Artigo de método

Purificação de Trofoblastos Extravillosos HLA-G+ de Tecidos Placentários Humanos para Fenotipagem e Análise Funcional

545 vistas

⸱

DOI:

10.3791/69545

⸱

13 de março de 2026

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo permite a purificação, caracterização e cultivo de trofoblastos extravilosos primários HLA-G+ (EVT) a partir da decídua basal e da membrana coriônica das placentas humanas a termo. Culturas primárias de EVT mantêm a viabilidade por 96 horas, permitindo co-cultura com células imunes maternas comparadas por amostra e subsequente análise citométrica e molecular de fluxo de suas interações.

Resumo

A interface materno-fetal humana representa um ambiente imunológico único onde as células imunes maternas e os trofoblastos extravilosos fetais (EVT) participam de contato celular direto para estabelecer e manter a tolerância imunológica. A EVT apresenta um imunofenótipo distinto caracterizado pela expressão de moléculas tolerogênicas, incluindo HLA-G, PD-L1 e PD-L2, que desempenham papéis fundamentais na modulação das respostas imunes maternas. Além disso, os EVT humanos expressam HLA-C que pode ser reconhecido diretamente pelas células NK e T maternas e promove sua ativação. Importante destacar que nenhum ortólogo de HLA-C ou HLA-G está presente em modelos animais usados para pesquisa, e os trofoblastos murinos não apresentam expressão de MHC. Assim, investigar as propriedades fenotípicas e funcionais da EVT humana a partir dos tecidos placentários, tanto sob condições fisiológicas quanto patológicas, é essencial para elucidar os mecanismos subjacentes à manutenção na gravidez e à fisiopatologia da inflamação placentária associada à pré-eclâmpsia, parto prematuro, restrição do crescimento fetal e placenta acreta. Este protocolo descreve uma metodologia abrangente para o isolamento e caracterização da EVT humana primária a partir de tecido placentário saudável a termo, bem como após o parto prematuro e a pré-eclâmpsia. Inclui: (1) dissecação dos tecidos placentários e da membrana coriônica; (2) digestão enzimática e preparação de suspensões unicelulares; (3) purificação EVT por classificação FACS; (4) Caracterização fenotípica por citometria de fluxo de alta dimensão; e (5) cultura in vitro de curto prazo e co-cultura com células imunes maternas por até 96 horas. Há ênfase em obter EVT altamente pura e viável, adequada para aplicações posteriores, como ensaios funcionais imunológicos, análise de proteínas e expressão gênica. A implementação desse protocolo permite uma plataforma robusta e reprodutível para avançar na compreensão da EVT e das interações das células imunes maternas e suas implicações tanto em gestações saudáveis quanto complicadas.

Introdução

A placenta humana contém quatro grandes categorias de tipos de trofoblastos: células-tronco trofoblastas, sincitiotrofoblastos, citotrofoblastos vilosos e trofoblastos extravilosos (EVT), cada um com funções e características fenotípicas distintas. Entre eles, os EVT apresentam características imunológicas únicas, incluindo alta expressão de moléculas imunossupressoras, como HLA-G, PD-L1, PD-L2 e membros da família B7, além de HLA-C polimórfico 1,2,3,4,5,6. A EVT invade profundamente o tecido decidual materno, artérias espirais e o miométrio, colocando-os em contato direto com as células imunesmaternas 7. As EVTs são caracterizadas pela expressão proeminente de HLA-C polimórfico, um mediador chave das interações com células T e NK maternas que devem ser controladas para preservar a tolerância imune durante a gravidez. Como a única molécula clássica de MHC expressa pela EVT, o HLA-C também permite a apresentação de antígenos para células T de memória materna e apoia a proteçãoimunológica 8. No entanto, vários estudos mostraram que a EVT aumenta diretamente as células T CD4 regulatórias e os estados tolerogênicos das células T CD8 e células NK para se proteger da citotoxicidade e da rejeição imune 9,10,11,12,13. Além disso, alguns estudos relataram alterações imunológicas em células imunes maternas e EVT de placentas obtidas após pré-eclâmpsia, parto prematuro ou aborto espontâneo em comparação com controlessaudáveis 14,15,16,17,18,19,20,21 . Várias possibilidades podem estar por trás dessas mudanças imunológicas, incluindo i) anormalidade pré-existente das células T maternas; ii) funções imunossupressoras comprometidas da EVT; ou iii) interações interrompidas entre os dois tipos celulares. Para esclarecer os fatores mecanicistas subjacentes, sistemas experimentais de modelagem ex vivo que permitem a avaliação das células imunes maternas e das interações com EVT são essenciais.

