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Artigo de método

Desenvolvimento e Validação de uma Metodologia para Estabelecimento de Modelos de Ratos Obesos com Pâncreas Gorduroso Típico

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DOI:

10.3791/69553

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11 de novembro de 2025

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1Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research of Ministry of Education, Nanjing University of Chinese Medicine, 2Department of Acupuncture and Moxibustion, Yangzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, 3Department of Specialty Medicine, Ohio University, 4Research Department, Swiss University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo oferece um método reprodutível e padronizado para estabelecer modelos de ratos obesos que apresentam obesidade simples, comumente caracterizada por pâncreas gorduroso. Também inclui protocolos detalhados para amostragem de tecido pancreático e imuno-histoquímica.

Resumo

A obesidade emergiu como uma epidemia de saúde global predominante, com quase metade da população mundial agora classificada como sobrepeso ou obesa. Uma característica patológica importante em indivíduos obesos é a deposição ectópica de lipídios em tecidos não adiposos, incluindo o pâncreas - uma condição denominada esteatose pancreática ou pâncreas gorduroso. Em modelos de roedores induzidos por dieta rica em gordura (HFD), a esteatose pancreática precede consistentemente a esteatose hepática, ressaltando a suscetibilidade particular do pâncreas ao acúmulo de lipídios. Esse envolvimento precoce posiciona o pâncreas como um órgão crítico para a compreensão da desregulação metabólica na obesidade. Embora os ratos obesos induzidos por dieta (DIO) recapitulem aspectos centrais da progressão da doença humana, modelos animais bem caracterizados que exibem de forma confiável esse fenótipo pancreático permanecem escassos na literatura.

Uma consideração metodológica significativa na modelagem da obesidade humana é o momento da introdução do HFD. Muitos modelos existentes iniciam o HFD durante o período de desmame, o que pode introduzir efeitos confusos na programação metabólica do desenvolvimento que não refletem totalmente a obesidade humana, que se desenvolve principalmente no pós-desenvolvimento. Em contraste, o presente estudo estabelece um protocolo padronizado no qual o HFD é introduzido após o desmame. Essa abordagem imita com mais precisão a trajetória humana comum do início da obesidade na idade adulta, evita adaptações metabólicas no início da vida e resulta em uma progressão fisiologicamente mais relevante para a esteatose pancreática.

Esta pesquisa fornece uma estrutura detalhada e reprodutível para gerar um modelo de obesidade em ratos caracterizado por patologia proeminente do pâncreas gorduroso. A metodologia inclui uma fase de aclimatação de 1 semana, um período de indução de HFD de 14 semanas começando após o desmame e coleta sistemática de tecido. Duas vias de processamento de tecidos são descritas: congelamento instantâneo para análises moleculares (por exemplo, Western blotting) e fixação de perfusão de paraformaldeído para avaliações morfológicas (por exemplo, IHC, H&E). Este modelo oferece uma plataforma robusta para investigações mecanicistas sobre a disfunção metabólica pancreática associada à obesidade.

Introdução

A obesidade simples é definida como obesidade que existe de forma independente, sem outras comorbidades, atribuída principalmente ao desequilíbrio energético resultante de estilos de vida não saudáveis, como padrões alimentares inadequados e atividade física insuficiente1. A obesidade contribui significativamente para o aumento da incidência de doenças não transmissíveis entre populações mais jovens, caracterizada por altas taxas de prevalência, início precoce e complicações multissistêmicas, posicionando-a como um desafio crítico de saúde pública global2. O pâncreas gorduroso é uma condição marcada pela deposição ectópica de lipídios neste órgão não adiposo durante a desregulação metabólica. O pâncreas gorduroso reflete uma interação crítica entre o tecido adiposo e a fisiopatologia pancreática. O acúmulo excessivo de gordura pancreática desloca os tecidos normais do acinar e das ilhotas, induzindo comprometimentos funcionais duplos nas capacidades exócrinas e endócrinas 3,4. Esse processo patológico interrompe as relações α/β células, promove a desdiferenciação das células β com subsequente perda da função secretora de insulina5 e medeia o dano lipotóxico direto às células β6. Concomitantemente, a proliferação de células α e a liberação desregulada de insulina exacerbam a instabilidade glicêmica, acelerando a progressão para diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e suas complicações associadas7.

