerindo que sua abordagem multicomponente e multi-alvo pode inibir o crescimento tumoral e aumentar a eficácia dos tratamentos convencionais contrao câncer 19,20. A capacidade da fórmula de modular respostas imunes e melhorar a função hematopoiética a torna particularmente valiosa no apoio a pacientes que estão passando por quimioterapia ou radioterapia, que frequentemente apresentam deficiência de Qi e sangue como efeito colateral dotratamento 21. Além disso, a inclusão de ervas como sálvia e epimédio demonstrou melhorar a microcirculação e aprimorar os mecanismos de reparação celular, contribuindo para os benefícios terapêuticos gerais dafórmula 22.

Estudos farmacológicos modernos demonstraram que cada erva individual no JPSXD possui atividades farmacológicas relacionadas à função hematopoética, anti-mielossupressão, imunomodulação e antioxidação, bem como melhora microcirculatória, fornecendo suporte indireto à pesquisa para o uso do JPSXD no alívio da mielossupressão induzida por quimioterapia. A Tabela 1 resume os principais efeitos farmacológicos de cada erva juntamente com as referências correspondentes, com foco em estudos que investigam hematopoiese, atividade antimielossupressora, imunomodulação e propriedades antioxidantes ou de microcirculação. A sinergia complexa dos componentes no JPSXD envolve tanto interações cooperativas quanto antagônicas entre as ervas, visando múltiplas vias para alcançar um efeito terapêutico holístico. Por exemplo, enquanto ginseng e astrágalo trabalham juntos para tonificar o Qi, a sálvia e a rehmannia preparada colaboram para nutrir o sangue e melhorar a circulação. Ao mesmo tempo, ervas como casca de tangerina seca e cevada frita ajudam a regular a digestão e a prevenção da estagnação, garantindo que os efeitos tonificantes da fórmula sejam absorvidos e utilizados de forma eficaz pelocorpo. Essa abordagem multifacetada está alinhada com a filosofia da MTC de tratar a causa raiz da doença enquanto aborda seus sintomas.

Em conclusão, o JPSXD é uma fórmula de MTC bem equilibrada e cientificamente apoiada que incorpora os princípios do Qi e da desintoxicação sanguínea. Suas aplicações potenciais para fortalecer a imunidade, promover a hematopoiese e apoiar a terapia antitumoral fazem dele uma adição valiosa tanto às práticas médicas tradicionais quanto modernas. No entanto, ainda faltam evidências clínicas de alta qualidade que avaliem diretamente a eficácia do JPSXD no alívio da mielosupressão induzida por quimioterapia. Mais pesquisas são necessárias para elucidar seus mecanismos subjacentes e otimizar suas estratégias de aplicação clínica. Portanto, este estudo tem como objetivo fornecer prova de conceito para os potenciais efeitos terapêuticos do JPSXD sob uma perspectiva mecanicista pré-clínica.

A farmacologia de rede, com sua natureza sistêmica e integrativa, tem sido amplamente utilizada para identificar ingredientes ativos de medicamentos chineses e elucidar seus mecanismos de ação24,25. Neste estudo, a farmacologia em redes foi empregada para analisar as possíveis vias de sinalização e alvos-chave afetados pelo JPSXD no contexto da mielosupressão. Além disso, foi estabelecido um modelo de camundongos com mielosupressão induzido por ciclofosfamida (CTX) para avaliar indicadores relevantes e avaliar os efeitos do JPSXD na mielosupressão. Também foi realizada validação preliminar dos principais alvos e caminhos identificados por meio da farmacologia de rede. Este é o primeiro estudo a integrar sistematicamente farmacologia em redes com experimentos em animais para elucidar o mecanismo molecular pelo qual o JPSXD alivia a mielosupressão induzida pela quimioterapia por meio da regulação multi-alvo das vias de sinalização, como a via PI3K-AKT, preenchendo assim uma lacuna na compreensão mecanicista dos efeitos protetores hematopoéticos dessa fórmula.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com o Regulamento de Administração de Animais de Laboratório e as diretrizes éticas do Centro de Animais Experimentais do Hospital de Câncer de Hunan. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital de Câncer de Hunan (Nº de Aprovação: KNZY-202416). Ao longo do estudo, os pesquisadores fizeram todo o possível para minimizar o número de animais usados e aliviar seu sofrimento.

Preparação animal
Um total de 60 camundongos machos C57/BL6 de 10 semanas foi obtido da Hunan Slack Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. (Licença nº: SCXK [Hu] 2021-0002). Todos os camundongos foram alojados no Centro Experimental de Animais do Hospital de Câncer de Hunan sob condições ambientais controladas: temperatura: 23 ± 2 °C, umidade: 50% ± 10%, e ciclo de 12 horas luz/escuro (8:30-20:30). Os ratos tinham acesso improvisado a comida e água. Antes da experimentação, eles eram aclimatados ao ambiente por meio de manuseio diário por 5 minutos ao longo de um período de 3 dias. Após a aclimatação, todos os 60 camundongos foram estratificados pelo peso corporal e distribuídos aleatoriamente em seis grupos (n = 10 por grupo) usando uma tabela de números aleatórios gerada por computador. Os grupos incluíam: controle em branco, modelo, controle de soro fisiológico normal (NS), JPSXD em dose alta (40 mg/kg), JPSXD em dose média (30 mg/kg) e JPSXD em baixa dose (20 mg/kg). O processo de randomização não garantiu diferenças significativas no peso corporal médio entre os grupos (p > 0,05). A sequência de randomização foi gerada e executada por pesquisadores não envolvidos em procedimentos experimentais subsequentes para minimizar o viés.

Preparação de materiais
Segurança e descarte de resíduos: Este estudo envolveu CTX, um agente quimioterapêutico altamente tóxico. Todos os procedimentos foram conduzidos em estrita conformidade com os Regulamentos de Gestão de Segurança de Produtos Químicos Perigosos e os padrões laboratoriais de Biossegurança Nível 2. Precauções específicas incluíam o uso de roupas protetoras descartáveis, luvas de nitrila, respiradores N95 e óculos de proteção por todo o pessoal. A preparação e administração do CTX foram realizadas dentro de um gabinete de biossegurança Classe II. A preparação da solução de injeção CTX foi realizada em uma exaustão usando instrumentos dedicados para evitar a formação de aerossóis. Objetos cortantes e itens contaminados com CTX, como seringas e luvas, foram descartados em recipientes resistentes a perfurações. Outros materiais contaminados (por exemplo, cama ou tecidos animais) foram inativados por imersão em hipoclorito de sódio a 10% por 24 horas e posteriormente incinerados por um profissional certificado de descarte de resíduos médicos. Em caso de vazamento de CTX, a área era imediatamente coberta com algodão absorvente e neutralizada com uma solução de tiosulfato de sódio a 1%. O incidente foi então comunicado ao supervisor de segurança.

Medicamentos e reagentes: A injeção de CTX foi obtida da Baxter Oncology GmbH, Alemanha (Lote nº: HJ20160467). O JPSXD foi preparado pelo Departamento de Medicina Tradicional Chinesa do Hospital de Câncer de Hunan. Consistia em 15 ervas tradicionais — Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Epimedium brevicornum, Atractylodes macrocephala, Dioscorea opposita, Salvia miltiorrhiza, Rehmannia glutinosa, Cuscuta chinensis, Lycium barbarum, Ligustrum lucidum, Angelica sinensis, malte frito, revestimento de moela de frango, casca de tangerina seca e semente de Coix — combinadas segundo as razões clássicasde compatibilidade 20. A decocção foi concentrada até uma concentração final de 3 kg/L (ou seja, 3 g/mL). Antes do gavage, o concentrado era diluído com NS para atingir as concentrações necessárias para cada grupo de dose: 4 mg/mL para o grupo de alta dose (40 mg/kg), 3 mg/mL para o grupo de dose média (30 mg/kg) e 2 mg/mL para o grupo de baixa dose (20 mg/kg)26. O volume de gavage foi calculado como 0,1 mL por 10 g de peso corporal, resultando em um volume final de administração de 0,2-0,25 mL por camundongo (baseado em uma faixa de peso de 20-25 g)27.