Os métodos e abordagens apresentados aqui trazem vários benefícios em relação aos métodos existentes que utilizam linhas clássicas de trofoblastos, modelos de células-tronco de trofoblastos ou organoides. Mais importante ainda, as linhas celulares clássicas de trofoblasto e os modelos de células-tronco de trofoblastos não recapitulam características essenciais da EVT primária, incluindo seus perfis de expressãoMHC 3,5,22,23. Em segundo lugar, os requisitos complexos de meio das culturas humanas de células-tronco trofoblastas (hTSC) e organoides, que incluem vários inibidores moleculares, afetam diretamente as funções e o fenótipo das células imunes, impedindo a avaliação adequada da EVT e das interações entre células imunes 22,24,25,26,27. Por fim, a diversidade celular das culturas de hTSC após diferenciação e a natureza de dentro para fora das estruturas organoides placentárias permitem interações imunes com tipos de trofoblastos que não têm relevânciain n-vivo, reduzindo a clareza dosestudos 22,27.

Aqui, descrevemos métodos para purificar a EVT primária HLA-G+ a partir de tecidos placentários humanos a termo, permitindo cultivo por até 96 horas na presença ou ausência de populações de células imunes. O meio não possui inibidores moleculares que afetam a EVT e as funções das células imunológicas, mantendo sua viabilidade. Essa abordagem oferece uma plataforma valiosa para estudos diretamente ex vivo sobre EVT e interações com células imunes em gestações saudáveis e complicadas. Espera-se que contribua para a descoberta dos principais fatores que impulsionam a tolerância imunológica materno-fetal e identifique alvos terapêuticos para resolver a inflamação placentária.

Protocolo

O conselho de revisão institucional do Hospital Infantil de Cincinnati aprovou este protocolo de pesquisa (Aprovação #2021-0336), que atende aos requisitos de considerações bioéticas, tratamento de informações pessoais, patógenos infecciosos e procedimentos de consentimento informado, conforme a lei dos EUA. Cada laboratório deve obter aprovação que cumpra as diretrizes nacionais de pesquisa antes de iniciar o experimento.

Este protocolo foca no cultivo primário de HLA-G+ EVT que mantenham viabilidade até 96 horas para ensaio funcional secundário, melhorando nosso protocoloanterior 2,28. Consulte Hamilton et al.2 para estabelecer a linhagem celular semelhante à EVT HLA-G+ e Ikumi et al.28 para envolver linfócitos deciduais maternos compatíveis.

1. Montar o laboratório (dia 0).

NOTA: Use um gabinete de biossegurança classe II (BSL2) para manusear amostras.

  1. Prepare dois banhos-maria a 39 °C e 37 °C. Monteuma incubadora de CO2 umidificada a 37 °C.
  2. Prepare 1x PBS, Meio de Lavagem A, Meio de Lavagem B, Meio de Cultura EVT A, B e C (Tabela 1 e Tabela 2).
  3. Descongele 15 mL de solução de 10 mg/mL de DNase I (Tabela 1) e 500 mL de 0,25% de Tripsina/EDTA em banho-maria a 37 °C.
  4. Coloque um recipiente cheio de solução biocida/virucida (por exemplo, 10% de água sanitária) no armário BSL2 para coleta de resíduos líquidos. Monte um contêiner de resíduos com uma bolsa de risco biológico no armário BSL2 para resíduos sólidos.
  5. Prepare almofadas absorventes, ferramentas de dissecação estéreis (pinças de ponta curva e tesouras de 6 1/2"), filtros metálicos estéreis, suportes para tubos e tubos cônicos estéreis de 50 mL no gabinete BSL2.
  6. Prepare três tubos cônicos de 50 mL (dois com 1x PBS cada e um com Wash Medium A para a coleta de pedaços de tecido placentário durante a dissecação).