A investigação da patogênese do pâncreas gorduroso revela novos mecanismos subjacentes à progressão da doença metabólica8. Embora pesquisas anteriores sobre obesidade enfatizassem a esteatose hepática, evidências emergentes identificam a deposição de lipídios pancreáticos como um evento anterior na desregulação metabólica9. Essa mudança de paradigma possibilita a construção de um modelo patológico de duplo órgão para obesidade simples, integrando esteatose pancreática e hepática10. Estudar sua conversa cruzada pode elucidar caminhos críticos em todo o espectro da doença, abrangendo distúrbio do metabolismo lipídico, obesidade, resistência à insulina e diabetes, oferecendo novos insights sobre os mecanismos da doença11. No processo patológico do pâncreas, a manifestação inicial é a deposição significativa de gordura pancreática, acompanhada por expansão substancial de adipócitos pancreáticos. Isso é predominantemente observado no aspecto ventral das regiões pancreáticas da cabeça, pescoço e corpo, e está localizado principalmente nas áreas intersticiais entre as células acinares e das ilhotas. Ao mesmo tempo, a inflamação crônica de baixo grau do pâncreas está presente, enquanto as funções endócrina e exócrina permanecem praticamente intactas neste estágio12,13. A infiltração extensa de gordura prejudica ainda mais a função das células β pancreáticas por meio da lipotoxicidade e suprime a atividade da insulina. Durante essa fase, as células acinares são progressivamente substituídas por adipócitos, contribuindo para o desenvolvimento do DM214,15. Embora o diabetes mellitus não seja um fator de risco independente para câncer de pâncreas, pacientes com história de pancreatite aguda e diabetes apresentam um risco significativamente elevado de desenvolver câncer de pâncreas16.

As análises anatômicas macroscópicas quantificam a gravidade da esteatose pancreática e os padrões de infiltração, enquanto as avaliações da IHQ no nível microscópico caracterizam a morfologia das células acinares, o posicionamento nuclear, a frequência de vacuolização e a dinâmica da população celular17. Essa abordagem multimodal, abrangendo observação anatômica macroscópica a IHQ de resolução celular, permite o estadiamento abrangente da patologia pancreática ao longo da progressão da doença. O presente estudo detalha um protocolo padronizado que abrange uma aclimatação de 1 semana, uma indução de obesidade de 14 semanas em ratos adultos e processamento otimizado do tecido pancreático para análise morfológica, estabelecendo uma estrutura robusta para investigar distúrbios metabólicos associados à esteatose.

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Protocolo

O procedimento de tratamento animal foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Nanjing (202006A016) e cumpriu as diretrizes ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments), diretrizes éticas, orientações sobre a operação da Lei de Animais (Procedimentos Científicos) de 1986 e diretrizes associadas, Diretiva da UE 2010/63 para a proteção de animais usados para fins científicos. Todos os animais experimentais foram anestesiados de acordo com os procedimentos aprovados de anestesia com roedores antes da dissecção. O procedimento foi organizado em três componentes distintos.

1. Estabeleça um modelo de rato obeso

  1. Animais e grupos experimentais
    1. Selecione ratos Sprague-Dawley (SD) machos com 4 semanas de idade (80-120 g) de uma cepa sensível à dieta rica em gordura (HFD).
    2. Aclimate todos os ratos a uma dieta de manutenção por uma semana e, em seguida, divida-os aleatoriamente em dois grupos: o grupo controle e o grupo modelo.
    3. Substitua a dieta de manutenção por HFD para o grupo modelo após uma semana, mantendo o grupo controle na dieta original. Mantenha ambos os grupos em suas dietas por 14 semanas. A composição do HFD é detalhada na Tabela 1 e a formulação padrão da ração de manutenção está na Tabela 2.
  2. Condições de alimentação e parâmetros experimentais
    1. Parâmetros ambientais: temperatura 22 ± 2 °C, umidade 50 ± 10%, ciclo claro/escuro de 12 h e livre acesso a água e alimentos.
  3. Indicadores de acompanhamento
    1. Registre o peso corporal e a ingestão de alimentos semanalmente em um horário fixo.
      NOTA: Fazê-lo à noite pode minimizar o estresse e se alinhar com os padrões de atividade diurna / noturna18.
    2. Traçar uma curva de crescimento do peso corporal utilizando os dados registados.
    3. Defina a modelagem bem-sucedida da obesidade como quando o peso corporal excede 20% do grupo de controle da mesma idade.
IngredienteConteúdo (g/kg)Principais nutrientes fornecidos
Ração em pó comum365Fornecimento nutricional básico de carboidratos, proteínas vegetais, gorduras, complexos vitamínicos, minerais, etc.
Banha310Ácidos graxos saturados, ácidos graxos insaturados
Caseína250Aminoácidos essenciais
Colesterol10Colesterol
Mistura de celulose e minerais60Fibra, cálcio, fósforo, sódio, etc.
DL-Metionina Metionina/Metionina Aminoácidos3Aminoácidos essenciais
Levedura1Vitaminas B, β-glucano, etc.
NaCl1NaCl

