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Artigo de investigação

Mecanismo da Decocção Jianpi Shengxue no alívio da mielosupressão induzida por ciclofosfamida em camundongos

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DOI:

10.3791/69542

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2 de janeiro de 2026

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1Hunan University of Chinese Medicine, 2Department of Traditional Chinese Medicine /Integrative Oncology, Hunan Cancer Hospital/The Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo elucida sistematicamente como a decocção Jianpi Shengxue mitiga a mielosupressão induzida por ciclofosfamida por meio de uma abordagem integrada de farmacologia em rede e experimentos em animais, revelando seus mecanismos multi-alvo e potencial como terapia adjuvante.

Resumo

O artigo tem como objetivo investigar como a Decocção Jianpi Shengxue (JPSXD) alivia a mielossupressão induzida pela quimioterapia por meio de farmacologia em rede e experimentos com animais. Para isso, componentes-chave e alvos foram analisados, e a Rede de Interação Proteína-Proteína (PPI) e redes erva-componente-alvo foram construídas. A Gene Ontology (GO) e o enriquecimento da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) identificaram as principais vias. Um modelo de miossupressão induzido por ciclofosfamida (CTX) foi estabelecido em 60 camundongos C57/BL6. O JPSXD foi administrado em doses diferentes por 7 dias. Foram avaliados hemogramas periféricos, citocinas (trombopoietina [TPO], eritropoietina [EPO], fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos [GM-CSF]), índice do timo, morfologia da medula óssea, células CD34+ e expressão de AKT1, JAK2 e EGFR. A análise de rede identificou 172 compostos e 454 alvos, destacando as vias PI3K-Akt e JAK-STAT. In vivo, CTX reduziu os níveis de leucócitos e proteínas sinalizadoras, enquanto o JPSXD restaurou as contagens, aumentou o AKT1, JAK2 e EGFR, e melhorou o índice do timo (p < 0,05). JPSXD em doses médias e altas aumentaram TPO, EPO, GM-CSF, CD34+ e melhoraram a estrutura da medula óssea, sendo a dose alta o que mostrou o efeito mais forte. De forma conclusiva, o JPSXD alivia a mielosupressão por meio da regulação multi-alvo e múltiplas vias, apoiando seu potencial como terapia auxiliar para leucopenia induzida pela quimioterapia.

Introdução

A quimioterapia é uma pedra angular no tratamento de várias malignidades, principalmente inibindo a proliferação e a sobrevivência das célulascancerígenas 1,2, ampliando assim a sobrevivência do paciente. No entanto, devido à falta de seletividade no direcionamento dos tecidos normais, os medicamentos quimioterápicos frequentemente causam danos graves a células e tecidos saudáveis, levando a uma série de efeitosadversos 3. Um dos efeitos colaterais mais comuns e graves da quimioterapia é a mielosupressão, caracterizada pela redução da produção de glóbulos sanguíneos, incluindo glóbulos brancos (glóbulos brancos), glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos) e plaquetas (PLTs)2,4. A mielossupressão prejudica gravemente o sistema de defesa imunológica, aumentando o risco de infecções, sangramentos, anemia e outras complicações. Também diminui significativamente a qualidade de vida dos pacientes e pode até ser potencialmente fatal5. Assim, aliviar e prevenir a mielosupressão induzida pela quimioterapia é fundamental para melhorar a tolerância dos pacientes à quimioterapia e a sobrevivência geral.

Os tratamentos clínicos atuais para mielosupressão envolvem principalmente fatores de crescimento hematopoiéticos, como fator estimulante de colônias de granulócitos [G-CSF], eritropoietina [EPO]) e terapiatransfusional 6,7. No entanto, essas abordagens frequentemente estão associadas a altos custos, potenciais efeitos colaterais e eficácia limitada. Como resultado, explorar métodos mais seguros e eficazes para prevenir e aliviar a mielosupressão continua sendo um foco principal de pesquisa. Nos últimos anos, a medicina tradicional chinesa (MTC) tem recebido grande atenção por seu papel no tratamento do câncer e no manejo dos efeitos colaterais induzidos pelaquimioterapia 8,9. Acredita-se que muitas formulações de MTC tenham efeitos tonificantes e reguladores do sistema imunológico, como a decocção 10 de Shengxuebao,comprimidos 11 de Dihuang Shengbai e compostos de ginsenósídeos12, que não apenas protegem as células normais e reduzem efeitos colaterais tóxicos, mas também aumentam a eficácia antitumoral.