2. Coleta de amostras (dia 0)

NOTA: Use placentas humanas com membranas obtidas por cesariana entre 24 e 42 semanas de gestação. Uma placenta entregue vaginalmente pode causar menos EVT.

  1. Comece a processar a placenta imediatamente em um gabinete BSL2, idealmente dentro de 1-2 horas após o parto, para maximizar o rendimento das células viáveis. Mantenha a placenta em temperatura ambiente o tempo todo.
  2. Inspecionar a placenta e, se necessário, registrar seu tamanho, peso e aparência morfológica grosseira.

3. Dissecção de tecidos (dia 0)

  1. Dissecação de membrana
    1. Coloque a placenta voltada para o lado fetal para cima (parte de inserção do cordão visível). Remover o amníio, que é a camada de membrana mais próxima do lado fetal, descolando manualmente da membrana lateral em direção ao local de inserção do cordão umbilical; Corte e descarte o amnion.
    2. Corte a membrana coriodecidual em tiras de 2 polegadas começando da base da placenta para cima, deixando a membrana presa à placenta.
    3. Coloque a faixa de membrana coriodecidual nos dois dedos voltados para cima e raspe suavemente a decídua parietal materna do corion usando a pinça curva estéril da ponta.
      NOTA: Trabalhe de forma eficiente e não deixe a membrana coriônica secar.
    4. Colete a membrana coriônica em um tubo cônico de 50 mL com 20 mL de Meio de Lavagem A.
    5. Colete a decídua parietalis para isolamento de linfócitos deciduais no tubo cônico de 50 mL com 20 mL de PBS e siga o protocolo descrito por Ikumi et al. para isolamentolinfócito-28.
    6. Corte a membrana coriônica com tesoura no tubo de 50 mL até que ela se torne pedaços pequenos de <2mm2.
      NOTA: A quantidade total da membrana sedimentada é idealmente 30 mL após o corte.
    7. Descarte o Meio de Lavagem A e lave com PBS várias vezes até que o sobrenadante fique transparente.
  2. Dissecção da placenta
    1. Coloque a placenta voltada para o lado materno para cima e remova os coágulos sanguíneos. Corte as partes da placa basal da placenta (comprimento 2 cm, largura 2 cm, profundidade 0,5 cm) usando tesouras estériles, evitando as partes necróticas, calcificadas ou isquêmicas.
    2. Coloque o pedaço de decídua basal nos dedos voltados para as vilosidades (lado fetal) para cima. Remova cuidadosamente as vilosidades da basal da decídua com tesoura para obter 2-3 mm de membrana, restando apenas uma camada fina de vilosidades na basal da decídua.
    3. Colete o tecido da base da decídua no tubo cônico de 50 mL com 20 mL de PBS. Corte as decíduas basais até que se tornem pequenos pedaços de <2mm 2.
      NOTA: A quantidade total de tecido sedimentado é idealmente de 15 mL após a picagem.
    4. Descarte o PBS e lave a basal decidual com PBS várias vezes até que o sobrenadante fique transparente, sem sangue visível.
    5. Divida 15 mL de suspensão de tecido em dois tubos cônicos de 50 mL (7,5 mL em cada tubo).
      NOTA: O protocolo de isolamento de linfócitos da decídua basal é distinto deste protocolo. Consulte o protocolo fornecido em Hamilton et al.2.