Tabela 1: Formulação especial de HFD para estabelecer DIO em modelos de ratos. A tabela detalha a composição específica do HFD usado neste estudo para o grupo modelo, que foi administrado desde o final do período de aclimatação até a coleta do tecido.

IngredienteConteúdoUnidade
Humidade12.196%
Proteína bruta (PB%)18.272%
Energia digestível (DE)3.186Mcal/kg
Energia Metabolizável (EM)2.939Mcal/kg
Energia líquida (NE)2.228Mcal/kg
Extrato Etéreo (EE%)4.417%
Fibra bruta (CF%)3.677%
Cálcio (Ca%)0.991%
Fósforo total0.681%
(Total P%)
Fósforo não fitato0.19%
Sal0.407%
Lisina1.118%
Lisina Digerível0.813%
Metionina0.53%
Treonina0.779%
Triptofano0.221%
Cobre ()22.06mg/kg
Ferro (Fe)173.69mg/kg
Manganês (Mn)102.1176mg/kg
Zinco (Zn)60.3687mg/kg

Tabela 2: Fórmula alimentar de manutenção padrão em ratos. A tabela apresenta a formulação da ração de manutenção padrão, que foi fornecida a todos os ratos durante a fase de aclimatação e ao grupo controle durante toda a duração do estudo.