Kits ELISA: Kits ELISA comercialmente disponíveis para fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), EPO e trombopoietina (TPO) foram usados. As amostras de soro foram diluídas 1:5 em tampão PBS (pH 7,4) antes do teste. Os padrões foram reconstituídos em 100 μL por poço.

Anticorpo secundário: IgG anti-coelho conjugado com HRP foi diluído em 1:5000 (concentração final: 0,04 μg/mL) em tampão TBST contendo 5% de leite desnatado e 0,05% de Tween-20. A solução foi preparada na hora e incubada em temperatura ambiente por 1 hora.

Foram usados anticorpos primários para Western blot: GAPDH (policlonal de coelho), AKT (policlonal de coelho), JAK2 (monoclonal de coelho) e EGFR (monoclonal de camundongo). Todos os anticorpos foram diluídos em tampão TBST contendo 5% de BSA: GAPDH (1:1000), AKT (1:1000), JAK2 (1:800) e EGFR (1:800). O volume de incubação era de 100 μL por membrana.

Fixador de tecido: Uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% foi preparada dissolvendo o pó de PFA em PBS (pH 7,4). Os lenços foram fixados por 24 horas.

Solução de coloração de hematoxilina e eosina (H&E): Solução de hematoxilina (0,1% de hematoxilina Harris) e solução de eosina Y (0,5%) foram preparadas de acordo com os protocolos padrãode patologia 28. A duração da coloração foi de 5 minutos para hematoxilina e 3 minutos para eosina.

Buffer bloqueador de imunofluorescência: Buffer PBS contendo 10% de soro de cabra e 1% de BSA foi usado para bloqueio, com incubação de 30 minutos.

Tampão de diluição de anticorpos para imunofluorescência: Os anticorpos primários (CD34+, TPO, EPO, GM-CSF) para imunofluorescência foram diluídos em tampão PBS contendo 1% de BSA, seguindo a razão de diluição recomendada pelo fabricante (1:200), resultando em uma concentração final de 2,5 μg/mL. O volume de incubação foi de 50 μL por seção de tecido.

Indução de um modelo animal
60 camundongos foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n = 10 por grupo): controle em branco, modelo, dose alta, dose média, dose baixa e controle NS. Exceto pelo grupo controle em branco, todos os camundongos receberam injeções intraperitoneais de CTX (20 mg/kg) uma vez ao dia por 3 dias consecutivos para estabelecer um modelo de mielosupressão. Todos os camundongos modelo apresentaram < de glóbulos brancos 1,8 × 109/L, PLT < 85 × 10⁹/L e redução de >55% nas células nucleadas pela medula óssea 24 horas após a injeção final. Este protocolo está alinhado com modelos estabelecidos de mielosupressão induzida porCTX 29,30. Após a injeção, os camundongos foram monitorados diariamente quanto à condição geral, incluindo nível de atividade, aparência do pelo e mudanças no peso corporal. Desde o início da modelagem até o final do experimento, o peso corporal era registrado no mesmo horário todos os dias usando uma balança eletrônica. A taxa de mudança de peso corporal foi calculada da seguinte forma: (peso final / peso inicial) x 100%, para avaliar o estado fisiológico geral e o potencial efeito protetor do JPSXD. Após a injeção, os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente (IVCs), cada uma claramente rotulada como contaminada por CTX. A cama era trocada a cada 2 dias, e toda a cama usada era descartada de acordo com os protocolos de resíduos perigosos descritos acima.

Administração intragástrica
Ratos dos grupos de alta, média e baixa dose receberam JPSXD via gavage em doses de 40 mg/kg, 30 mg/kg e 20 mg/kg, respectivamente. O grupo controle salino recebeu volume igual de NS. Soluções de gavage foram preparadas em concentrações de 4 mg/mL, 3 mg/mL e 2 mg/mL, respectivamente, e administradas em volume de 0,1 mL por 10 g de peso corporal. Todos os camundongos foram atacados 2 vezes ao dia por 7 dias consecutivos. O grupo controle de soro fisiológico recebeu 0,2-0,25 mL por camundongo de NS. Nenhum tratamento foi dado aos grupos de blank e modelo. A ausência de tosse ou de luta durante o gavage indicava uma técnica correta de administração.

Coleta de sangue e preparação do soro
Noterceiro dia após a injeção de CTX, 0,2 mL de sangue foi coletado da veia caudal para avaliar o sucesso do estabelecimento do modelo, medindo a contagem de células sanguíneas periféricas usando um analisador hematológico totalmente automatizado. Às 24 horas após o último ataque do JPSXD, sangue foi coletado do seio orbital de camundongos selecionados aleatoriamente (n = 10 por grupo). Uma parte do sangue foi usada para análise completa do hemograma, enquanto o restante foi processado para preparação do soro. As amostras foram centrifugadas a 3.000 x g por 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante (uma camada superior clara, amarelo-pálida) foi coletado como soro e alicotado para armazenamento a -80 °C em ensaios ELISA subsequentes e testes de função hepática/rim. A camada sérica foi observada claramente separada da camada de células sanguíneas, sem sinais de hemólise ou turbidez. Os parâmetros hematológicos medidos incluíram os níveis de GLÓBULOS BRANCOS, GLÓBULOS, PLT e hemoglobina (Hb).

Avaliação da função hepática e renal
Um analisador bioquímico totalmente automatizado foi usado para medir marcadores de função hepática sérica — alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) — e marcadores de função renal — ureia sanguínea, nitrogênio (BUN) e creatinina (Cre). Todos os procedimentos seguiam o protocolo operacional padrão do instrumento. Especificamente, 100 μL de soro foram misturados com os kits de ensaio correspondentes (ALT, AST, BUN e Cre) e incubados a 37 °C por 5 minutos. A absorvância foi medida em 340 nm. Cada amostra foi testada em duplicado, e o valor médio foi usado para análise.

Cálculo do índice de órgão
Às 24 horas após a administração final do JPSXD, os camundongos foram eutanasiados por inalação gradual de dióxido de carbono (CO2) (vazão: 20% volume da câmara/min), seguida por luxação cervical como métodosecundário 31. Imediatamente após a eutanásia, fígado, rins, baço e timo foram colhidos assépticamente por uma incisão ventral na linha média. Os órgãos eram cuidadosamente dissecados para se livrar dos tecidos conjuntivos e da gordura ao redor, depois enxaguados em soro fisiológico normal gelado (NS) para remover o sangue residual. Os órgãos eram secados com papel filtro pré-pesado sob pressão padronizada (3 prensas suaves) e imediatamente pesados em uma balança eletrônica calibrada (precisão: ±0,1 mg) à temperatura ambiente (22 ± 1°C).

Todos os procedimentos foram realizados em uma bandeja de aço inoxidável pré-resfriada para minimizar a autólise. O índice de órgão foi calculado como peso do órgão (mg) dividido pelo peso corporal (g) para avaliar os efeitos do JPSXD nos órgãos principais. Porções de cada tecido foram reservadas para análise por Western blot, enquanto as amostras restantes foram fixadas em PFA de 4% para avaliação histológica subsequente.

ELISA
As concentrações séricas de TPO, EPO e GM-CSF foram medidas usando kits ELISA conforme as instruções do fabricante. Todas as etapas da centrifugação, incluindo lavagem da amostra e reconstituição do reagente, foram realizadas em temperatura ambiente a 1.000 x g por 5 minutos. As etapas de lavagem foram realizadas usando o tampão PBST (PBS contendo 0,05% Tween-20), com 300 μL de solução de lavagem adicionados por poço e repetidos 3 vezes. Após a lavagem, não restou líquido residual no fundo dos poços. Após o desenvolvimento da cor, um precipitado azul distinto era visível. A absorvância foi medida em 450 nm usando um leitor de microplacas após a reação ser interrompida.