4. Digestão de tecidos (dia 0)

  1. Após a lavagem final da membrana coriônica e da decidua basalis na seção 3, encha todos os tubos com 1x PBS, centrifuge-os a 200 × g por 1 minuto e despeja o sobrenadante.
  2. Prepare o Coquetel de Enzimas de Digestão de Tecidos (Tabela 1). Adicione 150 mL de Coquetel de Enzimas de Digestão de Tecidos morno a um frasco de vidro de 300 mL, depois adicione 30 mL de membrana coriônica ao frasco.
  3. Adicione 20 mL de DMEM/F20 morno e 80 mL de Cocktail de Enzimas de Digestão de Tecidos morno em duas garrafas de vidro de 300 mL e depois adicione 7,5 mL de Decidua Basalis em cada garrafa.
  4. Incube a garrafa com membrana coriônica no banho-maria a 39 °C e as duas garrafas com decidua basalis no banho-maria de 37 °C. Durante os 15 minutos de incubação, agite todas as garrafas a cada 3-4 minutos (primeira digestão).
  5. Após a digestão, filtre o tecido digerido por peneiras metálicas (tamanho da malha 40). Adicione o Wash Medium B aos tecidos para enxaguar e dissolver a substância gelatinosa.
  6. Filtre as suspensões celulares sobre um filtro de 100 μm em tubos de 50 mL marcados com o tipo de tecido e o número de digestão.
  7. Prossiga com a segunda digestão transferindo o tecido não digerido de volta para os frascos médios de 300 mL, adicione o Cocktail de Enzimas de Digestão de Tecidos conforme descrito no passo 4.2 e repita os passos 4.2-4.6.
    NOTA: Todos os tecidos de Decidua basalis são transferidos para um único frasco de 300 mL. Mantenha as células obtidas após a primeira digestão e a segunda separadas.
  8. Gire a suspensão da célula a 650 × g por 8 minutos e descarte o sobrenadante.
  9. Combine os pellets (mas mantenha a primeira e a segunda digestão separadas) do mesmo tipo de tecido e número de digestão em um único tubo. Encha com Wash Medium B até 25 mL.

5. Gradiente de densidade de Ficoll (dia 0)

  1. Prepare quatro tubos cônicos de 50 mL marcados com o tipo de tecido e número de digestão. Despeje 12 mL de Ficoll nos tubos.
  2. Carregue cuidadosamente as suspensões das células no Ficoll. Centrifuge os tubos a 800 × g por 20 minutos (temperatura ambiente) sem freio.
  3. Transfira cuidadosamente a camada celular na interface Ficoll-meio para tubos cônicos limpos de 50 mL, marcados por tipo de tecido e número de digestão após a centrifugação.
    NOTA: Colete cuidadosamente a camada sem perturbar a interface usando uma pipeta de transferência estéril.
  4. Encha os tubos com Wash Medium B e centrifuge a 650 × g por 8 minutos.
  5. Descarte o sobrenadante e resuspenda os pellets celulares com o meio restante (aproximadamente 0,5 mL). Se necessário, mantenha aproximadamente 10% da suspensão celular separada para fenotipagem e use 90% para a separação celular. Conte as células para determinar o número e a viabilidade das células.

6. Seleção da EVT (dia 0)

  1. Coloque os pellets de células ressuspensas em tubos FACS estéreis rotulados com tipo de tecido e número de digestão. Adicione anti-CD45-BV785 (1:100), anti-HLA-G-APC (1:125) e anti-EGFR1-BV711(1:160) (Tabela 3). Incube os tubos por 20 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
  2. Adicione 1 mL de Wash Medium B e centrifuge a 650 × g por 8 minutos.
  3. Descarte o sobrenadante e resuspenda os pellets celulares com o Wash Medium B para fazer aproximadamente 1 × 10suspensão de 6 células / mL.
  4. Filtre as células por um filtro de 40 μm, diretamente antes da separação celular, e separe CD45-HLA-G+EGFR+ EVT em tubos com 1 mL de Meio de Cultura EVT A de acordo com a estratégia de gate descrita na Figura 1A.
    NOTA: Para uma viabilidade ótima dos trofoblastos, deve ser usado um separador de células a jato no ar (por exemplo, Bigfoot ou MoFlo) com um bico de 100 μm. Classificadores baseados em fluídica (por exemplo, DB S6 ou Sony Nano) podem reduzir a viabilidade dos trofoblastos, enquanto estratégias de separação por células magnéticas (por exemplo, Easysep ou MACS) podem preservar a viabilidade, mas apresentam baixa pureza, resultando em crescimento excessivo de células estomais nas culturas.
  5. Centrifuge os tubos FACS com células separadas, descarte o sobrenadante e ressuspenda os pellets celulares com o Meio de Cultura EVT B.
    NOTA: Prossiga na próxima seção para preparar as placas de cultura enquanto separam as células.

