Artigo de método

Amostragem em tempo real do fluido intersticial advential arteriovenoso do femur de rato por meio da colocação de uma sonda de microdiálise

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DOI:

10.3791/69551

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30 de dezembro de 2025

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1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo introduz uma técnica de microdiálise que facilita a amostragem em tempo real e anatomicamente precisa do fluido intersticial adventicial (AISF) em ratos anestesiados, revelando variações metabólicas distintas e afirmando sua importância fisiológica única. Em comparação com os métodos existentes de amostragem de fluidos intersticiais (ISF), essa abordagem oferece maior resolução molecular e estabilidade da amostragem.

Resumo

O fluido intersticial (ISF) é um elemento vital do microambiente extracelular, facilitando a troca metabólica e a comunicação intercelular. No entanto, a profundidade anatômica e a proximidade com estruturas vasculares tornam a ISF adventícia (AISF) especialmente difícil de amostrar sem introduzir contaminação ou causar perturbação tecidular. Neste estudo, apresentamos um método minimamente invasivo em tempo real para coleta de AISF por meio do uso de microdiálise em ratos anestesiados. Sondas duplas de corte de 20 kDa foram implantadas cirurgicamente na ventítia arteriovenosa femoral e na veia jugular para permitir amostragem contínua de ISF e sangue, respectivamente. A perfusão com fluido extracelular artificial permitiu a difusão seletiva de metabólitos de baixo peso molecular. Por meio da análise de componentes principais (PCA) e da análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA), observou-se uma divergência metabólica distinta entre a AISF e o sangue, identificando 146 metabólitos significativamente diferenciais. Os padrões de enriquecimento de lactato e serotonina confirmaram a especificidade anatômica e a confiabilidade funcional do método. Importante destacar que o AISF foi enriquecido com metabólitos sintetizados localmente que estavam ausentes no plasma, destacando sua importância fisiológica única. Em comparação com as metodologias atuais de amostragem de fluido intersticial (ISF), como microagulhas, bolhas de sucção e iontoforese reversa, a microdiálise proporciona maior resolução molecular, maior estabilidade de amostragem e redução da invasividade. Essa técnica constitui uma plataforma confiável para análise in vivo de analitos em fluido intersticial (AISF) e mostra potencial significativo para avançar na descoberta de biomarcadores e na pesquisa em fisiopatologia vascular.

Introdução

O fluido tecidual, ou fluido intersticial (ISF), constitui um elemento crucial do microambiente celular, com investigações acadêmicas que remontam ao final do século XIX. Em 1896, Starling introduziu a teoria da filtração-reabsorção capilar, que caracterizou pela primeira vez a ISF como um fluido homogêneo gerado por ultrafiltração por plasma, desempenhando um papel vital no transporte de nutrientes e na remoção de resíduosmetabólicos 1. Nas últimas duas décadas, avanços na tecnologia de imagem microscópica e na biologia molecular ampliaram a compreensão dos pesquisadores sobre a considerável diversidade na distribuição, composição e função anatômica doISF 2.

Pesquisas sobre fluido intersticial (ISF) em vários sítios anatômicos elucidaram suas funções distintas dentro de diferentes tecidos. Por exemplo, no tecido cerebral, a ISF facilita a eliminação de metabólitos neurotóxicos, como β-amiloide, durante o sono através do sistemaglymphático 3. Por outro lado, o líquido intersticial tumoral (TIF) contribui para a invasão tumoral e evasão imunológica ao promover um microambiente ácido por meio do acúmulo de ácidolático 4. Esses achados sugerem que a ISF funciona não apenas como mediadora da troca metabólica, mas também como reguladora ativa dos processos fisiopatológicos específicos do tecido. Nesse contexto, o Fluido Intersticial Adventício (AISF) apresenta um desafio único de pesquisa devido à sua localização anatômica específica e complexidade funcional. A AISF está localizada na interface entre a adventícia e os tecidos5 ao redor, desempenhando um papel crucial na interação entre a parede vascular e os sistemas nervoso e imunológico. No entanto, sua localização anatômica profunda e proximidade com sangue e fluidos linfáticos têm apresentado desafios técnicos significativos para amostragem in situ e análise composicional.