Coloração H&E
Após a eutanásia, o timo e o fêmur foram colhidos. O timo foi pesado para calcular o índice do timo (peso do timo [mg]/peso corporal [g]). Após a pesagem, parte do timo foi usada para análise de Western blot, enquanto o restante, junto com o fêmur, foi fixado em 4% de PFA. Amostras de fêmur passaram por desidratação graduada de etanol (70%, 80%, 95% e 100% cada por 1 hora). A desidratação adequada era indicada por uma aparência uniformemente branca, sem amolecimento ou deformação. Blocos de tecido embutidos em parafina foram seccionados com espessura de 4 μm usando um micrótomo rotativo equipado com lâminas de carboneto de tungstênio de alta precisão (Tipo H31). As seções eram flutuadas em um banho-maria a 40 °C contendo solução de gelatina 0,5% para eliminar rugas, e depois montadas em lâminas de microscópio. Todas as seções apresentaram morfologia intacta, bordas lisas e translucidez uniforme sob microscopia óptica, confirmando qualidade ótima de seccionamento. Foi realizada a coloração H&E, seguida pela montagem com um meio aquosode montagem 28. Após a coloração, os núcleos apareceram azuis e o citoplasma rosa, com arquitetura celular bem definida sob observação microscópica usando um microscópio invertido. A análise histomorfológica foi realizada por software. Para cada seção corada com H&E, três campos aleatórios foram selecionados com ampliação de 200x. O software quantificava automaticamente o número de células nucleadas por unidade de área após a delimitação manual da região de interesse, e os resultados eram expressos como média ± desvio padrão (x̄ ± s).

Western blot
Tecidos de timo (50 ± 2 mg/amostra) foram homogeneizados em um tampão RIPA gelado contendo 1x coquetel inibidor de protease em uma proporção precisa de 100 mg de tecido por 1 mL de tampão, usando um homogeneizador motorizado de pilão equipado com pilões livres de RNase. A homogeneização foi realizada no gelo com 15 pulsos (1 s pulso/2 s de pausa), seguida por incubação de 30 minutos no gelo com vórtices a cada 10 minutos. O homogenado foi centrifugado a 12.000 x g por 20 minutos a 4 °C, e o sobrenadante resultante foi coletado para quantificação de proteínas. O sobrenadante parecia claro e transparente, livre de precipitados ou camadas lipídicas. A concentração de proteína foi medida usando um kit de ensaio de proteínas BCA, com uma faixa padrão de curva de 0 a 2000 μg/mL. Western blot foi realizado para avaliar os níveis de expressão de AKT1, JAK2 e EGFR no tecido timo, usando GAPDH como controle interno. Após a eletroforese e transferência de membrana, o marcador proteico (10-200 kDa) apresentou bandas claras, e as bandas-alvo alinhadas com os pesos moleculares esperados (AKT1: 60 kDa, JAK2: 130 kDa, EGFR: 170 kDa, e GAPDH: 37 kDa).

A análise densitométrica das bandas Western blot foi realizada usando software. Antes da análise, as bandas foram inspecionadas visualmente para confirmar a ausência de borrão ou difusão. O procedimento de análise incluiu: seleção manual das regiões das bandas-alvo após a importação da imagem, com detecção automática de bordas pelo software, seguida de subtração local de fundo usando regiões adjacentes às bandas para corrigir valores de cinza. Em seguida, foi feito o cálculo da razão de valores cinza entre a proteína-alvo e o controle interno para quantificação relativa. A fórmula de normalização utilizada foi:

Expressão relativa da proteína-alvo = (valor cinza da banda alvo −fundo local) / (valor cinza do controle interno −fundo local)

Imunohistoquímica
A coloração imunohistoquímica foi realizada em seções do fêmur. As fatias foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 por 10 minutos, seguidas de bloqueio por 30 minutos. Anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 °C, e anticorpos secundários foram incubados por 1 hora em temperatura ambiente. Após a coloração, sinais positivos distintos com baixo fundo e sem coloração inespecífica foram observados sob um microscópio óptico. As lâminas eram montadas usando um meio anti-descolorimento contendo DAPI, que tingia os núcleos de azul. A expressão de CD34+, TPO, EPO e GM-CSF foi então avaliada. Imagens de imunohistoquímica foram analisadas usando software digital de patologia (Versão 2.1.0). Antes da análise, as imagens foram verificadas como livres de superexposição ou degradação do sinal. O procedimentode análise 32incluiu:

Seleção do Modelo: Um modelo pré-treinado de segmentação da medula óssea (baseado em U-Net) foi usado para identificar automaticamente as regiõesteciduais 33.
Definição de Limiar: Os limiares positivos foram definidos com base no grupo controle negativo. Regiões com intensidade cromogênica superior à média de fundo em três desvios padrão foram classificadas como positivas.
Definição de ROI: O software dividiu automaticamente cada campo em regiões de grade de 500 × 500 μm e calculou o número de células positivas por unidade de área (contagem positiva de células/área do campo).
Exportação de Dados: Um relatório estatístico de densidade celular positiva foi gerado automaticamente.

Análise estatística
A análise estatística foi realizada usando o software SPSS (Versão 22.0). Os dados foram expressos como x̄ ± s. Antes das comparações entre grupos, a normalidade foi avaliada usando o teste de Shapiro-Wilk, e a homogeneidade das variâncias foi avaliada com o teste de Levene. Se tanto a distribuição normal (p > 0,05) quanto a homogeneidade de variância (p > 0,05) foram confirmadas, ANOVA unidirecional foi usada para comparações de grupos. Comparações múltiplas post hoc foram realizadas usando o método da Diferença Mínima Significativa (LSD); para controlar o erro do Tipo I, todos os valores de P post hoc foram ajustados usando a correção de Bonferroni, com p < ajustado 0,05 considerado estatisticamente significativo.

Se os dados não atendessem às suposições de normalidade ou homogeneidade da variância (p ≤0,05 em qualquer um dos testes), o teste de Kruskal-Wallis era aplicado, seguido pelo teste de Dunn para análise post hoc com correção de Bonferroni. Todos os gráficos estatísticos e visualizações foram gerados usando o GraphPad Prism (Versão 9.0). O nível de significância foi definido em α = 0,05. Todos os valores p relatados foram valores ajustados. Casos aberrantes foram identificados usando o teste de Grubbs (α = 0,05) e excluídos apenas se claramente atribuíveis ao erro experimental. Todos os dados restantes foram incluídos na análise final. Os resultados são apresentados como x̄ ± s.

Metodologia da farmacologia de redes
Este estudo utilizou uma abordagem de farmacologia em rede para explorar os potenciais mecanismos pelos quais o JPSXD alivia a mielossupressão induzida por quimioterapia. Primeiro, os constituintes químicos do JPSXD e seus alvos correspondentes foram recuperados do Banco de Dados e Plataforma de Análise de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php). Os critérios de triagem foram definidos da seguinte forma: biodisponibilidade oral (OB) ≥30% e semelhança com o medicamento (DL) ≥0,18. Para compostos não incluídos no banco de dados TCMSP, a previsão de alvos foi realizada usando a plataforma SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch/).

Para garantir que os compostos selecionados cobrissem os principais constituintes bioativos do JPSXD, foi feita referência à Farmacopeia da República Popularda China 34. Especificamente, identificamos compostos marcadores como ginsenósidos, astragalosídeo IV, icariina e ácidos salviánólicos revisando as seções de Identificação e Ensaio para cada erva. Esses compostos, comumente usados como marcadores de controlede qualidade 35, possuem estruturas químicas definidas e requisitos quantitativos. Para maior precisão, cruzamos as Notificações Gerais e Apêndices da Farmacopeia para confirmar convenções de nomenclatura e métodos analíticos (por exemplo, cromatografia líquida de alta performance, HPLC). A análise confirmou que os critérios de triagem (OB ≥30%, DL ≥0,18) capturaram efetivamente os compostos centrais da fórmula36, incluindo constituintes farmacopeicais chave como ginsenósidos Rg1 e Rb1 (do Panax ginseng), astragalosídeo IV (do Astragalus membranaceus) e icariina (do Epimedium brevicornum), indicando que os compostos selecionados são representativos e englobam os principais ingredientes ativos responsáveis pelo qi e o sangue do JPSXD efeitos.

Posteriormente, alvos gênicos associados à mielosupressão foram recuperados do banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/), e os resultados foram baixados em uma planilha. Genes com pontuação de relevância ≥44 foram selecionados para análise adicional. A interseção entre alvos de fármacos e genes relacionados à doença foi visualizada usando um diagrama de Venn, e os genes sobrepostos foram importados para o banco de dados STRING (https://string-db.org/). O organismo foi definido para humano, e as fontes de interação foram limitadas a Experimentos e Bancos de Dados com pontuação mínima exigida > 0,7. A rede de interação proteína-proteína (PPI) resultante foi então analisada quanto a características topológicas para identificar alvos centrais e visualizada usando o Cytoscape 3.10.2.