7. Cultura primária de HLA-G+ EVT para ensaio secundário (dias 0 - 1)

  1. Revestir os poços das placas de cultivo celular de fundo plano e 96 poços com 50 μL de fibronectina de 20 μg/mL (Tabela 2) em temperatura ambiente por 45 minutos.
  2. Remova a fibronectina e adicione a suspensão celular com EVT Culture Medium B aos poços. Mire em 0,5 × 10 célulasEVT basais de 5 basais/200 μL de meio/poço e 1,0 × 10 célulasEVT coriônicas/200 μL de meio/poço. Incube as placas de cultura celular por 12-18 horas na incubadora umidificada deCO2 a 37 °C (incubação do dia 0).
  3. No dia 1, remova o meio B, lave suavemente as células com 1x PBS e adicione o Meio C de Cultura EVT com ou sem células T para posterior (co)cultura (veja a seção 8).

8. Co-cultura de HLA-G+ EVT primário com células T ativadas (dias 0 - 4)

  1. Estimulação de células CD8+T de3º doador (dias 0-1)
    1. Durante a separação do HLA-G+ EVT (dia 0), isolem populações de células imunes do sangue periférico do sangue materno pareado com amostras ou doadores de sangue não relacionados, usando o Coquetel de Enriquecimento de Células T CD8+ humanas referenciado (veja a Tabela de Materiais), seguido pela centrifugação por gradiente de densidade Ficoll ou ordenação FACS.
    2. Pré-estimule células T ou NK com esferas ou citocinas anti-CD3/28 (por exemplo, IL2, IL15, IL12 ou IL18) no Meio de Cultura Celular Linfócito, conforme desejado.
  2. Co-cultura EVT com células T ativadas (dias 1-4)
    1. Conte o número de linfócitos e faça suspensões celulares com Meio de Cultura Celular de Linfócitos em concentração de 0,5 × 106 / mL. Adicione 1 × 1010 5 linfócitos aos poços primários de EVT (o volume de Meio de Cultura de EVT C : Meio de Cultura de Células Linfócitos = 1:1). Incube as placas por 24-72 horas em uma incubadora deCO2 umidificada a 37 °C.
    2. Colhe linfócitos para a análise de citometria de fluxo e colete supernadantes para análise de citocinas.
    3. Colhe EVT usando tripsinização e colete EVT nos tubos FACS para análise de citometria de fluxo no dia 4 (veja a seção 9).

9. Fenotipagem da EVT primária HLA-G+

NOTA: Proceda imediatamente à coloração citométrica de fluxo e mantenha a EVT e todas as soluções necessárias em temperatura ambiente o tempo todo.

  1. Centrifuge os tubos FACS com EVT primário a 650 × g por 7 minutos e descarte o sobrenadante.
  2. Adicione a solução de coloração de caspase 3/7 (Tabela 3) aos pellets de células e misture suavemente.
  3. Tinga as células com anticorpos (Tabela 3), misture suavemente e incube por mais 20 minutos (total de 30 minutos de incubação).
  4. Adicione 1 mL de Meio de Cultura EVT C, centrifuge os tubos a 650 × g por 7 minutos e descarte o sobrenadante.
  5. Ressuspenda o pellet celular com 0,4 mL de Meio de Cultura EVT C da célula. Adicione a solução de coloração 7-AAD (5 μL/célula suspensa) nos tubos e analise imediatamente em um citômetro de fluxo.