A Decocção Jianpi Shengxue (JPSXD) é uma fórmula clássica da MTC que exemplifica os princípios terapêuticos de tonificação do Qi e nutriçãodo sangue 13. Esta fórmula é uma modificação sofisticada da Decocção Sijunzi combinada com Er Zhi Wan, integrando os efeitos sinérgicos de múltiplas ervas para tratar a deficiência de Qi esangue 14. A fórmula consiste em ginseng (Ren Shen), astrágalo (Huang Qi), epimedium (Yin Yang Huo), atractylodes (Bai Zhu), inhame (Shan Yao), sálvia (Dan Shen), rehmannia preparada (Shu Di Huang), semente de dodder (Tu Si Zi), loba (Gou Qi Zi), ligustrum (Nv Zhen Zi), angélica (Dang Gui), cevada frita (Chao Mai Ya), moela de frango frito (Chao Ji Nei Jin), casca de tangerina seca (Chen Pi), semente de coix (Yi Yi Ren) e várias outras ervas. Cada erva desempenha um papel específico na fórmula, seguindo o princípio da MTC de ervas soberanas, ministras, assistentes e guias, o que garante um efeito terapêutico equilibrado e direcionado.

A Decocção Sijunzi, uma fórmula fundamental na MTC, é renomada por sua capacidade de tonificar o Qi e fortalecer o baço. Tem sido amplamente utilizado para tratar condições associadas à deficiência de Qi e sangue, como fadiga, apetite fraco e imunidade enfraquecida. Estudos farmacológicos modernos demonstraram que a Decocção Sijunzi melhora a função imunológica, promove a hematopoiese e melhora a capacidade de autorreparação docorpo 15,16. Com base nessa base, o JPSXD incorpora ervas adicionais para aumentar ainda mais sua eficácia na nutrição do sangue e tratar deficiências mais complexas. Por exemplo, rehmannia preparada e angélica são ervas essenciais que nutrem o sangue17, enquanto astrágalo e ginseng atuam sinergicamente para aumentar o Qi e melhorar a vitalidadegeral 18.

Estudos recentes destacaram os potenciais efeitos antitumorais do JPSXD, sugerindo que sua abordagem multicomponente e multi-alvo pode inibir o crescimento tumoral e aumentar a eficácia dos tratamentos convencionais contrao câncer 19,20. A capacidade da fórmula de modular respostas imunes e melhorar a função hematopoiética a torna particularmente valiosa no apoio a pacientes que estão passando por quimioterapia ou radioterapia, que frequentemente apresentam deficiência de Qi e sangue como efeito colateral dotratamento 21. Além disso, a inclusão de ervas como sálvia e epimédio demonstrou melhorar a microcirculação e aprimorar os mecanismos de reparação celular, contribuindo para os benefícios terapêuticos gerais dafórmula 22.

Estudos farmacológicos modernos demonstraram que cada erva individual no JPSXD possui atividades farmacológicas relacionadas à função hematopoética, anti-mielossupressão, imunomodulação e antioxidação, bem como melhora microcirculatória, fornecendo suporte indireto à pesquisa para o uso do JPSXD no alívio da mielossupressão induzida por quimioterapia. A Tabela 1 resume os principais efeitos farmacológicos de cada erva juntamente com as referências correspondentes, com foco em estudos que investigam hematopoiese, atividade antimielossupressora, imunomodulação e propriedades antioxidantes ou de microcirculação. A sinergia complexa dos componentes no JPSXD envolve tanto interações cooperativas quanto antagônicas entre as ervas, visando múltiplas vias para alcançar um efeito terapêutico holístico. Por exemplo, enquanto ginseng e astrágalo trabalham juntos para tonificar o Qi, a sálvia e a rehmannia preparada colaboram para nutrir o sangue e melhorar a circulação. Ao mesmo tempo, ervas como casca de tangerina seca e cevada frita ajudam a regular a digestão e a prevenção da estagnação, garantindo que os efeitos tonificantes da fórmula sejam absorvidos e utilizados de forma eficaz pelocorpo. Essa abordagem multifacetada está alinhada com a filosofia da MTC de tratar a causa raiz da doença enquanto aborda seus sintomas.