Técnicas tradicionais para amostragem de ISF, incluindo o método do pavio e drenagem cirúrgica, enfrentam desafios significativos para obter amostras de AISF de alta pureza devido ao risco de contaminação do sangue e danos teciduais. Por exemplo, a remoção cirúrgica do epitélio vascular pode causar lesão nos nervos periféricos ou vasos linfáticos, resultando na mistura de biomoléculas não alvo6. Além disso, esses métodos são limitados por baixas taxas de amostragem, instabilidade, suscetibilidade à interferência e baixa reprodutibilidade, frequentemente atribuível à inflamação induzida pela inserção subcutânea do pavio7 e danos celulares durante a implantação muscular. O desenvolvimento da microdiálise apresenta uma abordagem mais eficaz para estudos de ISF. Essa técnica permite a captura in situ e dinâmica de pequenas moléculas, como metabólitos e citocinas, dentro do ISF sem comprometer a estrutura vascular, utilizando uma sonda de membrana semipermeável. A sonda pode ser posicionada com precisão dentro do espaço epitelial vascular, reduzindo assim o risco de contaminação por sangue ou fluidos linfáticos. Além disso, facilita a amostragem contínua, o que possibilita o monitoramento em tempo real das mudanças dinâmicas no metabolismo dos ISF sob diversas condições. Garantir o monitoramento contínuo e estável desses processos metabólicos durante o experimento.

Protocolo

Os experimentos com animais foram realizados após aprovação do Comitê de Ética Animal da Faculdade de Medicina da União de Pequim. Todos os procedimentos seguiram rigorosamente os protocolos estabelecidos. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação experimental

  1. Ilustre o sistema de amostragem de microdiálise e os instrumentos cirúrgicos associados, conforme mostrado na Figura 1.
  2. Prepare fluido extracelular artificial (ECE) contendo 153,5 mM de Na, 4,3 mM de K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM de Ca, 139,4 mM de Cl e 1,25 mM de glicose, e ajuste o pH para 7,4.
  3. Prepare duas sondas mD de 20 kDa e designe-as como Sonda 1 (sonda de fluido tecidual) e Sonda 2 (sonda de sangue). Coloque a Sonda 1 em água desionizada filtrada estéril (dH₂O) e a Sonda 2 em heparina de sódio a 1%, garantindo que as pontas da sonda permaneçam continuamente úmidas.
  4. Estabeleça dois pares de vias (Caminhos 1 e 2) para "entrada" e "saída". Conecte dois segmentos de tubos FEP de 1 m usando tubos PE50, minimizando o espaço morto. Conecte cada tubo de entrada a uma seringa Exmire de 1 mL: encha a seringa 1 com dH₂O e a seringa 2 com heparina de sódio a 1%. Conecte as microseringas às sondas e prepare para a infusão de FE após colocar as sondas na veia jugular.
  5. Ative a bomba mD e ajuste a vazão para 1,5 μL/min até que o fluido saia do tubo de saída. Conecte o tubo de saída à linha de coleta da amostras.
  6. Encha duas microseringas com aECF filtrado e inicie o bombeamento a 1 μL/min.

2. Preparação de animais

  1. Selecionados ratos adultos de Sprague-Dawley pesando 280 ± 20 g (n = 6).
  2. Induza anestesia usando isoflurano a 3% e mantenha-a com 1,8%-2,2% de isoflurano em uma mistura ar/oxigênio enquanto monitora a atividade cardíaca (seguindo protocolos institucionalmente aprovados). Confirme a anestesia profunda avaliando a ausência de resposta à dor e observando uma redução da frequência cardíaca (340-390 bpm). Coloque o rato em um cobertor termostema e imobilize os membros.
  3. Aplique creme depilador no pescoço e no membro traseiro esquerdo, estendendo-se até o abdômen inferior esquerdo. Desinfete as áreas depiladas duas vezes com iodóforo e remova o iodo residual usando álcool medicinal 75%.