Com base nos alvos centrais identificados, análises de enriquecimento da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foram realizadas utilizando o banco de dados DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). Os parâmetros foram definidos como: contagem ≥5, pontuação EASE ≥0,05 e valor-p < 0,01. Os resultados do enriquecimento foram visualizados através da plataforma Microbiological Letter (http://www.bioinfo-cloud.org/). A análise das vias esclareceu ainda mais as principais rotas de sinalização e marcadores regulatórios envolvidos, revelando assim os potenciais mecanismos pelos quais o JPSXD mitiga a mielossupressão induzida por quimioterapia.

Resultados

Análise de farmacologia de redes
Identificação de compostos e alvos ativos
Primeiro identificamos os compostos marcadores principais de cada erva no JPSXD com base na literatura paragarantir uma seleção abrangente34. Especificamente, consultando as entradas farmacopeicais das ervas relevantes (por exemplo, Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Angelica sinensis), compilamos uma lista dos constituintes oficiais dos marcadores para todos os 15 componentes herbais da fórmula. Entre eles estão: ginsenosídeos Rg1, Re e Rb1 (do Panax ginseng); astragalosídeo IV (de Astrágalo); icariina (de Epimedium); ácido salvianoólico B (de Salvia miltiorrhiza); catalpol (de Rehmannia glutinosa); ligustilide (de Angelica sinensis); atractilenolideo (de Atractylodes macrocephala); diosgenina (de Dioscorea opposita); cuscatin (de Cuscuta chinensis); polissacarídeo de Lycium barbarum (de Lycium barbarum); nuezhenide (de Ligustrum lucidum); maltose (de malte torrado); polissacarídeo de gallus gallus (do revestimento de moela de frango assado); hesperidin (de Citrus reticulata); e coixenolido (de Coix lacryma-jobi). Todos esses compostos são claramente definidos na Farmacopeia e servem como indicadores de controle de qualidade.

Posteriormente, na triagem farmacológica de rede, usamos o banco de dados TCMSP e a plataforma SwissTargetPrediction, aplicando critérios OB ≥30% e DL ≥0,18. Ao comparar os compostos marcadores farmacopeicoicos com os resultados da triagem do banco de dados, confirmamos que todos os compostos listados atendiam aos limiares OB e DL. Por exemplo, ginsenósido Rg1 (OB = 35,2%, DL = 0,22) e astragalosídeo IV (OB = 45,1%, DL = 0,25) foram capturados com sucesso. Esse alinhamento garantiu que a triagem cobrisse de forma abrangente os principais constituintes do JPSXD e representasse com precisão o perfil farmacológico geral da fórmula. Os bancos de dados TCMSP e Swiss Target Prediction foram usados para identificar proteínas alvo associadas aos principais componentes de cada medicamento. Após a fusão e remoção de duplicados, foram obtidos 172 compostos-chave com 454 alvos. Esses dados foram visualizados usando o Cytoscape 3.10.2 (Figura 1).

Os parâmetros da topologia da rede foram analisados usando a ferramenta Network Analysis, e um diagrama de rede foi gerado com base nos valores de grau. Entre os 10 principais componentes com os maiores valores de grau estavam kaempferol, gomisina B, flavanona de alcaçuz (Licoagrocarpina), isoflavona de alcaçuz (Licoagroisoflavona), flavina de alcaçuz B (Gliasperina B), desoxiharringona, glabridina, licoisoflavanona, kanzonóis W e glicirina. Os 20 principais genes efetores classificados por valor de grau incluíram CYP19A1 (citocromo P450 19A1), NOS2 (sintase de óxido nítrico 2), CDK2 (quinase dependente de ciclina 2), ACHE (acetilcolinesterase), CDK1 (quinase dependente de ciclina 1), CHEK1 (quinase checkpoint 1), PPARD (receptor ativado por proliferador de peroxissomos δ), MAPK14 (proteína quinase ativada por mitógeno 14), SLC6A2 (membro da família de proteínas cotransportadoras de sódio/cloro 2), AURKB (aurora quinase B), EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), TNF (fator de necrose tumoral), RET (proto-oncogene RET), KDR (receptor do domínio de inserção quinase), FLT3 (receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3), TERT (transcriptase reversa da telomerase), TOP1 (topoisomerase 1), MMP2 (metaloproteinase da matriz 2), F2 (fator de coagulação II) e CYP2C19 (citocromo P450 2C19).

Identificação de genes relacionados a doenças
O banco de dados GeneCards foi usado para identificar genes-alvo associados a doenças, resultando em 286 genes. Após a desduplicação e o processamento de dados, 719 genes-alvo dos componentes de Jianpi Shengxue Tang foram integrados aos genes relacionados à doença. A rede PPI foi construída e visualizada usando o Cytoscape 3.10.2 (Figura 2).

A análise da rede de IBP revelou que os genes-chave associados aos efeitos mieorsupressores do Jianpi Shengxue Tang incluíam TP53 (proteína tumoral P53), AKT1 (proteína quinase B1), EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico), JAK2 (quinase Janus 2), IL6 (interleucina 6), TNF (fator de necrose tumoral), BCL2 (linfoma de células B 2), IL1B (interleucina 1β), MMP9 (metaloproteinase matricial 9), CDK9 (quinase dependente de ciclina 9), CDK2 (quinase dependente de ciclina 2), KDR (receptor do domínio de inserção de quinase) e IL2 (interleucina 2), entre outros.

Análise de enriquecimento de vias GO e KEGG
Os genes que se intersectam foram enviados para o banco de dados DAVID para análise de enriquecimento, abrangendo processos biológicos (BP), componentes celulares (CC) e funções moleculares (MF). Foram identificados um total de 3.197 genes relacionados à BP, 326 relacionados à CC e 197 relacionados à MF. As 10 principais vias foram visualizadas usando a Plataforma de Microbiologia (Figura 3).

A análise de enriquecimento de vias KEGG no banco de dados DAVID identificou 137 vias, sendo as 20 principais visualizadas em WBC (Figura 4). Os resultados sugerem que o Jianpi Shengxue Tang pode mitigar a mielosupressão induzida por quimioterapia por meio de múltiplas vias de sinalização, incluindo a via PI3K-AKT, a via de sinalização MAPK e a via de sinalização AGE-RAGE em complicações diabéticas. Outras vias enriquecidas incluíram infecção pelo vírus 1 da leucemia de células T humanas, hepatite B, resistência ao inibidor do receptor do fator de crescimento epidérmico e inibidor da tirosina quinase, estresse por cisalhamento de fluidos e aterosclerose, resistência a medicamentos endócrinos, metabolismo central do carbono no câncer e resistência a antifolatos.

Experimentos com animais
Contagem de leucócitos no sangue periférico em camundongos
Aos 3 dias após a administração intraperitoneal de CTX, observou-se uma redução significativa nos níveis de leucócitos do sangue periférico tanto no grupo modelo quanto no experimental em comparação com o grupo controle em branco (p < 0,01, Figura 5A). No sétimo dia pós-tratamento, o grupo de baixa dose apresentou um aumento significativo na contagem de leucócitos do sangue periférico, com diferenças significativas em relação ao grupo-modelo (p < 0,01; Figura 5B).

Níveis séricos de TPO, EPO e GM-CSF
Os níveis séricos de TPO, EPO e GM-CSF foram quantificados usando ELISA após 7 dias de administração oral. No grupo modelo, os níveis de LCR GM estavam significativamente elevados em comparação com os grupos de alta dose, média dose, controle e soro fisiológico (p < 0,05). O grupo de baixa dose apresentou um aumento perceptível nos níveis de LCR GM, embora isso não tenha alcançado significância estatística (p > 0,05; Figura 5C). O GM-CSF é um fator crítico que promove a proliferação e diferenciação das células imunológicas, afetando particularmente a função de leucócitos emacrófagos 37. Os níveis aumentados de GM-CSF no grupo modelo sugerem possível ativação do sistema imunológico, estimulando a proliferação ou secreção de células imunes. As diferenças observadas entre os grupos de alta dose e os grupos controle indicam ainda mais que os efeitos dependentes da dose nos níveis de GM-CSF são plausíveis. Isso sugere que o JPSXD pode modular o sistema imunológico para influenciar os níveis de leucócitos.