Em conclusão, o JPSXD é uma fórmula de MTC bem equilibrada e cientificamente apoiada que incorpora os princípios do Qi e da desintoxicação sanguínea. Suas aplicações potenciais para fortalecer a imunidade, promover a hematopoiese e apoiar a terapia antitumoral fazem dele uma adição valiosa tanto às práticas médicas tradicionais quanto modernas. No entanto, ainda faltam evidências clínicas de alta qualidade que avaliem diretamente a eficácia do JPSXD no alívio da mielosupressão induzida por quimioterapia. Mais pesquisas são necessárias para elucidar seus mecanismos subjacentes e otimizar suas estratégias de aplicação clínica. Portanto, este estudo tem como objetivo fornecer prova de conceito para os potenciais efeitos terapêuticos do JPSXD sob uma perspectiva mecanicista pré-clínica.

A farmacologia de rede, com sua natureza sistêmica e integrativa, tem sido amplamente utilizada para identificar ingredientes ativos de medicamentos chineses e elucidar seus mecanismos de ação24,25. Neste estudo, a farmacologia em redes foi empregada para analisar as possíveis vias de sinalização e alvos-chave afetados pelo JPSXD no contexto da mielosupressão. Além disso, foi estabelecido um modelo de camundongos com mielosupressão induzido por ciclofosfamida (CTX) para avaliar indicadores relevantes e avaliar os efeitos do JPSXD na mielosupressão. Também foi realizada validação preliminar dos principais alvos e caminhos identificados por meio da farmacologia de rede. Este é o primeiro estudo a integrar sistematicamente farmacologia em redes com experimentos em animais para elucidar o mecanismo molecular pelo qual o JPSXD alivia a mielosupressão induzida pela quimioterapia por meio da regulação multi-alvo das vias de sinalização, como a via PI3K-AKT, preenchendo assim uma lacuna na compreensão mecanicista dos efeitos protetores hematopoéticos dessa fórmula.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com o Regulamento de Administração de Animais de Laboratório e as diretrizes éticas do Centro de Animais Experimentais do Hospital de Câncer de Hunan. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal do Hospital de Câncer de Hunan (Nº de Aprovação: KNZY-202416). Ao longo do estudo, os pesquisadores fizeram todo o possível para minimizar o número de animais usados e aliviar seu sofrimento.

Preparação animal
Um total de 60 camundongos machos C57/BL6 de 10 semanas foi obtido da Hunan Slack Jingda Laboratory Animal Co., Ltd. (Licença nº: SCXK [Hu] 2021-0002). Todos os camundongos foram alojados no Centro Experimental de Animais do Hospital de Câncer de Hunan sob condições ambientais controladas: temperatura: 23 ± 2 °C, umidade: 50% ± 10%, e ciclo de 12 horas luz/escuro (8:30-20:30). Os ratos tinham acesso improvisado a comida e água. Antes da experimentação, eles eram aclimatados ao ambiente por meio de manuseio diário por 5 minutos ao longo de um período de 3 dias. Após a aclimatação, todos os 60 camundongos foram estratificados pelo peso corporal e distribuídos aleatoriamente em seis grupos (n = 10 por grupo) usando uma tabela de números aleatórios gerada por computador. Os grupos incluíam: controle em branco, modelo, controle de soro fisiológico normal (NS), JPSXD em dose alta (40 mg/kg), JPSXD em dose média (30 mg/kg) e JPSXD em baixa dose (20 mg/kg). O processo de randomização não garantiu diferenças significativas no peso corporal médio entre os grupos (p > 0,05). A sequência de randomização foi gerada e executada por pesquisadores não envolvidos em procedimentos experimentais subsequentes para minimizar o viés.

Preparação de materiais
Segurança e descarte de resíduos: Este estudo envolveu CTX, um agente quimioterapêutico altamente tóxico. Todos os procedimentos foram conduzidos em estrita conformidade com os Regulamentos de Gestão de Segurança de Produtos Químicos Perigosos e os padrões laboratoriais de Biossegurança Nível 2. Precauções específicas incluíam o uso de roupas protetoras descartáveis, luvas de nitrila, respiradores N95 e óculos de proteção por todo o pessoal. A preparação e administração do CTX foram realizadas dentro de um gabinete de biossegurança Classe II. A preparação da solução de injeção CTX foi realizada em uma exaustão usando instrumentos dedicados para evitar a formação de aerossóis. Objetos cortantes e itens contaminados com CTX, como seringas e luvas, foram descartados em recipientes resistentes a perfurações. Outros materiais contaminados (por exemplo, cama ou tecidos animais) foram inativados por imersão em hipoclorito de sódio a 10% por 24 horas e posteriormente incinerados por um profissional certificado de descarte de resíduos médicos. Em caso de vazamento de CTX, a área era imediatamente coberta com algodão absorvente e neutralizada com uma solução de tiosulfato de sódio a 1%. O incidente foi então comunicado ao supervisor de segurança.