2. Colheita de tecidos

  1. Preparo pré-operatório
    1. Tratamento em jejum: restrição alimentar de 12 h antes da eutanásia para minimizar a interferência do conteúdo intestinal nas análises bioquímicas.
    2. Anestesia: Administre isoflurano por inalação para anestesia profunda (concentração de indução de 4%, concentração de manutenção de 1,5-2%). O aparelho de anestesia foi equipado com um vaporizador de isoflurano, e a concentração anestésica foi mantida em 1,5-2. Como referência para o preparo, o consumo físico de isoflurano líquido foi de aproximadamente 0,5 mL-0,8 mL por rato durante todo o procedimento.
    3. Monitore a profundidade da anestesia: Acompanhe continuamente a frequência respiratória e os reflexos da córnea. Mantenha um estado anestésico sustentado durante todo o procedimento para evitar autólise pancreática post-mortem.
    4. Gerenciar anestesia insuficiente: Se a profundidade da anestesia for inadequada ou a consciência se repetir, administre imediatamente uretano a 20% por via intraperitoneal para anestesia suplementar (50 mg/kg) e verifique novamente os sinais vitais antes de continuar. Prepare uma solução de uretano a 20% dissolvendo o pó de uretano em solução salina.
      NOTA: A anestesia com isoflurano é o método em conformidade com os requisitos éticos do Centro de Animais Experimentais da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing. Para este procedimento terminal, a injeção intraperitoneal de uretano a 20% pode ser usada como uma alternativa aceitável. No entanto, as evidências existentes sugerem que o isoflurano pode oferecer um perfil de segurança mais alto do que a cetamina em roedores19.
  2. Colheita de tecidos frescos
    1. Desinfecção da pele: Pulverize etanol a 75% rapidamente em todo o corpo (1-2 s) para evitar a contaminação dos órgãos abdominais pelos pelos.
    2. Fixação de posição: Posicione o rato em decúbito dorsal na mesa de dissecção e fixe todos os quatro membros de forma segura com pinos de cabeça grande.
    3. Segure a pele abdominal com uma pinça na mão esquerda e faça uma incisão na pele ao longo da linha média (do xifóide ao púbis) usando uma tesoura na mão direita. Disseque sem corte a fáscia subcutânea para separar o tecido conjuntivo e cortar o músculo reto abdominal e o peritônio ao longo da mesma linha média.
    4. Identificação do pâncreas: desloque suavemente o intestino para a esquerda para visualizar o estômago, o baço e o duodeno. O baço está ligado à cauda do pâncreas e o estômago está próximo ao pâncreas.
    5. Dissecção rápida: Eleve suavemente o baço com uma pinça e isole o pâncreas cortando progressivamente suas inserções no baço, estômago e mesentério duodenal. Devido à sua textura frágil, evite o clampeamento direto do parênquima pancreático e preserve os ductos/vasos sanguíneos pancreáticos para evitar o rompimento do tecido.
    6. Preservação do tecido: Enxágue o pâncreas dissecado rapidamente com PBS gelado (1× solução salina tamponada com fosfato, PH 7.4) ou solução salina para remover o sangue residual. Transfira imediatamente o pâncreas para um tubo de congelamento de 2 mL, mergulhe em nitrogênio líquido dentro de 30 s e armazene a longo prazo a -80 ° C.
    7. Eutanásia e descarte de carcaça Após a coleta de tecido, eutanasiar todos os ratos experimentais por luxação cervical. De acordo com os regulamentos do Centro de Animais Experimentais da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing, as carcaças de animais são classificadas como resíduos biomédicos patológicos (Código de Resíduos: 831-003-01). Sele todas as carcaças de animais em sacos herméticos de acordo com os regulamentos e armazene-as uniformemente em freezers designados. O descarte centralizado e ambientalmente correto será conduzido pela universidade. As carcaças não devem, em caso algum, ser descartadas arbitrariamente.
      NOTA: Evite a exposição à temperatura ambiente para evitar a degradação enzimática de biomoléculas20,21.
  3. Colheita de tecido de perfusão (as etapas restantes são as mesmas)
    1. Exponha o coração: Levante o tecido da pele do rato com a mão esquerda e abra a cavidade torácica com a mão direita para expor totalmente o coração.
    2. Prepare o ventrículo esquerdo para perfusão: Faça uma pequena incisão no ventrículo esquerdo (tamanho correspondente ao diâmetro da agulha de perfusão) e faça uma incisão na aurícula direita para permitir a saída de sangue.
    3. Perfundir solução salina: Insira a agulha de perfusão suavemente no ventrículo esquerdo e perfunda lentamente 100 mL de solução salina a uma taxa de fluxo de 10 mL/min até que a saída do átrio direito fique clara.
    4. Perfuse fixador: Mude para 200 mL de fixador de paraformaldeído a 4%, vazão: 5 mL / min. Perfundir cada rato com 100 mL de solução salina, seguido de 200 mL de paraformaldeído a 4%. Este estudo utilizou uma solução de PFA preparada comercialmente. Devido à instabilidade do PFA na solução, com potencial de variabilidade significativo dependendo da preparação e do frescor, a solução líquida deve ser protegida da luz e armazenada a 4 °C. Use uma alíquota aberta imediatamente para garantir a eficácia. Se preparada a partir de pó, a solução deve ser feita imediatamente antes do uso.
      NOTA: Use luvas, óculos de proteção e jaleco; Execute em uma capela porque o paraformaldeído é tóxico. De acordo com os regulamentos do Centro de Animais Experimentais da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing, os resíduos de paraformaldeído são classificados como resíduos biomédicos químicos (Código de Resíduos: 831-004-01). Após o uso, ele deve ser armazenado em um recipiente de lixo dedicado rotulado com o símbolo de risco biológico. O descarte centralizado é realizado pela universidade. Em nenhuma circunstância deve ser descartado indevidamente.
    5. Confirme o sucesso da perfusão: Verifique a rigidez do membro, indicando fixação eficaz.
    6. Coloque o pâncreas em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 30 mL de solução de paraformaldeído a 4%. Fixe o tecido armazenando o tubo estacionário no escuro por 2-4 h.
    7. Transfira o pâncreas para um novo tubo de centrífuga de 50 mL contendo 30 mL de solução de etanol a 70%. Mantenha o tubo estacionário e protegido da luz por aproximadamente 20-24 h22.
    8. Incorporação de parafina: Incorpore os tecidos em cera de parafina. Armazene os lenços de papel incorporados a 4 °C ou -20 °C.
      NOTA: Este estudo utilizou cortes de parafina. As seções congeladas são uma alternativa válida, mas o desempenho do anticorpo deve ser verificado para o tipo de seção específico com antecedência para garantir os melhores resultados.