3. Colocação de sonda em dois sítios (adventício femoral e veia jugular)

  1. Use uma sonda com janela de diálise ativa de 10 mm (CMA-20, corte de 20 kDa, diâmetro do eixo de 0,5 mm) como mostrado na Figura 2A.
  2. Prepare a agulha-guia e o tubo de desmontagem (Figura 2B).
  3. Estenda o membro posterior do rato de modo que a linha que conecta a articulação do joelho ao ponto médio da dobra inguinal seja perpendicular ao eixo longitudinal do corpo. Meça um segmento de 2 cm ao longo da pele da região inguinal na direção do membro posterior para definir a área cirúrgica de referência (Figura 2C). Identifique o ponto médio dessa região inguinal como o ponto de posicionamento da microjanela. Marque o local da perfuração 2 cm lateralmente a esse ponto de posicionamento (Figura 2D).
  4. Coloque o animal sob um estereoscópio.
  5. Faça uma incisão de 0,5 a 0,8 cm no ponto médio da dobra inguinal para facilitar a visualização e garantir a colocação precisa da sonda dentro da membrana perivascular. Dissecar de forma direta o tecido subcutâneo para expor a artéria e veia femoral, a veia safena e a veia superficial da parede abdominal (Figura 2E).
  6. Envolva a camada externa da agulha de perfuração em um tubo rasgável para criar uma agulha-guia.
  7. Confirme que não há vasos sanguíneos sob a pele no local da perfuração. Insira a agulha verticalmente pela pele e ajuste o ângulo para 45° para entrar no espaço do tecido ao redor da veia safena.
  8. Avance a agulha na direção do fluxo sanguíneo dentro da veia safena, mantendo contato próximo com a parede do vaso durante todo o procedimento. Use um estereoscópio para monitorar a posição da agulha em tempo real e evitar lesões vasculares ou contaminação do sangue. Em seguida, guie a agulha para a adventícia da veia femoral (Figura 2F).
  9. Retire a agulha de perfuração mantendo o tubo de remoção no lugar dentro do tecido (Figura 2G).
  10. Insira a sonda de fluido tecidal no cateter rasgável e abra cuidadosamente o cateter para expor o local da amostragem e retirar a amostra de tecido (Figura 2H). Certifique-se de que a sonda esteja posicionada com precisão dentro da adventícia da artéria e veia femoral (Figura 2I). Fixe a sonda na pele antes de suturar (Figura 2J). Realize todos os procedimentos sob condições assépticas rigorosas, tomando cuidado para evitar perturbações da adventícia vascular e para prevenir inflamação tecidular ou reações de corpos estranhos que possam comprometer a coleta de fluido tecidual.
  11. Verifique a posição da sonda fotografando uma régua cirúrgica junto com a sonda fixa para documentar o comprimento exposto e apresente esta imagem conforme mostrado na Figura 2I.
  12. Faça uma incisão cutânea de 2 cm aproximadamente 0,5 cm lateral à linha média do pescoço, começando 1 cm acima da incisura esternal.
  13. Disseca de forma direta através do músculo esternocleidomastoide para expor a veia jugular, que fica lateral à artéria carótida e é identificada por sua coloração azul-escura. Use um cotonete umedecido para separar suavemente a fáscia, tomando cuidado para evitar contato com o nervo vago.
  14. Usando pinças microscópicas, eleve suavemente a membrana externa da veia jugular e remova cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor para obter pelo menos 1 cm de comprimento do vaso livre. Coloque um ponto de seda 4-0 proximalmente para servir como ligadura reserva (Figura 2K).
  15. Para a perfuração venosa, faça uma incisão oblíqua em um ângulo de 45°, aproximadamente um terço do diâmetro do vaso. Use microfórceps para abrir suavemente a incisão e criar uma entrada para a inserção da sonda.
  16. Insira cuidadosamente a ponta da sonda na veia e avance-a lentamente até uma profundidade de 3,5-4,0 cm, garantindo que a ponta alcance a entrada do átrio direito (Figura 2L).
  17. Fixe a sonda apertando a ligadura de seda proximal com um nó duplo. Feche a camada muscular usando pontos de Vicryl 4-0, depois suture a pele com pontos interrompidos. Fixe a parte externa da sonda à superfície da pele para evitar deslocamento.

4. Coleta de amostras e recuperação da sonda

  1. Coleta da amostra: Avalie a relação entre diálise tecidular e transferência da amostra para o tubo de coleta. Mantenha um volume total de 20 μL entre a sonda e o coletor.
    1. Deixe um período de 20 minutos para a amostra passar pela sonda e pelo tubo e chegar ao final do tubo para coleta com uma vazão de 1 μL/min. Colete um volume adequado para alcançar a concentração necessária para o ensaio. Colete 30 μL de dialisato por tubo coletor.
  2. Armazenamento da amostra: Pré-resfriar tubos de coleta de polipropileno de 0,5 mL a 4 °C. Imediatamente após a coleta, tampe os tubos, congele-os rapidamente em nitrogênio líquido por 30 segundos e transfira para um freezer a -80 °C em até 2 minutos.
  3. Amostra de base: Equilíbrio completo da amostra antes de iniciar a coleta da amostra. Colete três amostras por rato sob anestesia para estabelecer uma linha base de medição estável.
  4. Remoção da sonda: Retire a sonda da cabeça do animal após a conclusão da coleta da amostra e coloque-a em um frasco de armazenamento contendo 1% de heparina de sódio. Eutanasiar o animal por inalação de excesso de isoflurano.
  5. Preservação da sonda: Enxágue a sonda cuidadosamente com soro fisiológico e armazene-a em um frasco contendo solução salina. Lave os tubos com soro fisiológico usando uma seringa para evitar o crescimento microbiano. Reutilize a sonda somente se ela mantiver fluxo suficiente e a membrana permanecer intacta.