Resultados

Rendimentos esperados da célula

A partir de 15 mL de basal decepdu, o HLA-G+ EVT esperado gera 0,1-0,3 × 106 células na primeira digestão e 0,1-0,6 × 106 células na segunda digestão (total 0,2-0,8 × 106 células). A partir de 30 mL de membrana coriônica, os rendimentos esperados de HLA-G+ EVT são de 0,4-1,0 × 106 células na primeira digestão e de 0,4 a 1,5 × 106 células na segunda digestão (total 0,8-2,5 × 106 células). A proporção de caspase 3/7-7-AAD-EVT viva nos isolados deve ser de 90-95%.

Cultura primária HLA-G+ EVT

A análise de citometria de fluxo de marcadores de linhagem (HLA-G, HLA-C, EGFR) e marcadores de morte celular mostrou que esse protocolo fornece uma cultura primária viável de EVT até o dia 4 (96 h após a colocação da EVT classificada) (Figura 1B-D). Imagens representativas de microscopia óptica da HLA-G+ coriônica primária e d.basalis EVT são mostradas após 24, 48 e 72 horas de cultura (Figuras 2A-F).

Co-cultura de EVT primário HLA-G+ com células T

Esse protocolo melhorou a viabilidade da EVT primária 96 horas após o isolamento da placenta, uma melhora em comparação com nosso relatórioanterior 1, 2 e 10. Portanto, possibilita a análise das respostas de EVT após co-cultura com linfócitos pré-estimulados, o que simula a inflamação aguda na interface materno-fetal. EVT expressa HLA-C polimórfica, bem como moléculas coinibitórias imunossupressoras, como PD-L1, PD-L2, PVR (também conhecida como CD155), B7H3 e HLA-E, conforme determinado por coloração por citometria de fluxo extracelular (Figura 3A, B). A EVT aumentou a expressão de HLA-C, assim como de PD-L1, PD-L2 e HLA-E, mas não aumentou a expressão de PVR e B7H3 quando co-cultivada com linfócitos ativados por 72 horas, de acordo com a seção 8 do protocolo (Figura 4A,B). Além disso, não foi observado aumento na morte por EVT, como mostrado pela 7AAD e pela coloração da caspase 3/7 (Figura 4C,D).

Figura 1
Figura 1. A estratégia de portamento para separação de células EVT e citometria de fluxo é plotada após o cultivo de EVT ordenado. (A) A estratégia representativa de gate para separar a EVT da decidua basalis e a EVT coriônica. R1 é o portão de célula viva no gráfico de dispersão do lado dianteiro. R2 é a porta para exclusão dos leucócitos CD45+. R3 é a porta HLA-G+EGFR+EVT. R4 é o 7-AAD-caspase3/7- EVT ao vivo. Embora a porta R4 não seja necessariamente necessária para a separação, ela é mostrada aqui para demonstrar a viabilidade da EVT primária. (B) Gráficos representativos de citometria de fluxo de HLA-G+EGFR+EVT ordenados, após 96 horas de cultivo in vitro. (C,D) Frequências de caspase 3/7 - 7-AAD - EVT viva durante a formação (dia 0) e 96 horas de cultivo (dia 4). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2
Figura 2. A morfologia da EVT durante a cultura in vitro . Imagens representativas de microscopia óptica da EVT coriônica após (A) 24 horas, (B) 48 horas e (C) 72 horas de EVT em cultura e decídua basal após (D) 24 horas, (E) 48 horas e (F) 72 horas de cultura. Barra da escala = 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Fenótipos imunológicos da EVT primária. (A) Os gráficos de fluxo representativos de HLAs e moléculas coinibitórias na EVT primária, conforme determinados por coloração por citometria de fluxo extracelular (dia 0). (B) Gráficos de linhas pareadas mostram MFI bruto do controle IgG e coloração completa de cada marcador de d. basalis EVT (azul) e EVT coriônica (verde) no dia 0. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4
Figura 4. Fenótipos imunológicos da EVT primária com ou sem linfócitos ativados (dia 4). (A) Gráficos de fluxo representativos da EVT após a cultura de 72 horas (dia 4) com ou sem linfócitos de terceiros ativados. (B) Gráficos lineares pareados mostram MFI de EVT com ou sem linfócitos de terceiros ativados. Plots azuis representam EVT da decidua basalis, e plots verdes representam EVT coriônica. (C) Gráficos representativos de citometria de fluxo para caspase 3/7-7-AAD-EVT viva com ou sem linfócitos de terceiros ativados no dia 4. (D) Gráficos de linha pareados mostram frequências de caspase 3/7-7-AAD-EVT vivo com ou sem linfócitos de terceiros ativados. Plots azuis representam EVT da decidua basalis, e plots verdes representam EVT coriônica. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1. Reagentes essenciais para a dissecção e digestão do tecido. Veja também 1,2,24. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2. Reagentes chave para a cultura EVT e co-cultura com células T. Veja também 1,2,24. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3. Anticorpos e reagentes chave para triagem e análise de citometria de fluxo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Etapas críticas do protocolo