3. Coloração imuno-histoquímica (IHQ) do pâncreas

  1. Protocolo de seccionamento e montagem
    1. Seções de parafina: Corte seções de tecido com uma espessura de 6 μm usando um micrótomo e monte em lâminas de vidro.
    2. Método de flutuação: Flutue as seções em um banho de flutuação de tecido a 40 °C para suavizar as rugas.
    3. Coleta de tecidos: Monte as seções em lâminas revestidas com adesivo (2-3 por lâmina) e seque em um aquecedor de lâminas a 80 °C.
    4. Secagem de lâminas: Transfira as lâminas com seções montadas para um forno a 60 °C durante a noite após o seccionamento.
  2. Protocolo de desparafinização e reidratação
    1. Coloque as lâminas em um rack de slides e mergulhe sequencialmente da seguinte forma: xileno I, 7 min; xileno II, 7 min; etanol anidro, 5 min; Etanol 90%, 5 min; Etanol 85%, 5 min; etanol 75%, 5 min; água destilada, 5 min; PBS, 5 min (três vezes).
      NOTA: Execute etapas de xileno em uma hotte com luvas e óculos de proteção. Eliminar os resíduos de xileno seguindo o protocolo idêntico especificado para o paraformaldeído no passo 2.3.4.
  3. Protocolo de recuperação de antígeno
    1. Preparação da solução de citrato de sódio: Prepare o tampão de citrato de sódio (pH 6,0). Usamos uma solução tampão de citrato de sódio auto-preparada, dissolvendo um pacote do pó em 1 L de água.
    2. Microondas sequencialmente: Coloque as lâminas em um frasco de coloração de vidro cheio de solução tampão de citrato de sódio para cobrir as lâminas e, em seguida, coloque o frasco no micro-ondas. As amostras foram submetidas ao tratamento com micro-ondas na seguinte sequência: calor médio (600 W) por 8 min, seguido de repouso sem aquecimento por 8 min e, finalmente, fogo baixo (300 W) por 7 min.
    3. Resfrie naturalmente à temperatura ambiente: Deixe o recipiente esfriar naturalmente até a temperatura ambiente.
    4. PBS: Enxágue as lâminas em PBS por 5 min por duas vezes.
  4. Incubação em forno
    1. H2O2: Aplique 3% H2O2 nas seções de tecido por 10 min para bloquear a atividade da peroxidase endógena. Aplique aproximadamente 50 - 80 μL de H2O2 em cada lâmina.
    2. PBS: Lave as lâminas em PBS por 5 min três vezes.
    3. Complexo Strept-Avidina-Biotina-Peroxidase (SABC): Aplique SABC gota a gota no tecido e core por 30 min em uma incubadora a 37 °C. Aplique aproximadamente 50 - 80 μL de SABC em cada lâmina.
    4. PBS: Lave as lâminas em PBS por 5 min três vezes.
  5. Renderização de cores
    1. 3,3'-diaminobenzidina (DAB): Aplique a solução cromogênica DAB nas seções de tecido e monitore até que a coloração amarelo-acastanhada se desenvolva. Pinte as seções por aproximadamente 1-5 min. Ajuste a duração da coloração com base na especificidade do tecido e na temperatura ambiente. Para o tecido pancreático, recomenda-se um tempo de coloração de 2 min a 22 °C.
    2. Enxágue: Enxágue as lâminas imediatamente sob um jato suave de água destilada para interromper a reação.
    3. Mergulhe: Mergulhe as lâminas em água destilada por 5 min para remover os reagentes residuais.
  6. Coloração de hematoxilina
    1. Hematoxilina: Mergulhe as lâminas na hematoxilina por 1 min. A solução de hematoxilina é preparada usando água pura na proporção de 56 mg / mL.
    2. Enxágue: Enxágue as lâminas duas vezes em água destilada (5 s por enxágue).
    3. Diferenciação de ácido clorídrico-álcool: Diferencie as lâminas na solução de diferenciação de ácido clorídrico-álcool por 1 s.
    4. Mergulhe: Mergulhe as lâminas em água da torneira por 10 min para desenvolver uma coloração nuclear azul estável.
  7. Desidratação: Desidratar as lâminas sequencialmente através das seguintes soluções: etanol 70%, etanol 80%, etanol 90%, etanol anidro, xileno I e xileno II, por 3 minutos em cada solução, respectivamente.
    NOTA: Execute etapas de xileno em uma hotte com luvas e óculos de proteção.
  8. Vedação
    1. Monte as seções com bálsamo neutro: Aplique bálsamo neutro na lâmina usando um conta-gotas de bulbo de borracha. Cubra com uma lamínula. Evite comprimir o bulbo com força para evitar a formação de bolhas. Aplique aproximadamente 50 μL de bálsamo neutro em cada lâmina.
    2. Secar ao ar: Coloque as lâminas em uma capela de exaustão durante a noite para permitir que a resina neutra seque completamente.