5. Análise de dados

  1. Realize Análise de Componentes Principais (PCA), Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais Ortogonais (OPLS-DA) e análises estatísticas adicionais usando o MetaboAnalyst 6.0. Use o OPLS-DA especificamente para determinar a Importância Variável na Projeção (VIP).
  2. Aplicar testes não paramétricos, incluindo avaliações de valor P e análise de alteração de dobras, para examinar metabólitos diferenciais. Estabeleça limiares críticos para triagem de metabólitos diferenciais como VIP > 1, FC ≥ 2 ou FC ≤ 0,5, e P < 0,05.
  3. Anote os metabólitos identificados usando o Banco de Dados de Compostos KEGG.

6. HPLC - MS/MS

  1. Realize a quantificação de metabólitos usando um espectrômetro de massa quadrupolo triplo AB Sciex 6500+ equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) operada em modo de íons positivos.
  2. Ajuste os parâmetros do instrumento da seguinte forma: gás cortina, 40 psi; gás de colisão, 10 psi; gás fonte de íons 1 (GS1), 50 psi; gás fonte de íons 2 (GS2), 55 psi; tensão de pulverização iônica, 4500 V; e temperatura de origem, 550 °C.
  3. Operar o sistema em modo de monitoramento de reação múltipla (MRM). Otimize as transições MRM, potenciais de desclusterização e energias de colisão individualmente para cada metabólito. Realize aquisição de dados usando o software Analyst 1.7.1 e análise quantitativa usando MultiQuant 3.0.3.
  4. Para separação cromatográfica, utilize-se uma coluna C18 (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) mantida a 45 °C. Prepare as fases móveis como (A) 0,1% de ácido fórmico em água e (B) 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila. Ajuste a vazão para 0,35 mL/min e o volume de injeção para 6 μL. Mantenha a temperatura do autoamostrador em 4 °C antes da análise.
    NOTA: Neste estudo, cada corrida durou aproximadamente 25 minutos no total.

Resultados

O conjunto de dados foi normalizado aplicando soma e transformações logarítmicas, e então passou por um conjunto abrangente de análises estatísticas. Foi realizada uma Análise de Componentes Principais (ACP) (Figura 3A), que revelou separações distintas e destacou diferenças metabólicas. Posteriormente, foi desenvolvido um modelo de Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais Ortogonais (OPLS-DA), com as pontuações resultantes representadas na Figura 3B, demonstrando a eficácia discriminatória do modelo. Na avaliação de 618 metabólitos, gráficos vulcânicos comparando AISF e amostras de sangue identificaram 146 metabólitos diferenciais, com fluido tecidual apresentando metabólitos tanto regulados para baixo quanto para cima (Figura 3C). Além disso, foi criado um mapa de calor para fornecer uma visão comparativa dos 50 principais metabólitos diferenciais (Figura 3D).

Para avaliar a confiabilidade do método de amostragem, serotonina e ácido lático foram utilizados como controles positivos, representando componentes do fluido tecidular e sangue, respectivamente. Os resultados alinharam-se com os padrões de distribuição estabelecidos desses componentes em vários fluidos corporais, conforme ilustrado na Figura 4. A Figura Suplementar 1 mostra a estabilidade do lactato e da serotonina em alíquotas de microdiálisado armazenadas a -80 °C.

Os 146 metabólitos diferenciais foram sistematicamente classificados em várias categorias: nucleósidos, nucleotídeos e seus análogos; ácidos graxos e seus derivados; aminoácidos, peptídeos e seus análogos; carboidratos e conjugados de carboidratos; ácidos orgânicos e seus derivados; aminas biogênicas; purinas e pirimidinas; vitaminas e esteroides; assim como outros compostos (Figura 5A). A Tabela Suplementar 1 mostra os metabólitos diferenciais detectados no sangue. Análises de mapas de calor elucidam ainda mais os padrões de enriquecimento de aminas biogênicas e aminoácidos, peptídeos e seus análogos em diversos fluidos corporais (Figura 5B,C). A análise diferencial de enriquecimento de metabólitos é apresentada na Figura 6. A Tabela Suplementar 2 lista o coeficiente de variação (CV) para quinze metabólitos selecionados aleatoriamente em três amostras consecutivas de tecido perivascular e fluido.