Para obter EVT viável, é crucial iniciar o isolamento celular da placenta imediatamente após o parto e realizar todos os procedimentos, desde o isolamento até a triagem, em temperatura ambiente. Como os EVTs são maiores e mais adesivos em comparação aos linfócitos, as seguintes precauções devem ser tomadas para a separação e evitar entupimento de células: i) passar a suspensão celular por um filtro de células de 40 μm antes da seleção, ii) usar um meio contendo DNase para suspensão celular, iii) evitar a concentração excessiva das suspensões celulares (idealmente ~1 × 10⁶ células/mL), e iv) usar um bico de pelo menos 100 μm. Um separador Jet-in-Air (por exemplo, Pé Grande, MoFlo) alcança um rendimento viável de EVT maior em comparação com classificadores de células baseados em fluidica (por exemplo, classificadores BD, Sony Nano).

Modificações e solução de problemas do método

Excesso ou pouco digerido após a primeira digestão da EVT da decídua basal

A eficiência digestiva do tecido decídua basal varia entre placentas. Tecidos superdigeridos formam grandes agregados pegajosos que são difíceis de passar pela peneira metálica. Normalmente, adicionar de 10 a 30 mL de Meio de Lavagem B ajuda a dispersar esses agregados durante a filtração. Se isso não resolver o problema, adicione 1-2 mL de DNase diretamente aos tecidos. Se a primeira digestão resultar em excesso de digestão, reduza a concentração do Coquetel de Enzimas de Digestão Tecidular de 80% para 70% na segunda digestão. Após a filtração da primeira digestão, o volume residual do tecido deve ser reduzido para aproximadamente menos da metade. Se o volume residual do tecido permanecer inalterado, aumente a concentração do Cocktail de Enzimas de Digestão Tissular de 80% para 90-100% na segunda digestão. Os tecidos da membrana coriônica são consistentemente digeridos através das placentas. Portanto, ajustar a concentração do coquetel de enzimas de digestão tecidual geralmente não é necessário.

Para digestão de volumes teciduais maiores do que os descritos no protocolo acima

Para digestões de mais de 30 mL de membrana coriônica ou mais de 15 mL de tecido basal decíduo, utilize frascos adicionais com o Cocktail de Enzimas de Digestão Tecidual. Aumentar o volume do tecido em uma única garrafa tende a resultar em uma subdigestão.

Limitações do método

Espera-se menor rendimento de EVT a partir das placentas entregues vaginalmente. A EVT não pode ser criopreservada antes ou depois da seleção, pois são sensíveis ao estresse de congelamento e descongelamento, o que limita significativamente sua viabilidade e função. Assim, esse protocolo não inclui nenhum ponto de parada.

A importância do método em relação aos métodos existentes

Anteriormente, relatamos o protocolo para estabelecer linhas celulares semelhantes a HLA-G+ EVT a partir de placentas a termo, utilizando Meio B de Cultura de Tecidos e placas revestidas de colágeno. No entanto, vários inibidores no meio e no colágeno potencialmente afetam a função das células T no sistema de cocultura2. Outro relatório anterior que não utilizou o Meio B de Cultura de Tecidos permitiu a avaliação de células T em cocultura, mas não da EVT devido à variabilidadecelular 1,10. A vantagem do protocolo atual é que ele minimiza a influência do meio de cultura, ao mesmo tempo em que possibilita a cultura de EVT primário viável. Esse protocolo fornece uma plataforma experimental para investigar a função imunológica da EVT e suas mudanças funcionais em resposta às células imunes ao redor — uma área que tem sido pouco investigada.