Para EPO, o grupo modelo apresentou níveis significativamente mais altos em comparação ao grupo de alta dose (p < 0,05), enquanto não foram observadas diferenças significativas entre o grupo modelo e outros grupos (p > 0,05; Figura 5D). A EPO, um regulador chave da eritropoiese38, estava elevada no grupo modelo, indicando um possível impacto na eritropoiese, especialmente no grupo de alta dose. Essa elevação pode estar associada a hipóxia, anemia ou outras alterações fisiológicas. No entanto, a falta de diferenças significativas entre outros grupos e o grupo modelo sugere que, exceto pelo grupo de alta dose, outros tratamentos tiveram efeitos mínimos nos níveis de EPO.

Os níveis de TPO não mostraram diferenças significativas entre o grupo modelo e outros grupos (p > 0,05; Figura 5E), sugerindo que o tratamento teve efeitos limitados na produção de plaquetas ou que as mudanças na TPO não foram suficientemente sensíveis para serem detectadas diferenças estatisticamente significativas em comparação com o grupo modelo.

Medição do índice de timo
Conforme apresentado na Figura Suplementar 1A, o índice de timo foi significativamente elevado nos grupos de dose, média e baixa dose, em comparação com o grupo-modelo, sendo que o grupo de dose alta apresentava o aumento mais pronunciado (p < 0,01). Esse achado sugere um aumento da função imunológica dependente da dose, especialmente no grupo de alta dose, onde o aumento do timo é indicativo de ativação do sistema imunológico. O aumento observado no índice de timo pode ser atribuído à dosagem mais alta que estimula o sistema imunológico, promovendo assim a proliferação e maturação dos timocitos. As diferenças significativas no grupo de alta dose indicam que a ativação imune é mais robusta em doses mais altas, potencialmente refletindo as propriedades farmacodinâmicas dos compostos ativos no tratamento.

Mudanças no peso corporal, função do fígado e dos rins, e índice de órgãos
O monitoramento do peso corporal revelou uma diminuição significativa no grupo modelo em comparação com o grupo em branco (p < 0,05), indicando que o CTX induziu toxicidade marcada. Em contraste, camundongos em todos os grupos de tratamento JPSXD — particularmente no grupo de alta dose — apresentaram menor perda de peso e melhora significativa em comparação ao grupo modelo (p< 0,05), sugerindo que o JPSXD pode aliviar a caquexia induzida pela quimioterapia (Figura Suplementar1 B).

Os exames de função hepática e renal mostraram níveis séricos significativamente elevados de ALT, AST, BUN e creatinina no grupo modelo (p < 0,05), indicando potencial insuficiência hepática e renal causada pelo CTX. Após o tratamento com JPSXD, especialmente no grupo de alta dose, esses parâmetros diminuíram significativamente (p < 0,05), aproximando-se dos níveis observados no grupo em branco. Isso sugere que o JPSXD exerceu efeitos protetores sobre a função hepática e renal (Figura Suplementar 1C).

A análise do índice de órgãos demonstrou uma redução significativa tanto nos índices de timo quanto no baço no grupo modelo (p < 0,05), enquanto os índices de fígado e rim permaneceram inalterados. Nos grupos de tratamento JPSXD — especialmente no grupo de alta dose — os índices de timo e baço aumentaram significativamente (p < 0,05), confirmando ainda mais o efeito protetor do JPSXD sobre órgãos imunológicos. Além disso, não foram observadas anomalias nos índices hepático e renal, descartando possível toxicidade heparrenal do JPSXD (Figura Suplementar 1D).

Expressão de p-Akt, JAK2 e EGFR no timo
A análise por Western blot e avaliações quantitativas (Figura 6A-D) revelaram níveis de expressão significativamente reduzidos de EGFR, JAK2 e p-Akt no grupo modelo em relação ao grupo controle. Dados brutos do western blot com blot em tamanho real mostrados na Figura Suplementar 2. Essa regulação negativa indica a supressão da via de sinalização PI3K-AKT em condições patológicas, o que provavelmente está associado à disfunção celular e à transdução de sinal prejudicada. Após o tratamento com JPSXD, especialmente no grupo de baixa dose, os níveis de expressão de EGFR e JAK2 foram significativamente aumentados, e o nível de fosforilação de p-Akt foi notavelmente restaurado. Esses resultados sugerem que o JPSXD pode ativar a via de sinalização PI3K-AKT ao aumentar reguladores a montante, como EGFR e JAK2, restaurando assim a transdução normal do sinal. A via PI3K-AKT é fundamental na mediação da sobrevivência celular, proliferação e inibição da apoptose. Assim, o JPSXD pode aumentar a sobrevivência celular, reduzir a apoptose sob condições patológicas e promover a recuperação da função hematopoiética ao modular essa via. Ao direcionar a via PI3K-AKT, o JPSXD demonstra potencial terapêutico para aliviar condições patológicas associadas à sua disfunção, destacando sua ampla aplicabilidade clínica.

Exame histológico dos fêmures de camundongo
Após um período de tratamento de 7 dias, amostras de fêmur foram coletadas de camundongos, fixadas em formaldeído a 4% e processadas de acordo com protocolos histopatológicos padrão para seccionamento, coloração e montagem. O exame morfológico do fêmur revelou infiltração significativa de células adiposas na medula óssea do modelo e dos grupossalinos 41,42, com vacúolos proeminentes observados (Figura 7). Em contraste, não foram detectadas vacúolas significativas na medula óssea do fémur dos grupos de tratamento de dosagem alta, média e baixa, sugerindo que o tratamento reverteu efetivamente essa mudança patológica. Esse fenômeno provavelmente está associado à mielosupressão, que pode induzir proliferação anormal de adipócitos na medula óssea, prejudicando assim a função hematopoiética normal.

Para a contagem de células nucleadas na medula óssea do femoral, os resultados foram analisados com base no número de células nucleadas por unidade de área (Figura 8). O JPSXD melhorou significativamente a mielossupressão induzida por CTX. Comparado ao grupo-modelo, os grupos de alta e média dose apresentaram um aumento significativo na contagem de células nucleadas, com o grupo de alta dose alcançando a maior contagem (3.130 células). Isso indica que o JPSXD promove a recuperação das células da medula óssea, com eficácia terapêutica potencialmente correlacionada com a dosagem. No entanto, outros grupos não se recuperaram totalmente aos níveis observados no grupo controle em branco, sugerindo que doses maiores ou períodos de tratamento prolongados podem ser necessários para alcançar a recuperação ideal.

Análise de áreas positivas para CD34+, TPO, EPO e GM-CSF em fêmures de camundongos
Na análise de coloração por imunofluorescência em fêmures de camundongo, o tratamento com CTX reduziu significativamente o número de células CD34+ positivas, que estão intimamente associadas à vascularização e à função das células endoteliais (Figura 9A). Comparado ao grupo em branco, as células CD34+ positivas foram notavelmente reduzidas no grupo CTX (p< 0,01; Figura 9B). No entanto, o tratamento com JPSXD reverteu significativamente esse efeito, especialmente no grupo de alta dose, onde o rebote das áreas CD34+ positivas foi significativamente maior do que no grupo modelo e soro fisiológico (p< 0,01; Figura 9B). Isso sugere que o JPSXD pode promover a neovascularização ao aumentar a proliferação e migração das células endoteliais.

Quanto à expressão de EPO, a densidade de células EPO-positivas foi significativamente reduzida no grupo modelo (p < 0,01), enquanto o tratamento JPSXD em doses altas e médias restaurou significativamente os níveis de expressão de EPO (Figura 9C). A análise quantitativa (Figura 9D) revelou que a área EPO-positiva no grupo de alta dose aumentou aproximadamente 2,5 vezes em comparação com o grupo modelo (p< 0,01), apresentando uma tendência dependente da dose. Esses achados indicam que o JPSXD estimula efetivamente a secreção de EPO, facilitando assim a recuperação da função hematopoiética eritróide.