Figura 1
Figura 1: Imagens do aparelho experimental. (A) Coletor de frações refrigerado. (B) Bomba de seringa. (C) Microseringas. (D) Instrumentos cirúrgicos, incluindo tesouras vasculares e pinças, etc. (E) Máquina de anestesia. (F) Sondas de microdiálise. (G) Sondas de microdiálise, agulha guia de tecido e um tubo rasgável. (H) Conjuntos de agulhas guia de tecido. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2
Figura 2: Os passos principais do estudo. (A) Uma representação esquemática que representa um diagrama ilustrando a posição do local cirúrgico e a orientação da sonda. (B) Identificação de junções vasculares críticas para garantir a observação precisa dos locais de colocação da sonda. (C) Inserção da agulha-guia que penetra a pele e avança para o espaço do tecido. (D) A retração das agulhas guia é retirada, deixando o tubo rasgável dentro do tecido. (E) A sonda de microdiálise é introduzida no tecido pelo canal estabelecido. (F) Retração suave do tubo rasgável. O tubo rasgável é suavemente retraído após fixar a sonda no lugar. (G) Visualização de sondas posicionadas no epitélio dos vasos arteriosos e venosos do femoral. (H) Separação do tecido da veia jugular. (I) Colocação da sonda na veia jugular. (J) A sonda de microdiálise é fixada na superfície da pele. (K) isolamento da veia jugular. (L) Inserção da sonda na veia jugular. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3
Figura 3: Análise estatística multivariada do fluido intersticial (ISF) e do sangue. (A) Os dados foram reduzidos para enfatizar separações significativas, demonstrando diferenças distintas entre ISF e componentes sanguíneos. (B) As pontuações do modelo de análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA) indicam valores R2Y e Q2 de 0,925 e 0,811, respectivamente. (C) O gráfico vulcânico mostra 146 metabólitos diferenciais, com 85 metabólitos com regulação negativa e 61 regulados para cima na ISF. (D) Correspondentemente, mapas de calor que contrastam os 30 principais metabólitos do ISF e do sangue revelam uma distinção clara entre os dois conjuntos de componentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4
Figura 4: A apresentação de uma série de gráficos em caixa elucidou os níveis de enriquecimento de lactato e serotonina no ISF e no sangue. Todos os pontos de dados representam a média ± SEM; Barras de erro são mostradas para todos os painéis quantitativos. O painel (A) ilustra que as amostras de ISF apresentam um enriquecimento significativamente maior de lactato em comparação com amostras de sangue. Em contraste, o painel (B) demonstra que a serotonina é mais rica em amostras de sangue, que simultaneamente apresentam níveis mais baixos de lactato. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5
Figura 5: O gráfico de anel de classificação de metabólitos diferenciais e o mapa térmico de aminoácidos, peptídeos e análogos, bem como aminas biogênicas, estão representados. (A) Cada bloco de cor corresponde a uma classe distinta de metabólitos. Aminoácidos, peptídeos e análogos representam a maior categoria, representando 19,29% do total, seguidos por nucleósidos, nucleotídeos e análogos (15%), ácidos graxos e derivados (12,86%), carboidratos e conjugados de carboidratos (7,86%), ácidos orgânicos e derivados (10%), aminas biogênicas (7,14%), purinas/pirimidinas (5,71%), vitaminas e esteroides (8,57%) e outros compostos, incluindo indolis, azepinas, piridinas e benzenos, com 13,57%. (B) No fluido intersticial (ISF), os níveis de enriquecimento de compostos como Desoxicarnitina e Espermidina na categoria de aminas biogênicas são significativamente elevados em comparação com os do sangue, enquanto os níveis de Serotonina (D4), Serotonina, Triptamina e compostos relacionados são significativamente reduzidos. (C) Na ISF, a maioria dos metabólitos associados a aminoácidos, peptídeos e análogos é marcadamente menor do que os observados no sangue. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6
Figura 6: A análise de enriquecimento de conjuntos de metabólitos (MSEA) do líquido intersticial normal revelou que a atividade metabólica está predominantemente distribuída por vias relacionadas à produção de energia, homeostase redox e renovação de aminoácidos. As vias mais enriquecidas incluem o metabolismo do butanoato, o metabolismo das purinas e o metabolismo da glutátio, refletindo a manutenção do suprimento de energia mitocondrial e a capacidade antioxidante sob condições fisiológicas. Além disso, várias vias relacionadas a aminoácidos, como o metabolismo da arginina e da prolina, metabolismo do triptofano e metabolismo da cisteína e metionina, estão representadas, indicando interconversão ativa de aminoácidos e regulação do equilíbrio de nitrogênio no microambiente extracelular. Esses achados sugerem que o metaboloma intersticial normal mantém um equilíbrio dinâmico entre processos bioenergéticos, defesa oxidativa e metabolismo dos aminoácidos, apoiando a homeostase dos tecidos e a estabilidade microcirculatória. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Estabilidade do lactato e da serotonina em alíquotas de microdialisado armazenadas a -80 °C. Os dados são médias ± SEM (n = 6 replicações por ponto de tempo). Nenhum analito se desviou >5% da linha de base ao longo de 72 horas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela suplementar 1: Metabólitos diferenciais detectados no sangue e no microdiálisado do líquido intersticial advential. Isso inclui nome do metabólito, mudança de dobra (FC), valor P do teste t de Student e VIP (OPLS-DA). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Coeficiente de variação (CV) para quinze metabólitos selecionados aleatoriamente em três amostras consecutivas de tecido perivascular e fluido. Todos os currículos são <20%. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O fluido intersticial (ISF) é o microambiente aquoso que envolve cada célula do tecido e constitui aproximadamente 75% do compartimento extracelulardo fluido 8,9. Gerado pela filtração capilar do plasma, o ISF não possui o teor celular e alto de proteínas do sangue, mas retém eletrólitos, pequenos solutos eágua 9. Essa composição posiciona a ISF como a interface pivotal entre os mundos vascular e celular. Funcionalmente, a ISF é um meio de transporte dinâmico. Ele transporta oxigênio, glicose, aminoácidos e micronutrientes da corrente sanguínea para as células, enquanto simultaneamente coleta dióxido de carbono, ureia e outros resíduos metabólicos para retorno àcirculação. O fluido também atua como lubrificante e amortecedor, estabilizando a pressão osmótica intersticial, o pH e o equilíbrioiônico 11. Além do metabolismo, a ISF apoia a vigilância imunal ao transportar leucócitos, anticorpos e citocinas através dos espaços tecidulares e atua como uma via de comunicação para hormônios e sinaisparacrinos 12,13. Comparado ao sangue, o ISF é essencialmente um filtrado14 livre de células e baixo teor de proteínas. O sangue, confinado à árvore vascular, contém glóbulos vermelhos e brancos, plaquetas e altas concentrações de albumina e fatores de coagulação. Os níveis de oxigênio e nutrientes são mais altos no sangue e progressivamente menores no ISF devido à captação celular, enquanto os resíduos se acumulam no ISF antes de entrarem no retorno linfáticoou venoso 10. A ausência de proteínas e células grandes no ISF normal minimiza a pressão oncótica e permite uma rápida difusão, mas estados inflamatórios podem alterar transitoriamente esseperfil 15.