4. Análise de Western blotting (WB)

  1. Decomposição de tecidos
    1. Pegue 200 mg de tecido pancreático de rato, coloque-o em um tubo de moagem de 2 mL contendo 1 mL de tampão de lise e 3 pequenas esferas de aço. O tampão de lise é composto por um coquetel inibidor de protease completo e um tampão de lise RIPA. A proporção de mistura é de 1 comprimido de inibidor de protease: 50 mL de tampão de lise RIPA.
    2. A moagem foi realizada em moinho de bolas com os seguintes parâmetros: frequência: 30/s; tempo: 30 s; 10-15 vezes. Até que nenhuma partícula branca seja visível a olho nu.
    3. Transfira o sobrenadante de proteína superior para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, não pegue nenhuma espuma. Centrifugue com 16900 x g 30min, 4 °C.
      NOTA: Homogeneizados para análise de Western blotting foram preparados de todo o pâncreas.
  2. Quantificação de proteínas: Quantifique a concentração de proteínas usando o Kit de Ensaio de Proteínas Pierce BCA de acordo com as instruções do fabricante. A proporção de mistura para a solução de trabalho BCA é a Solução A: Solução B = 50:1.
  3. Eletroforese de proteínas:
    1. Adicione as amostras de proteína pancreática preparadas (um volume de 6 μL foi carregado em cada pista) ao gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida-Young PAGE, Bis-Tirs, 10 × 8, para eletroforese.
    2. Opere a 70 V por 0,5 h e, em seguida, a 110 V por 1 h usando o Mini-PROTEAN Tetra System. Dilua o líquido de eletroforese MOPS Running Buffer 20× com água pura até a concentração de 1×.
  4. Transferência de membrana
    1. Diluir o concentrado de transferência eBlot L2 5× a 1× concentração de trabalho com água pura. Este buffer de transferência de 1× pode ser reutilizado até 3 vezes. Diluir o concentrado de equilíbrio eBlot L2 5× a 1× concentração de trabalho usando água pura.
    2. Corte uma membrana de PVDF (Membrana de Transferência Immobilon-P) no tamanho apropriado (por exemplo, 7,5 cm × 5,5 cm). O tamanho do poro é de 0,45 um.
    3. Despeje aproximadamente 30 mL de metanol em uma caixa de incubação com 90 × 60 × 32 mm. Mergulhe a membrana de PVDF no metanol por 5 s para ativá-lo.
    4. Despeje aproximadamente 30 mL da solução de equilíbrio 1x preparada em outra caixa de incubação limpa. Remova cuidadosamente o gel das placas de eletroforese e coloque-o na solução de equilíbrio.
    5. Transfira a membrana de PVDF ativada do metanol e coloque-a também na caixa de incubação que contém a solução de equilíbrio. Certifique-se de que a membrana esteja posicionada abaixo do gel para contato adequado. Deixe ambos se equilibrarem.
    6. Seguindo as instruções do fabricante do mata-borrão, coloque o "sanduíche" de transferência nesta ordem de cima para baixo: esponja, gel, membrana de PVDF, esponja. Certifique-se de que nenhuma bolha de ar fique presa entre as camadas. Coloque corretamente a pilha de transferência montada na câmara do aparelho de mancha. Conecte a fonte de alimentação e execute a transferência no modo padrão por 15 min.
  5. Bloquear
    1. Prepare duas caixas de incubação, uma contendo aproximadamente 15 mL de TBST (solução salina Tamponada com Tris-Tween20) e a outra com cerca de 15 mL de solução bloqueadora de BSA a 5%.
    2. Preparação da solução TBST: Dissolva uma bolsa de Tris Buffered Saline Powder em 2 L de água pura e adicione 2 mL de Tween 20.
    3. Coloque a membrana de PVDF na solução TBST, garantindo que o lado que estava em contato com o gel fique voltado para cima.
    4. Lave a membrana de PVDF em um agitador a 40 rpm em temperatura ambiente por 3-5 min.
    5. Transfira a membrana PVDF para o tampão de bloqueio. Bloqueie-o em uma coqueteleira a 20 rpm, em temperatura ambiente por 1 h.
  6. Incubação primária de anticorpos
    1. Lave a membrana de PVDF em uma caixa de incubação contendo TBST, lave a membrana três vezes por 5 min cada em um agitador a 40 rpm em temperatura ambiente.
    2. Incubar com anticorpo primário durante a noite (14-18 h) a 4 °C (1:40000, anticorpo policlonal de vinculina) em outra caixa de incubação de anticorpos em um agitador a 20 rpm.
    3. Certifique-se de que o anticorpo seja diluído com solução de bloqueio BSA a 5%, preparada de acordo com a proporção especificada na seção.
  7. Incubação secundária de anticorpos
    1. Coloque a membrana de PVDF em uma caixa de incubação contendo 15 mL de solução de TBST. Lave a membrana três vezes por 5 min cada em um shaker em temperatura ambiente, agitando a 40 rpm.
    2. Prepare o anticorpo secundário diluindo o anticorpo anti-coelho IgG, ligado a HRP a 1:2000 em tampão de bloqueio BSA a 5%.
    3. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente num agitador a 20 rpm23.
    4. Lave a membrana de PVDF três vezes com solução de TBST por 5 min cada, seguindo o método descrito acima.
  8. Detecção
    1. Prepare a solução de substrato de trabalho misturando AccuWest ECL Plus, Raegent A e AccuWest ECL Plus, Raegent B em uma proporção de volume de 1:1 diretamente em uma caixa de incubação. Execute todas as etapas subsequentes protegidas da luz.
    2. Incube a membrana de PVDF na solução por 5 a 10 s e, em seguida, detecte imediatamente bandas imunorreativas usando reagentes de quimioluminescência aprimorada (ECL) - Vilber Fusion FX6 MINI. O tempo de exposição típico varia de 5 a 10 s.