Medicamentos e reagentes: A injeção de CTX foi obtida da Baxter Oncology GmbH, Alemanha (Lote nº: HJ20160467). O JPSXD foi preparado pelo Departamento de Medicina Tradicional Chinesa do Hospital de Câncer de Hunan. Consistia em 15 ervas tradicionais — Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Epimedium brevicornum, Atractylodes macrocephala, Dioscorea opposita, Salvia miltiorrhiza, Rehmannia glutinosa, Cuscuta chinensis, Lycium barbarum, Ligustrum lucidum, Angelica sinensis, malte frito, revestimento de moela de frango, casca de tangerina seca e semente de Coix — combinadas segundo as razões clássicasde compatibilidade 20. A decocção foi concentrada até uma concentração final de 3 kg/L (ou seja, 3 g/mL). Antes do gavage, o concentrado era diluído com NS para atingir as concentrações necessárias para cada grupo de dose: 4 mg/mL para o grupo de alta dose (40 mg/kg), 3 mg/mL para o grupo de dose média (30 mg/kg) e 2 mg/mL para o grupo de baixa dose (20 mg/kg)26. O volume de gavage foi calculado como 0,1 mL por 10 g de peso corporal, resultando em um volume final de administração de 0,2-0,25 mL por camundongo (baseado em uma faixa de peso de 20-25 g)27.

Kits ELISA: Kits ELISA comercialmente disponíveis para fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), EPO e trombopoietina (TPO) foram usados. As amostras de soro foram diluídas 1:5 em tampão PBS (pH 7,4) antes do teste. Os padrões foram reconstituídos em 100 μL por poço.

Anticorpo secundário: IgG anti-coelho conjugado com HRP foi diluído em 1:5000 (concentração final: 0,04 μg/mL) em tampão TBST contendo 5% de leite desnatado e 0,05% de Tween-20. A solução foi preparada na hora e incubada em temperatura ambiente por 1 hora.

Foram usados anticorpos primários para Western blot: GAPDH (policlonal de coelho), AKT (policlonal de coelho), JAK2 (monoclonal de coelho) e EGFR (monoclonal de camundongo). Todos os anticorpos foram diluídos em tampão TBST contendo 5% de BSA: GAPDH (1:1000), AKT (1:1000), JAK2 (1:800) e EGFR (1:800). O volume de incubação era de 100 μL por membrana.

Fixador de tecido: Uma solução de paraformaldeído (PFA) a 4% foi preparada dissolvendo o pó de PFA em PBS (pH 7,4). Os lenços foram fixados por 24 horas.

Solução de coloração de hematoxilina e eosina (H&E): Solução de hematoxilina (0,1% de hematoxilina Harris) e solução de eosina Y (0,5%) foram preparadas de acordo com os protocolos padrãode patologia 28. A duração da coloração foi de 5 minutos para hematoxilina e 3 minutos para eosina.

Buffer bloqueador de imunofluorescência: Buffer PBS contendo 10% de soro de cabra e 1% de BSA foi usado para bloqueio, com incubação de 30 minutos.

Tampão de diluição de anticorpos para imunofluorescência: Os anticorpos primários (CD34+, TPO, EPO, GM-CSF) para imunofluorescência foram diluídos em tampão PBS contendo 1% de BSA, seguindo a razão de diluição recomendada pelo fabricante (1:200), resultando em uma concentração final de 2,5 μg/mL. O volume de incubação foi de 50 μL por seção de tecido.

Indução de um modelo animal
60 camundongos foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n = 10 por grupo): controle em branco, modelo, dose alta, dose média, dose baixa e controle NS. Exceto pelo grupo controle em branco, todos os camundongos receberam injeções intraperitoneais de CTX (20 mg/kg) uma vez ao dia por 3 dias consecutivos para estabelecer um modelo de mielosupressão. Todos os camundongos modelo apresentaram < de glóbulos brancos 1,8 × 109/L, PLT < 85 × 10⁹/L e redução de >55% nas células nucleadas pela medula óssea 24 horas após a injeção final. Este protocolo está alinhado com modelos estabelecidos de mielosupressão induzida porCTX 29,30. Após a injeção, os camundongos foram monitorados diariamente quanto à condição geral, incluindo nível de atividade, aparência do pelo e mudanças no peso corporal. Desde o início da modelagem até o final do experimento, o peso corporal era registrado no mesmo horário todos os dias usando uma balança eletrônica. A taxa de mudança de peso corporal foi calculada da seguinte forma: (peso final / peso inicial) x 100%, para avaliar o estado fisiológico geral e o potencial efeito protetor do JPSXD. Após a injeção, os camundongos foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente (IVCs), cada uma claramente rotulada como contaminada por CTX. A cama era trocada a cada 2 dias, e toda a cama usada era descartada de acordo com os protocolos de resíduos perigosos descritos acima.