No entanto, o estudo da ISF permanece limitado devido à ausência de metodologias de amostragem diretas, rápidas e confiáveis. Os métodos atuais incluem adesivos microagulhas (MN), bolhas de sucção, iontoforese reversa, ablação térmica e microdiálise. Os patches MN criam microcanais para extração de ISF através da pele, com variantes de núcleo extraindo ISF em menos de 30 s e MNs hidrogel osmóticos em cerca de 3 minutos. Esses podem ser combinados com sensores para análise on-patch, mas são limitados pelo volume e exigem equilíbrio entre resistência e inchaço. Bolhas de sucção fornecem ISF puro com contaminação sanguínea mínima, mas são invasivas, dolorosas elentas 16, 17, 18. A iontoforese reversa (RI) utiliza baixas correntes elétricas para transportar analitos carregados, como glicose e íons de lítio, para a superfície da pele para monitoramento não invasivo. No entanto, enfrenta desafios como baixa produção, variabilidade entre indivíduos e potencial irritação dapele 19,20. A administração transdérmica (TA) interrompe o estrato córneo com aquecimento localizado para permitir que o ISF entre passivamente em microcanais hidrofílicos. Embora seja mais simples no design do dispositivo, ele coleta menos de 5 μL de fluido, exigindo detecção altamente sensível e gerenciamento térmico cuidadoso para evitarqueimaduras 21,22. Em contraste, a microdiálise (DM), que depende da difusão entre sondas semipermeáveis implantadas, oferece seletividade molecular única por meio de membranas de corte de peso molecular ajustável (MWCO), como 10 kDa para glicose e 100 kDa para proteínas ecitocinas 23,24. Essa técnica suporta amostragem contínua e minimamente invasiva. No entanto, a MD é operacionalmente complexa, requer calibração in vivo e apresenta taxas variáveis de recuperação para espécies hidrofóbicas. Notavelmente, a MD é a única técnica capaz de isolar de grandes biomoléculas por tamanho25. Estudos comparativos de diálisado coletados próximos à adventícia vascular versus o sangue demonstram perfis distintos de lactato e serotonina, validando assim a estabilidade e especificidade da abordagem da DM.