Quanto à expressão de TPO, a intensidade dos sinais positivos para TPO foi significativamente reduzida no grupo modelo (p< 0,01), enquanto os grupos tratados com JPSXD — particularmente o grupo de alta dose — apresentaram aumento significativo na expressão de TPO (Figura 10A). Resultados quantitativos (Figura 10B) demonstraram que o número de células TPO-positivas no grupo de alta dose foi aproximadamente três vezes maior do que no grupo modelo (p< 0,01), sugerindo que o JPSXD pode promover a diferenciação de megacariócitos e a produção de plaquetas ao aumentar a expressão da TPO.

Além disso, a expressão de TPO e EPO foi significativamente reduzida no grupo modelo, mas intervenções de dose alta e média com JPSXD aumentaram significativamente a expressão desses fatores de forma dependente da dose (p< 0,01; Figura 9D, Figura 10B). Isso sugere que o JPSXD pode restaurar efetivamente os fatores hematopoiéticos e estimular a hematopoiese da medula óssea.

Para o GM-CSF, embora a proporção de células positivas tenha diminuído no grupo-modelo, a densidade de células positivas aumentou, potencialmente devido a uma resposta inflamatória. Tratamentos de dose alta e média de JPSXD significativamente elevada na expressão do GM-CSF (p< 0,01; Figura 10D), com o efeito mais pronunciado observado no grupo de dose média.

Disponibilidade de dados:
Os conjuntos de dados gerados durante este estudo estão totalmente disponíveis no artigo e nos arquivos suplementares.

Figura 1
Figura 1: Rede ativa composta-alvo do JPSXD. Uma rede visual de compostos ativos e seus potenciais alvos no JPSXD foi construída usando o Cytoscape 3.10.2. Nós quadrados verdes representam genes-alvo, enquanto os nós circulares externos em cores diferentes representam compostos ativos derivados de diferentes ervas. Arestas entre nós indicam interações entre compostos e seus respectivos alvos. Os dados da rede foram integrados do banco de dados TCMSP e da plataforma suíça de Previsão de Alvos, compreendendo um total de 172 compostos ativos e 454 alvos potenciais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2
Figura 2: Rede de IBP de alvos JPSXD relacionados à mielossupressão. A interseção entre os potenciais alvos do JPSXD e genes relacionados à doença foi visualizada usando o Cytoscape 3.10.2. Os dados de rede eram obtidos do banco de dados GeneCards e processados por integração e desduplicação. Cada nó representa um alvo proteico, e as arestas indicam IBPs. A intensidade de cor dos nós corresponde ao seu valor de grau, com cores mais escuras indicando maior conectividade. Os dados PPI foram obtidos do banco de dados STRING com um limite de pontuação de confiança definido em 0,7. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3
Figura 3: Análise de enriquecimento GO dos genes-alvo afetados pelo JPSXD. Os genes sobrepostos identificados a partir da triagem foram submetidos ao banco de dados DAVID (versão 6.8) para análise de enriquecimento GO, abrangendo três categorias: processos biológicos (BP), componentes celulares (CC) e funções moleculares (MF). Os 10 termos mais significativamente enriquecidos (p< 0,05) de cada categoria foram selecionados e visualizados usando o software Microbiology Platform. As barras verde, laranja e azul representam as categorias BP, CC e MF, respectivamente. O eixo x denota os termos GO, e o eixo y representa a pontuação de enriquecimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4
Figura 4: Análise de enriquecimento da via KEGG de genes-alvo afetados pelo JPSXD. Genes sobrepostos foram submetidos ao banco de dados DAVID para análise de enriquecimento de vias KEGG. As 20 principais vias com maior significância (p< 0,05) foram selecionadas e visualizadas usando software de glóbulos brancos. A cor da bolha indica o nível de significância estatística, com um gradiente de verde para vermelho representando valores P decrescentes. O tamanho da bolha corresponde ao número de genes envolvidos em cada via. O eixo x mostra a razão de enriquecimento (fator rico), e o eixo y lista os nomes dos caminhos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5
Figura 5: Efeitos do JPSXD nos níveis de GM-CSF, EPO e TPO em camundongos. (A) Comparação das contagens de leucócitos sanguíneos periféricos entre grupos no terceiro dia após a injeção de ciclofosfamida. (B) Comparação das contagens de leucócitos do sangue periférico entre grupos após 7 dias consecutivos de administração intragástrica. (C) Comparação das concentrações séricas de fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) entre grupos. (D) Comparação das concentrações séricas de eritropoietina (EPO) entre grupos. (E) Comparação das concentrações séricas de trombopoietina (TPO) entre grupos. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 10). Comparações de grupos foram realizadas usando ANOVA unidirecional, seguidas pelo teste post hoc de LSD. *p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001 indicam diferenças estatisticamente significativas em relação ao grupo modelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6
Figura 6: Efeitos do JPSXD nos níveis de expressão das proteínas EGFR, JAK2 e p-Akt no tecido do timo do camundongo. (A) Níveis relativos de expressão do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). (B) Níveis relativos de expressão da Janus quinase 2 (JAK2). (C) Níveis relativos de expressão da proteína quinase B fosforilada (p-Akt). (D) Bandas representativas de blot ocidental do JAK2, EGFR e p-Akt, com o GAPDH como controle interno. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 6). Comparações de grupos foram realizadas usando ANOVA unidirecional, seguidas pelo teste post hoc de LSD. p < 0,0001 indicam diferenças estatisticamente significativas em comparação com o grupo modelo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7
Figura 7: Imagens representativas de coloração H&E do tecido da medula óssea do fémur em camundongos de diferentes grupos. Estão apresentadas seções histológicas da medula óssea do fémur dos grupos controle, modelo, NS e JPSXD de dose alta (H), média (M) e baixa (L). Os grupos modelo e NS apresentaram infiltração proeminente de adipócitos (indicada por setas) e degeneração vacuolar, enquanto a formação de vacúola foi significativamente reduzida em todos os grupos tratados com JPSXD. Tamanho da amostra: n = 10. Barra da escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8
Figura 8: Efeitos do JPSXD no número de células nucleadas na medula óssea femoral de camundongos com mielosupressão induzida por CTX. A análise quantitativa de seções coloridas com H&E foi realizada usando software de análise de imagem para determinar o número de células nucleadas por unidade de área na medula óssea femoral de camundongos em diferentes grupos. Os dados são apresentados como x̄ ± s (n = 10). A ANOVA unidirecional foi usada para comparações entre grupos, seguida pelo teste post hoc de LSD. "", "" e "***" denotam diferenças estatisticamente significativas em comparação com o grupo modelo em p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 9
Figura 9: Análise imunohistoquímica da expressão CD34+ e EPO no fêmur de camundongos tratados com JPSXD. (A-B) Resultados de imunocoloração de regiões CD34-positivas (verde) e análise quantitativa da contagem celular positiva por unidade de área. (C-D) Resultados de imunocoloração em regiões positivas para eritropoietina (EPO) (vermelho) e análise quantitativa da contagem celular positiva por unidade de área. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (n = 6). Comparações de grupos foram realizadas usando ANOVA unidirecional, seguidas pelo teste post hoc de LSD. "", "" e "***" indicam diferenças estatisticamente significativas em comparação com o grupo modelo em p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 10
Figura 10: Análise imunohistoquímica da expressão de TPO e GM-CSF no fêmur de camundongos tratados com JPSXD. (A-B) Coloração por imunofluorescência de regiões positivas para trombopoietina (TPO) (vermelho) e análise quantitativa da contagem celular positiva por unidade de área. (C-D) Coloração por imunofluorescência de regiões positivas ao fator estimulante de colônia de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) (verde) e análise quantitativa das contagens celulares positivas por unidade de área. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (n = 6). Comparações de grupos foram realizadas usando ANOVA unidirecional, seguidas pelo teste post hoc de LSD. "**" e "****" indicam diferenças estatisticamente significativas em comparação com o grupo modelo em p < 0,01, p < 0,0001, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 11
Figura 11: Ilustração esquemática do mecanismo proposto pelo qual o JPSXD alivia a mielossupressão induzida por CTX. O JPSXD aprimora a função hematopoiética ao aumentar citocinas hematopoiéticas, como EPO, TPO e GM-CSF, ativando a via de sinalização EGFR/JAK2-PI3K/AKT e promovendo a fosforilação do AKT. Esses efeitos melhoram o índice do timo, restauram a morfologia da medula óssea e aumentam as populações de HSC CD34⁺, aliviando assim a supressão da medula óssea. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Efeitos do JPSXD sobre peso corporal, índice do timo e função hepatorrenal em camundongos imunossuprimidos induzidos por ciclofosfémida. (A) Índice de timo: peso corporal e peso do timo foram medidos ao final do experimento, e o índice de timo foi calculado como peso do timo/peso corporal (mg/g), n = 10. (B) Mudanças no peso corporal: o peso corporal foi registrado a cada 3 dias durante a administração, dados expressos como média ± DS (n = 10). (C) Função hepática e renal: após a eutanásia, o soro foi coletado para medição de ALT, AST, BUN e creatinina (Cre) usando um analisador bioquímico, n = 10. (D) Índices de órgãos: timo, baço, fígado e rins foram pesados, e índices correspondentes dos órgãos (peso do órgão/peso corporal, mg/g) foram calculados, n = 10. "", "" e "***" na figura indicam diferenças estatisticamente significativas em comparação com o grupo de modelos em p < 0,01, p < 0,001, p < 0,0001, respectivamente. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 2: Manchas ocidentais em tamanho real e cru. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Herb (nome latino / chinês)Principais Efeitos Farmacológicos
Ginseng (Ren shen) 61, 62Aumento da hematopoiese e imunomodulação
Astrágalo (Huang Qi) 63, 64Promover hematopoiese e aprimoramento imunológico
Epimédium (Yin Yang Huo) 65-67Melhorar a microcirculação, antioxidantes e imunomodulação
Atractylodes macrocephala (Bai Zhu) 68, 69Imunomodulação, fortalecimento do baço e reposição do qi (embora as evidências farmacológicas ainda sejam limitadas)
Inhame Chinês (Shan Yao) 70Antioxidante (embora as evidências farmacológicas ainda sejam limitadas)
Salvia miltiorrhiza (Dan Shen) 71-73Ativar o sangue e resolver a estase, melhorar a microcirculação, antioxidante
Rehmannia glutinosa (preparado) (Shu Di Huang) 74, 75Nutre sangue e yin, promove a hematopoiese
Cuscuta chinensis (Tu Si Zi) 76Hepatoprotetor, renoprotetor, antiosteoporótico, antioxidante, antienvelhecimento, antimutâgico, antidepressivo, melhora da função sexual, efeitos abortivos, etc.
Goji Berry (Lycium barbarum, Gou Qi Zi) 77-79Imunomodulação, antioxidantes, proteção hematopoiética
Ligustrum lucidum (Nv Zhen Zi) 80, 81Imunomodulação, anti-inflamatório
Angelica sinensis (Dang Gui) 82-84Enriquece o sangue e ativa a circulação sanguínea, antioxidante, aumenta a hematopoiese
Malte frito (Chao Mai Ya)Promover a digestão e fortalecer o baço (uso tradicional, embora as evidências farmacológicas ainda sejam limitadas)
Endólio Gallus gallus frito (Chao Ji Nei Jin)Promover a digestão e fortalecer o estômago (uso tradicional, embora as evidências farmacológicas ainda sejam limitadas)
Casca de Tangerine (Chen Pi) 85-87Antioxidante, imunomodulação, anti-inflamatório
Semente Coix (Yi Yi Ren) 88-90Remover a umidade e fortalecer o baço, antioxidantes, imunomodulação