Administração intragástrica
Ratos dos grupos de alta, média e baixa dose receberam JPSXD via gavage em doses de 40 mg/kg, 30 mg/kg e 20 mg/kg, respectivamente. O grupo controle salino recebeu volume igual de NS. Soluções de gavage foram preparadas em concentrações de 4 mg/mL, 3 mg/mL e 2 mg/mL, respectivamente, e administradas em volume de 0,1 mL por 10 g de peso corporal. Todos os camundongos foram atacados 2 vezes ao dia por 7 dias consecutivos. O grupo controle de soro fisiológico recebeu 0,2-0,25 mL por camundongo de NS. Nenhum tratamento foi dado aos grupos de blank e modelo. A ausência de tosse ou de luta durante o gavage indicava uma técnica correta de administração.

Coleta de sangue e preparação do soro
Noterceiro dia após a injeção de CTX, 0,2 mL de sangue foi coletado da veia caudal para avaliar o sucesso do estabelecimento do modelo, medindo a contagem de células sanguíneas periféricas usando um analisador hematológico totalmente automatizado. Às 24 horas após o último ataque do JPSXD, sangue foi coletado do seio orbital de camundongos selecionados aleatoriamente (n = 10 por grupo). Uma parte do sangue foi usada para análise completa do hemograma, enquanto o restante foi processado para preparação do soro. As amostras foram centrifugadas a 3.000 x g por 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante (uma camada superior clara, amarelo-pálida) foi coletado como soro e alicotado para armazenamento a -80 °C em ensaios ELISA subsequentes e testes de função hepática/rim. A camada sérica foi observada claramente separada da camada de células sanguíneas, sem sinais de hemólise ou turbidez. Os parâmetros hematológicos medidos incluíram os níveis de GLÓBULOS BRANCOS, GLÓBULOS, PLT e hemoglobina (Hb).

Avaliação da função hepática e renal
Um analisador bioquímico totalmente automatizado foi usado para medir marcadores de função hepática sérica — alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) — e marcadores de função renal — ureia sanguínea, nitrogênio (BUN) e creatinina (Cre). Todos os procedimentos seguiam o protocolo operacional padrão do instrumento. Especificamente, 100 μL de soro foram misturados com os kits de ensaio correspondentes (ALT, AST, BUN e Cre) e incubados a 37 °C por 5 minutos. A absorvância foi medida em 340 nm. Cada amostra foi testada em duplicado, e o valor médio foi usado para análise.

Cálculo do índice de órgão
Às 24 horas após a administração final do JPSXD, os camundongos foram eutanasiados por inalação gradual de dióxido de carbono (CO2) (vazão: 20% volume da câmara/min), seguida por luxação cervical como métodosecundário 31. Imediatamente após a eutanásia, fígado, rins, baço e timo foram colhidos assépticamente por uma incisão ventral na linha média. Os órgãos eram cuidadosamente dissecados para se livrar dos tecidos conjuntivos e da gordura ao redor, depois enxaguados em soro fisiológico normal gelado (NS) para remover o sangue residual. Os órgãos eram secados com papel filtro pré-pesado sob pressão padronizada (3 prensas suaves) e imediatamente pesados em uma balança eletrônica calibrada (precisão: ±0,1 mg) à temperatura ambiente (22 ± 1°C).

Todos os procedimentos foram realizados em uma bandeja de aço inoxidável pré-resfriada para minimizar a autólise. O índice de órgão foi calculado como peso do órgão (mg) dividido pelo peso corporal (g) para avaliar os efeitos do JPSXD nos órgãos principais. Porções de cada tecido foram reservadas para análise por Western blot, enquanto as amostras restantes foram fixadas em PFA de 4% para avaliação histológica subsequente.