Estudos em animais mostraram que, regulado sinergicamente pelo coração e pelos pulmões, o ISF pode fluir nas adventícias associadas a grandes artérias, veias e nervosperiféricos 5,9. Normalmente, o ISF contém metabólitos derivados diretamente do plasma, bem como sintetizados localmente nostecidos 26,27,28. É plausível, portanto, que as sobreposições e diferenças identificadas dos metabólitos na AISF e no plasma representem o envolvimento do sistema circulatório da ISF no transporte e eliminação de nutrientes e metabólitos nos tecidos ao longo da vasculatura. A técnica baseada em microdiálise introduzida aqui para a amostragem do AISF irá aprimorar significativamente os estudos da circulação sistêmica do ISF na regulação do metabolismo em múltiplos órgãos e tecidos em todo o corpo.

A membrana de corte de peso molecular (MWCO) de 20 kDa utilizada neste estudo é idealmente projetada para a recuperação quantitativa de pequenos metabólitos, incluindo glicose, lactato, piruvato e aminoácidos. No entanto, consistentemente subamostra ou exclui completamente numerosas macromoléculas biologicamente significativas, como citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e enzimas extracelulares. Análises clínicas e metodológicas destacaram que cateteres padrão de 20 kDa são eficazes na coleta de pequenos metabólitos hidrofílicos, mas apresentam baixas taxas de recuperação para proteínas e mediadoresinflamatórios 29. Consequentemente, membranas com MWCOs mais altos (por exemplo, 100 kDa) ou estratégias alternativas de amostragem são necessárias para quantificação precisa dascitocinas 30,31. Portanto, pesquisas futuras conduzidas pelo nosso grupo empregarão membranas com MWCOs maiores para caracterizar a composição macromolecular do fluido intersticial periférico. Neste estudo, diálisados foram coletados sob anestesia geral. A microdiálise já foi validada anteriormente em animais acordados e em movimento livre, e várias técnicas de microperfusão de "fluxo aberto" foram adaptadas para uso em modelosconscientes 32. No entanto, adaptar nosso projeto de sonda e protocolo de implantação para uso em animais acordados exigirá enfrentar desafios relacionados ao amarramento, estresse animal, estabilidade da sonda, artefatos de movimento e permeabilidade a longo prazo. Atualmente estamos no processo de desenvolvimento de um sistema leve de tether-swivel e planejamos realizar amostragem consciente em nosso estudo subsequente.

Divulgações

Não há conflitos financeiros de interesse a serem divulgados.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Programa Nacional Chave de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2025YFC3507601) e pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para os institutos centrais de pesquisa em bem-estar público (Nº ZZ-YC2023007).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de monitoramento de ECGAD Instruments, AustráliaPowerLabEquipamento
PinçasF.S.T. (Fine Science Tools) Alemanha11252-00Instrumentos cirúrgicos
Heparina sódicaSigma-Aldrich, EUA9041-08-1Material
Cromatografia líquida de alta performance em tandem Espectrômetro de Massa (HPLC-MS/MS)SCIEX, EUAExionLC-20ACEquipamento
Tesoura padrão IRISF.S.T. (Fine Science Tools) Alemanha14060-09Instrumentos cirúrgicos
IsofluranoRWD Ciências da Vida, RPCR510-22-10Material
Sistema de Anestesia de Baixo FluxoKent Scientific, EUASomnoSuiteEquipamento
Fluido de Perfusão de Microdiálise T1Microdiálise CMA, SuéciaP000034Material
Sonda de microdiálise, 20 EliteMicrodiálise CMA, Suécia8010436Material
Seringas de microdiálise 1 mL GastightMicrodiálise CMA, Suécia8309020Material
Coletor de Frações RefrigeradoMicrodiálise CMA, Suécia470Equipamento
Tubo Dividido para Sondas CMA 20Microdiálise CMA, Suécia8309019Material
Microscópio estereoscópicoOlympus, JapãoSZ61Equipamento
Bomba de SeringaCMA MD AB, Suécia800310Equipamento