Tabela 1: Efeitos farmacológicos das ervas na decocção fortalecedora do baço e geradora de sangue (JPSXD). Resumo das principais ações farmacológicas de cada erva incluída no JPSXD, com base em estudos publicados. Esses efeitos envolvem principalmente a promoção hematopoiética, imunomodulação e antioxidação.

Discussão

Em meio ao aumento da incidência global de câncer, a comunidade médica enfrenta dois desafios: não apenas o tratamento do câncer em si, mas também o manejo dos efeitos colaterais associados, entre os quais a mielosupressão é uma reação adversa particularmente comume grave 43. Este estudo investigou sistematicamente o papel e os potenciais mecanismos do JPSXD no alívio da mielosupressão induzida por CTX em camundongos, empregando uma combinação de farmacologia em rede e experimentos com animais. Os resultados sugerem que o JPSXD pode melhorar os sintomas da mielosupressão por meio de um mecanismo regulador multi-alvo e múltiplas vias, destacando as vantagens únicas da MTC em aproveitar múltiplos componentes e alvos.

A análise farmacológica em redes identificou compostos-chave no JPSXD, incluindo kaempferol, Gomisin B, Licoagrocarpin e Licoagroisoflavona. Esses compostos demonstraram uma variedade de atividades farmacológicas em estudos anteriores, incluindo efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes ehematopoiéticos 44,45,46, tornando-os candidatos promissores para validação experimental adicional no tratamento da mielosupressão. Esses compostos representam candidatos promissores para validação experimental adicional. Dada a complexidade damielosupressão 47, os efeitos sinérgicos desses compostos bioativos, quando atuando em múltiplos alvos, podem oferecer uma abordagem multifacetada para mitigar a condição. Um diagrama da rede PPI, combinado com análises de vias GO e KEGG, destacou alvos e vias principais associadas à mielospressão. Notavelmente, p-Akt, JAK2 e EGFR emergiram como alvos cruciais, com a via de sinalização PI3K-AKT identificada como um regulador significativo. Estudos demonstraram que a via de sinalização PI3K-AKT desempenha um papel vital na manutenção da proliferação e sobrevivência das células-tronco hematopoéticas (HSCs)48,49. Essa via regula proteínas antiapoptóticas e pró-apoptóticas chave, como a regulação para cima de Bcl-2 (uma proteína antiapoptótica) e a regulação para baixo de Bax (uma proteína pró-apoptótica). Ao equilibrar essas proteínas, a via PI3K-AKT pode proteger as células hematopoéticas do estresse oxidativo e dos danos induzidos pela quimioterapia, promovendo, em última análise, a recuperação hematopoiética50. A ligação do EGF ao EGFR desencadeia a autofosforilação dos receptores, recruta PI3K e ativa o Akt, enquanto a ativação do JAK estimula ainda mais a via PI3K-AKT51. Neste estudo, aumentos significativos nos níveis de p-Akt, JAK2 e EGFR foram detectados no timo de camundongos tratados com JPSXD, indicando ativação da via PI3K-AKT. Isso sugere que o tratamento pode corrigir a mielosupressão por meio dessa via de sinalização.

Fatores hematopoiéticos-chave, incluindo TPO, EPO e GM-CSF, regulam a função da medula óssea e desempenham papéis fundamentais na recuperação da supressão da medula52. A TPO, secretada principalmente pelo fígado e rins, estimula a diferenciação e maturação dos megacariócitos, promovendo a produção de plaquetas enquanto mantém a homeostase doHSC 53. A EPO, secretada pelos rins, promove a proliferação e diferenciação das células progenitoras eritroides por meio da via de sinalização JAK2/STAT5, que é fundamental para corrigir a anemia54. O GG-CSF, secretado por células endoteliais e T, induz a diferenciação do HSC em granulócitos e monócitos, aumenta a atividade fagocítica e acelera a recuperação dos glóbulos brancos, reduzindo assim os riscos deinfecção 55. Em nosso experimento, níveis elevados de TPO, EPO e GM-CSF foram observados em seções séricas e fêmures de camundongos tratados com JPSXD, sugerindo que a melhora da função hematopoética do tratamento está intimamente ligada ao aumento da secreção desses fatores reguladores. Notavelmente, o índice tímico no grupo tratado com JPSXD também mostrou um aumento significativo, reforçando ainda mais a hipótese de que o JPSXD potencializa a função imunológica. A ativação da via de sinalização PI3K-Akt, juntamente com o aumento do índice tímico, sugere que o JPSXD pode promover a sobrevivência, proliferação e diferenciação dos timocitos, que desempenham um papel crucial na restauração e aprimoramento da funçãoimunológica 56. Esses resultados experimentais indicam fortemente que o JPSXD tem potenciais efeitos terapêuticos na imunossupressão induzida por quimioterapia, regulando moléculas sinalizadoras chave, especialmente no aprimoramento da função tímica e da atividade das células imunológicas. Isso fornece uma base científica sólida para sua aplicação clínica na melhoria da recuperação imune durante aquimioterapia 57.