ELISA
As concentrações séricas de TPO, EPO e GM-CSF foram medidas usando kits ELISA conforme as instruções do fabricante. Todas as etapas da centrifugação, incluindo lavagem da amostra e reconstituição do reagente, foram realizadas em temperatura ambiente a 1.000 x g por 5 minutos. As etapas de lavagem foram realizadas usando o tampão PBST (PBS contendo 0,05% Tween-20), com 300 μL de solução de lavagem adicionados por poço e repetidos 3 vezes. Após a lavagem, não restou líquido residual no fundo dos poços. Após o desenvolvimento da cor, um precipitado azul distinto era visível. A absorvância foi medida em 450 nm usando um leitor de microplacas após a reação ser interrompida.

Coloração H&E
Após a eutanásia, o timo e o fêmur foram colhidos. O timo foi pesado para calcular o índice do timo (peso do timo [mg]/peso corporal [g]). Após a pesagem, parte do timo foi usada para análise de Western blot, enquanto o restante, junto com o fêmur, foi fixado em 4% de PFA. Amostras de fêmur passaram por desidratação graduada de etanol (70%, 80%, 95% e 100% cada por 1 hora). A desidratação adequada era indicada por uma aparência uniformemente branca, sem amolecimento ou deformação. Blocos de tecido embutidos em parafina foram seccionados com espessura de 4 μm usando um micrótomo rotativo equipado com lâminas de carboneto de tungstênio de alta precisão (Tipo H31). As seções eram flutuadas em um banho-maria a 40 °C contendo solução de gelatina 0,5% para eliminar rugas, e depois montadas em lâminas de microscópio. Todas as seções apresentaram morfologia intacta, bordas lisas e translucidez uniforme sob microscopia óptica, confirmando qualidade ótima de seccionamento. Foi realizada a coloração H&E, seguida pela montagem com um meio aquosode montagem 28. Após a coloração, os núcleos apareceram azuis e o citoplasma rosa, com arquitetura celular bem definida sob observação microscópica usando um microscópio invertido. A análise histomorfológica foi realizada por software. Para cada seção corada com H&E, três campos aleatórios foram selecionados com ampliação de 200x. O software quantificava automaticamente o número de células nucleadas por unidade de área após a delimitação manual da região de interesse, e os resultados eram expressos como média ± desvio padrão (x̄ ± s).

Western blot
Tecidos de timo (50 ± 2 mg/amostra) foram homogeneizados em um tampão RIPA gelado contendo 1x coquetel inibidor de protease em uma proporção precisa de 100 mg de tecido por 1 mL de tampão, usando um homogeneizador motorizado de pilão equipado com pilões livres de RNase. A homogeneização foi realizada no gelo com 15 pulsos (1 s pulso/2 s de pausa), seguida por incubação de 30 minutos no gelo com vórtices a cada 10 minutos. O homogenado foi centrifugado a 12.000 x g por 20 minutos a 4 °C, e o sobrenadante resultante foi coletado para quantificação de proteínas. O sobrenadante parecia claro e transparente, livre de precipitados ou camadas lipídicas. A concentração de proteína foi medida usando um kit de ensaio de proteínas BCA, com uma faixa padrão de curva de 0 a 2000 μg/mL. Western blot foi realizado para avaliar os níveis de expressão de AKT1, JAK2 e EGFR no tecido timo, usando GAPDH como controle interno. Após a eletroforese e transferência de membrana, o marcador proteico (10-200 kDa) apresentou bandas claras, e as bandas-alvo alinhadas com os pesos moleculares esperados (AKT1: 60 kDa, JAK2: 130 kDa, EGFR: 170 kDa, e GAPDH: 37 kDa).

A análise densitométrica das bandas Western blot foi realizada usando software. Antes da análise, as bandas foram inspecionadas visualmente para confirmar a ausência de borrão ou difusão. O procedimento de análise incluiu: seleção manual das regiões das bandas-alvo após a importação da imagem, com detecção automática de bordas pelo software, seguida de subtração local de fundo usando regiões adjacentes às bandas para corrigir valores de cinza. Em seguida, foi feito o cálculo da razão de valores cinza entre a proteína-alvo e o controle interno para quantificação relativa. A fórmula de normalização utilizada foi:

Expressão relativa da proteína-alvo = (valor cinza da banda alvo −fundo local) / (valor cinza do controle interno −fundo local)