Divulgações

Não há conflito de interesses relacionado a este estudo.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Sherry Thornton e ao Research Flow Cytometry Core da Divisão de Reumatologia do Cincinnati Children's Hospital Medical Center por toda sua ajuda com citometria de fluxo e separação celular; Todos os enfermeiros e médicos dos hospitais participantes por seus esforços na coleta de materiais placentários; Todos os membros do laboratório de Tilburgs e professores de imunologia do CCHMC por suas discussões úteis; Esse trabalho foi apoiado pelo NIH R01HD116852 (T.T.); Fundação de Pesquisa Infantil de Cincinnati (T.T.); Prêmio Burroughs Wellcome Fund Next Gen Pregnancy #NGP10115 (T.T.); e a bolsa colaborativa March of Dimes, Ohio (T.T.). S.T. conta com o apoio dos subsídios JSPS KAKENHI Números 22KK0287 e 25K12697.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-238
-20 °C freezerany supplier
37 °C 5% CO2 Incubatorany supplier
4 °C fridgeany supplier
50 mL Conical Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” scissorsany supplier
7-AAD Viability Staining SolutionBiolegend420403
-80 °C freezer any supplier
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, mouse, IgG1 k Isotype ControlBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype ControlBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE Cell AnalyzerBD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 biosafety cabinetany supplier
BV605 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences562652
BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control Biolegend400105
BV785 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Cell dissociation sieveMillipore Sigma CD1-1KT (mesh size 60)
Cell strainers 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent caspase-3/7 Green Detection ReagentinvitrogenC10423
Centrifugeany supplier
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Curved tip tweezersany supplier
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher Scientific11131D
EGF, Human, Recombinant, Animal FreePeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA softwareBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo SoftwareFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB serumCorning35060CI
Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
Human fibronectin (1mg/mL)Corning354008
Human recombinant IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Ascorbic AcidSigma-AldrichA0278
magnet separatorpromegaZ5342
Newborn Calf Serum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype ControlBiolegend400126
PE/Dazzle594 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400176
Penicillin and Streptomycin Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline 10X SolutionThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Research grade FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Shaking water bath 37 °Cany supplier
Tryple Express 1x No Phenol RedThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-380Q
Y27632Sigma-Aldrich688000-1MG

Referências

  1. Papuchova, H., et al. Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).
  2. Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions. STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).
  3. Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
  4. Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
  5. Apps, R., et al. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).
  6. Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells. Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).
  7. Moffett, A., Loke, C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).
  8. Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface. Front Immunol. 10, 2730(2019).
  9. Vander Zwan, A., et al. Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).
  10. Salvany-Celades, M., et al. Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface. Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).
  11. Mahajan, S., et al. Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells. JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).
  12. Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).
  13. Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ. 366, 12381(2019).
  14. Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content. J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).
  15. Tsuda, S., et al. Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia. Front Immunol. 9, 1934(2018).
  16. Tsuda, S., et al. CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 15, 1401738(2024).
  17. Pique-Regi, R., et al. Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition. eLife. 8, e52004(2019).
  18. Yang, J., et al. Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia. Front Immunol. 14, 1142273(2023).
  19. Morita, K., et al. Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia. Front Immunol. 11, 1082(2020).
  20. Sasaki, Y., et al. Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).
  21. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion. Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).
  22. Shannon, M. J., et al. Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms. Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).
  23. Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
  24. Okae, H., et al. Derivation of human trophoblast stem cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).
  25. Shimizu, T., et al. CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).
  26. Hori, T., et al. Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier. Nat Commun. 15 (1), 962(2024).
  27. Wang, M., et al. Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts. Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).
  28. Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. Purification of primary human placental leukocytes. STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Express o de HLA GTecido Placent rioInterface Materno FetalToler ncia ImuneCitometria de FluxoSepara o por FACSCaracteriza o Fenot picaIntera o de C lulas ImunesDigest o Enzim tica

Artigos relacionados