A análise histológica revelou danos estruturais significativos à medula óssea no grupo-modelo, incluindo arranjo celular desorganizado, redução da densidade celular, aumento dos vacúolos de adipócitos e diminuição das células nucleadas. Essas mudanças indicaram uma supressão da função hematopoiética e perturbação do microambiente hematopoiético, o que, por sua vez, afetava a geração normal de células sanguíneas. Especificamente, o aumento dos vacúolos de adipócitos está frequentemente associado ao agravamento da adiposição da medula óssea, o que pode dificultar ainda mais a proliferação e diferenciação dosHSCs 58. Estudos mostraram que a adiposição da medula óssea está intimamente ligada à função hematopoiética comprometida, pois os adipócitos podem secretar fatores que inibem a atividade do HSC e alteram o nicho da medulaóssea 59.

O tratamento com JPSXD resultou em melhorias significativas nessas alterações patológicas. O tratamento com JPSXD restaurou a estrutura normal da medula óssea, reduziu a formação de vacúolos de adipócitos e aumentou notavelmente a proporção de células nucleadas. Isso sugere que o JPSXD não apenas melhorou o microambiente da medula óssea, mas também promoveu efetivamente a sobrevivência e proliferação dos HSCs, auxiliando assim na restauração da função hematopoiética normal. A capacidade do JPSXD de modular o microambiente da medula óssea pode ser atribuída às suas propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, que demonstraram mitigar danos induzidos pela quimioterapia e apoiar a recuperação hematopoiética60.

Em conclusão, os efeitos benéficos do JPSXD na estrutura da medula óssea não são apenas evidentes pelas alterações histológicas, mas também refletem seu papel regulador abrangente no microambiente hematopoiético da medula óssea, pois repara danos na medula óssea e melhora a disposição celular. Neste experimento, avaliamos o timo de camundongos para os níveis de proteína p-Akt, JAK2 e EGFR, e descobrimos que essas proteínas estavam significativamente elevadas nos camundongos tratados com JPSXD em comparação com o grupo modelo. Isso sugere que a via de sinalização PI3K-Akt foi ativada. A ativação dessas vias pode promover a sobrevivência, proliferação e diferenciação dos timocitos, que contribuem para a restauração e aprimoramento da função imunológica. Os dados experimentais indicam fortemente que o JPSXD tem potenciais efeitos terapêuticos na imunossupressão induzida pela quimioterapia, regulando moléculas sinalizadoras chave, especialmente no aprimoramento da função tímica e da atividade das células imunes, fornecendo assim uma base científica sólida para sua aplicação clínica. Restaurando a proporção de células nucleadas, o JPSXD tem potencial como um agente terapêutico eficaz para doenças relacionadas à supressão da medula óssea, especialmente no tratamento de danos à medula óssea induzidos pela quimioterapia e outras disfunções hematopoiéticas. Além disso, são necessários estudos adicionais para elucidar os mecanismos moleculares específicos subjacentes aos efeitos protetores do JPSXD. Por exemplo, a análise citométrica de fluxo de células LSK da medula óssea (Lin⁻Sca-1⁺c-Kit⁺) e proteínas relacionadas à apoptose a jusante (como Bcl-2, Bax e Caspase-3) pode fornecer insights mais profundos sobre seu mecanismo de ação. A validação clínica também é necessária para confirmar sua eficácia e segurança, estabelecendo assim as bases para uma aplicação clínica mais ampla.

Apesar desses resultados promissores, este estudo apresenta limitações. Primeiro, este estudo foi um experimento pré-clínico com animais, e suas conclusões exigem validação adicional por meio de ensaios clínicos subsequentes. Segundo, o desenho experimental não incluiu agentes potenciadores de leucócitos usados clinicamente, como o G-CSF humano recombinante, como controle positivo. Essa limitação restringe nossa capacidade de avaliar diretamente a eficácia do JPSXD em relação às terapias padrão. No entanto, é importante enfatizar que o objetivo principal deste estudo foi elucidar, pela primeira vez, as vias potenciais de sinalização — como PI3K-AKT — pelas quais o JPSXD mitiga a mielosupressão, com base em farmacologia em redes e validação experimental, em vez de realizar uma análise comparativa de eficácia. Atualmente, dados clínicos de alta qualidade sobre o uso do JPSXD para mielosupressão induzida por quimioterapia são insuficientes, o que ressalta a necessidade deste estudo e destaca que seu valor translacional clínico ainda precisa ser confirmado. Terceiro, os bancos de dados genéticos atuais que ligam medicamentos e doenças permanecem incompletos. Este estudo baseou-se principalmente no banco de dados GeneCards para identificar alvos relacionados a doenças. Embora alvos de alta confiança tenham sido selecionados usando um limiar de pontuação de relevância, confiar em um único banco de dados pode não capturar de forma abrangente todos os alvos terapêuticos potenciais, limitando assim a completude e a precisão da análise farmacológica em rede e da identificação de vias. Pesquisas futuras devem integrar múltiplos bancos de dados especializados — como DisGeNET, OMIM e TTD — para aproveitar suas forças complementares para identificação e validação de alvos, melhorando assim a cobertura e a confiabilidade do conjunto de dados alvo. Além disso, mais pesquisas são necessárias para identificar os compostos bioativos específicos dentro do JPSXD e elucidar seus mecanismos de ação. Estudos futuros devem incorporar tanto ensaios in vitro quanto ensaios clínicos para fundamentar esses achados. No entanto, os resultados atuais fornecem evidências experimentais preliminares valiosas que apoiam o potencial do JPSXD como candidato terapêutico para a mielosupressão induzida por quimioterapia.

Conclusão
Nossos achados demonstram que o JPSXD melhora a mielosupressão induzida por quimioterapia por meio da modulação da via de sinalização PI3K-AKT (Figura 11). Esses resultados posicionam o JPSXD como uma terapia adjuvante promissora para a mielossupressão induzida por CTX, com potencial para aplicação clínica mais ampla na mitigação dos efeitos adversos associados à quimioterapia.

Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Essa pesquisa foi financiada pelo projeto Integral Western and Traditional Chinese Medicine Focus-DCA Mode Intervention for Preventing Postoperae Infections in Elderly Patients with Gastrointestinal Malignities, com o número de projeto A2023053, financiado pela Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Hunan.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% Paraformaldeído (PFA)Sigma-AldrichP6148
AKT (panela) Coelho mAbTecnologia de Sinalização Celular#4691
Lavadora Automática de MicroplacasBioTek (Agilent)ELx405
Analisador Autohematológico BC-2800vetMindrayBC-2800vet
Microtomo de crióstatoThermo Fisher ScientificCryoStar NX50
Injeção de ciclofosfamidaBaxter Oncology GmbHN/A (Lote: HJ20160467)
Microscópio E100NikonE100
Anticorpo EGFR (A-10)Santa Cruz BiotecnologiaSC-373746
Máquina de EmbeddingLeicaEG1150
EPO (Mouse) ELISA KitR& Sistemas DMEP00B
Anticorpo Policlonal GAPDH RabbitProteintech10494-1-AP
GM-CSF (Mouse) ELISA KitR& Sistemas DMMC00B
Cabra Anti-Coelho IgG HRP-conjugadoJackson ImmunoResearch111-035-003
H& Kit de Coloração ESigma-AldrichHT10
Centrífuga Refrigerada de Alta VelocidadeThermo Fisher ScientificSorvall ST 16R
Moedora de tecidos de alta capacidadeServicebioKZ-II
Caneta de ImunohistoquímicaLaboratórios VectorH-4000
JAK2 Rabbit mAbAbcamab108596
Decocção Jianpi Shengxue (JPSXD)Farmácia do Hospital de Câncer de HunanFormulação personalizada
Leitor de MicroplacasBioTek (Agilent)Sinergia H1
Soro fisiológico normalBaxter2B1324X
Microtomo RotativoLeicaRM2016
Processador de tecidosLeicaASP300S
TPO (Mouse) ELISA KitR& Sistemas DMTP00B
Misturador de vórticesServicebioMX-F

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