Imunohistoquímica
A coloração imunohistoquímica foi realizada em seções do fêmur. As fatias foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 por 10 minutos, seguidas de bloqueio por 30 minutos. Anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 °C, e anticorpos secundários foram incubados por 1 hora em temperatura ambiente. Após a coloração, sinais positivos distintos com baixo fundo e sem coloração inespecífica foram observados sob um microscópio óptico. As lâminas eram montadas usando um meio anti-descolorimento contendo DAPI, que tingia os núcleos de azul. A expressão de CD34+, TPO, EPO e GM-CSF foi então avaliada. Imagens de imunohistoquímica foram analisadas usando software digital de patologia (Versão 2.1.0). Antes da análise, as imagens foram verificadas como livres de superexposição ou degradação do sinal. O procedimentode análise 32incluiu:

Seleção do Modelo: Um modelo pré-treinado de segmentação da medula óssea (baseado em U-Net) foi usado para identificar automaticamente as regiõesteciduais 33.
Definição de Limiar: Os limiares positivos foram definidos com base no grupo controle negativo. Regiões com intensidade cromogênica superior à média de fundo em três desvios padrão foram classificadas como positivas.
Definição de ROI: O software dividiu automaticamente cada campo em regiões de grade de 500 × 500 μm e calculou o número de células positivas por unidade de área (contagem positiva de células/área do campo).
Exportação de Dados: Um relatório estatístico de densidade celular positiva foi gerado automaticamente.

Análise estatística
A análise estatística foi realizada usando o software SPSS (Versão 22.0). Os dados foram expressos como x̄ ± s. Antes das comparações entre grupos, a normalidade foi avaliada usando o teste de Shapiro-Wilk, e a homogeneidade das variâncias foi avaliada com o teste de Levene. Se tanto a distribuição normal (p > 0,05) quanto a homogeneidade de variância (p > 0,05) foram confirmadas, ANOVA unidirecional foi usada para comparações de grupos. Comparações múltiplas post hoc foram realizadas usando o método da Diferença Mínima Significativa (LSD); para controlar o erro do Tipo I, todos os valores de P post hoc foram ajustados usando a correção de Bonferroni, com p < ajustado 0,05 considerado estatisticamente significativo.

Se os dados não atendessem às suposições de normalidade ou homogeneidade da variância (p ≤0,05 em qualquer um dos testes), o teste de Kruskal-Wallis era aplicado, seguido pelo teste de Dunn para análise post hoc com correção de Bonferroni. Todos os gráficos estatísticos e visualizações foram gerados usando o GraphPad Prism (Versão 9.0). O nível de significância foi definido em α = 0,05. Todos os valores p relatados foram valores ajustados. Casos aberrantes foram identificados usando o teste de Grubbs (α = 0,05) e excluídos apenas se claramente atribuíveis ao erro experimental. Todos os dados restantes foram incluídos na análise final. Os resultados são apresentados como x̄ ± s.

Metodologia da farmacologia de redes
Este estudo utilizou uma abordagem de farmacologia em rede para explorar os potenciais mecanismos pelos quais o JPSXD alivia a mielossupressão induzida por quimioterapia. Primeiro, os constituintes químicos do JPSXD e seus alvos correspondentes foram recuperados do Banco de Dados e Plataforma de Análise de Sistemas de Farmacologia da Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php). Os critérios de triagem foram definidos da seguinte forma: biodisponibilidade oral (OB) ≥30% e semelhança com o medicamento (DL) ≥0,18. Para compostos não incluídos no banco de dados TCMSP, a previsão de alvos foi realizada usando a plataforma SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch/).

Para garantir que os compostos selecionados cobrissem os principais constituintes bioativos do JPSXD, foi feita referência à Farmacopeia da República Popularda China 34. Especificamente, identificamos compostos marcadores como ginsenósidos, astragalosídeo IV, icariina e ácidos salviánólicos revisando as seções de Identificação e Ensaio para cada erva. Esses compostos, comumente usados como marcadores de controlede qualidade 35, possuem estruturas químicas definidas e requisitos quantitativos. Para maior precisão, cruzamos as Notificações Gerais e Apêndices da Farmacopeia para confirmar convenções de nomenclatura e métodos analíticos (por exemplo, cromatografia líquida de alta performance, HPLC). A análise confirmou que os critérios de triagem (OB ≥30%, DL ≥0,18) capturaram efetivamente os compostos centrais da fórmula36, incluindo constituintes farmacopeicais chave como ginsenósidos Rg1 e Rb1 (do Panax ginseng), astragalosídeo IV (do Astragalus membranaceus) e icariina (do Epimedium brevicornum), indicando que os compostos selecionados são representativos e englobam os principais ingredientes ativos responsáveis pelo qi e o sangue do JPSXD efeitos.