Referências

  1. Reed, R. K., Rubin, K. Transcapillary exchange: role and importance of the interstitial fluid pressure and the extracellular matrix. Cardiovasc Res. 87 (2), 211-217 (2010).
  2. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiol Rev. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  3. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  4. Jain, R. K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia. Cancer Cell. 26 (5), 605-622 (2014).
  5. Li, H., et al. Regulation of interstitial fluid flow in adventitia along vasculature by heartbeat and respiration. iScience. 27 (4), 109407(2024).
  6. Clough, G. F. Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7 (3), E686-E692 (2005).
  7. Fadnes, H. O., Aukland, K. Protein concentration and colloid osmotic pressure of interstitial fluid collected by the wick technique: Analysis and evaluation of the method. Microvasc Res. 14 (1), 11-25 (1977).
  8. Brinkman, J. E., Dorius, B., Sharma, S. Physiology, body fluids. , StatPearls. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482447/ (2025).
  9. Li, H., et al. Active interfacial dynamic transport of fluid in a network of fibrous connective tissues throughout the whole body. Cell Prolif. 53 (2), e12760(2020).
  10. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Front Neuroanat. 15, 665803(2021).
  11. Hussain, N. M., Amin, B., O'Halloran, M., Elahi, A. Development and characterization of interstitial-fluid-mimicking solutions for pre-clinical assessment of hypoxia. Diagnostics. 13 (19), 3125(2023).
  12. Handly, L. N., Pilko, A., Wollman, R. Paracrine communication maximizes cellular response fidelity in wound signaling. eLife. 4, e09652(2015).
  13. Fan, D., Creemers, E. E., Kassiri, Z. Matrix as an interstitial transport system. Circ Res. , (2014).
  14. Friedel, M., et al. Opportunities and challenges in the diagnostic utility of dermal interstitial fluid. Nat Biomed Eng. 7 (12), 1541-1555 (2023).
  15. Levick, J. R., Michel, C. C. Microvascular fluid exchange and the revised Starling principle. Cardiovasc Res. 87 (2), 198-210 (2010).
  16. Jiang, X., et al. Microneedle-based sampling of dermal interstitial fluid using a vacuum-assisted skin patch. Cell Rep Phys Sci. 5 (6), 101975(2024).
  17. Wu, Z., et al. Interstitial fluid-based wearable biosensors for minimally invasive healthcare and biomedical applications. Commun Mater. 5 (1), 33(2024).
  18. Samant, P. P., Prausnitz, M. R. Mechanisms of sampling interstitial fluid from skin using a microneedle patch. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4583-4588 (2018).
  19. Sieg, A., Guy, R. H., Delgado-Charro, M. B. Electroosmosis in transdermal iontophoresis: implications for non-invasive and calibration-free glucose monitoring. Biophys J. 87 (5), 3344-3350 (2004).
  20. Nair, A. B., Goel, A., Prakash, S., Kumar, A. Therapeutic drug monitoring by reverse iontophoresis. J Basic Clin Pharm. 3 (1), 207-213 (2012).
  21. O'Brien, D. J., et al. A needle-free transdermal patch for sampling interstitial fluid. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (9), 2573-2580 (2023).
  22. Yang, J., et al. Microneedle-integrated sensors for extraction of skin interstitial fluid and metabolic analysis. Int J Mol Sci. 24 (12), 9882(2023).
  23. Stenken, J. A., et al. How minimally invasive is microdialysis sampling? A cautionary note for cytokine collection in human skin and other clinical studies. AAPS J. 12 (1), 73-78 (2009).
  24. Dorothee, S., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (5), 1322-1330 (2024).
  25. Kho, C. M., et al. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Mol Neurobiol. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  26. Oharazawa, A., et al. Metabolome analyses of skin dialysate: insights into skin interstitial fluid biomarkers. J Dermatol Sci. 114 (3), 141-147 (2024).
  27. Samant, P. P., et al. Sampling interstitial fluid from human skin using a microneedle patch. Sci Transl Med. 12 (571), eaaw0285(2020).
  28. Niedzwiecki, M. M., et al. Human suction blister fluid composition determined using high-resolution metabolomics. Anal Chem. 90 (6), 3786-3792 (2018).
  29. Hillman, J., et al. Microdialysis of cytokines: methodological considerations, scanning electron microscopy, and determination of relative recovery. J Neurosci Methods. 179 (1), 29-33 (2009).
  30. Buchholtz, D. A., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (8), 1942-1951 (2024).
  31. Klein, J., et al. Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres. Anal Chem. 82 (18), 7850-7855 (2010).
  32. Scheller, H., et al. Observational evaluations of mice during cerebral microdialysis for pediatric brain tumor research. PLoS One. 9 (5), e98256(2014).

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