Posteriormente, alvos gênicos associados à mielosupressão foram recuperados do banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/), e os resultados foram baixados em uma planilha. Genes com pontuação de relevância ≥44 foram selecionados para análise adicional. A interseção entre alvos de fármacos e genes relacionados à doença foi visualizada usando um diagrama de Venn, e os genes sobrepostos foram importados para o banco de dados STRING (https://string-db.org/). O organismo foi definido para humano, e as fontes de interação foram limitadas a Experimentos e Bancos de Dados com pontuação mínima exigida > 0,7. A rede de interação proteína-proteína (PPI) resultante foi então analisada quanto a características topológicas para identificar alvos centrais e visualizada usando o Cytoscape 3.10.2.

Com base nos alvos centrais identificados, análises de enriquecimento da Gene Ontology (GO) e da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) foram realizadas utilizando o banco de dados DAVID (https://david.ncifcrf.gov/). Os parâmetros foram definidos como: contagem ≥5, pontuação EASE ≥0,05 e valor-p < 0,01. Os resultados do enriquecimento foram visualizados através da plataforma Microbiological Letter (http://www.bioinfo-cloud.org/). A análise das vias esclareceu ainda mais as principais rotas de sinalização e marcadores regulatórios envolvidos, revelando assim os potenciais mecanismos pelos quais o JPSXD mitiga a mielossupressão induzida por quimioterapia.

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Resultados

Análise de farmacologia de redes
Identificação de compostos e alvos ativos
Primeiro identificamos os compostos marcadores principais de cada erva no JPSXD com base na literatura paragarantir uma seleção abrangente34. Especificamente, consultando as entradas farmacopeicais das ervas relevantes (por exemplo, Panax ginseng, Astragalus membranaceus, Angelica sinensis), compilamos uma lista dos constituintes oficiais dos marca...

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Discussão

Em meio ao aumento da incidência global de câncer, a comunidade médica enfrenta dois desafios: não apenas o tratamento do câncer em si, mas também o manejo dos efeitos colaterais associados, entre os quais a mielosupressão é uma reação adversa particularmente comume grave 43. Este estudo investigou sistematicamente o papel e os potenciais mecanismos do JPSXD no alívio da mielosupressão induzida por CTX em camundongos, empregando uma combinação de farmacologia em r...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Essa pesquisa foi financiada pelo projeto Integral Western and Traditional Chinese Medicine Focus-DCA Mode Intervention for Preventing Postoperae Infections in Elderly Patients with Gastrointestinal Malignities, com o número de projeto A2023053, financiado pela Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Hunan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% Paraformaldeído (PFA)Sigma-AldrichP6148
AKT (panela) Coelho mAbTecnologia de Sinalização Celular#4691
Lavadora Automática de MicroplacasBioTek (Agilent)ELx405
Analisador Autohematológico BC-2800vetMindrayBC-2800vet
Microtomo de crióstatoThermo Fisher ScientificCryoStar NX50
Injeção de ciclofosfamidaBaxter Oncology GmbHN/A (Lote: HJ20160467)
Microscópio E100NikonE100
Anticorpo EGFR (A-10)Santa Cruz BiotecnologiaSC-373746
Máquina de EmbeddingLeicaEG1150
EPO (Mouse) ELISA KitR& Sistemas DMEP00B
Anticorpo Policlonal GAPDH RabbitProteintech10494-1-AP
GM-CSF (Mouse) ELISA KitR& Sistemas DMMC00B
Cabra Anti-Coelho IgG HRP-conjugadoJackson ImmunoResearch111-035-003
H& Kit de Coloração ESigma-AldrichHT10
Centrífuga Refrigerada de Alta VelocidadeThermo Fisher ScientificSorvall ST 16R
Moedora de tecidos de alta capacidadeServicebioKZ-II
Caneta de ImunohistoquímicaLaboratórios VectorH-4000
JAK2 Rabbit mAbAbcamab108596
Decocção Jianpi Shengxue (JPSXD)Farmácia do Hospital de Câncer de HunanFormulação personalizada
Leitor de MicroplacasBioTek (Agilent)Sinergia H1
Soro fisiológico normalBaxter2B1324X
Microtomo RotativoLeicaRM2016
Processador de tecidosLeicaASP300S
TPO (Mouse) ELISA KitR& Sistemas DMTP00B
Misturador de vórticesServicebioMX-F

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