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Resultados

Descrevemos um protocolo reprodutível para estabelecer um modelo simples de obesidade que exiba pâncreas gorduroso de forma confiável (Figura 1). Todo o processo, desde a alimentação animal e coleta de tecidos até a posterior validação molecular, está esquematicamente resumido na Figura 1. As mudanças semanais de peso do grupo modelo (n = 5) e do grupo controle (n = 5) foram registradas, e não houve diferença significativa no pe...

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Discussão

Como principal impulsionador da síndrome metabólica, a obesidade não complicada representa a manifestação inicial da desregulação sistêmica do metabolismo lipídico. Sem intervenção, pode evoluir para DM2 e complicações diabéticas graves, ressaltando a necessidade de correção metabólica precoce30. A esteatose pancreática (pâncreas gorduroso), um marcador precoce de deposição ectópica de lipídios na obesidade, redefine o pâncreas como um órgão adiposo não clássico, ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Herdeiros e Instrutores para a Herança da Experiência Acadêmica do Sétimo Lote de Especialistas em Medicina Tradicional Chinesa de Renome Nacional; Fundação Nacional de Ciências Naturais da China, Projeto do Fundo de Jovens Cientistas [número de concessão 82305376]; Projeto de Apoio a Jovens Talentos de Ciência e Tecnologia na Província de Jiangsu em 2024 [número de concessão JSTJ-2024-380].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material
Tubo microcentrífuga de 1,5 mLBiosharp Bioengenharia Co. LtdBS-15-MWB
Tubo de congelação de 2mlLABSELECTCV-002-200-EXWB
Tubo de moagem de 2mlWuhan Servicebio Technology Co., LtdHT-200-MWB
3% H2O2Booster Electronics Technology Co., Ltd.20A23CIHC
4% de paraformaldeídoBiosharp Bioengenharia Co. LtdBL539AOperação de dissecção por perfusão do pâncreas
Solução de 5% de BSABiofroxx4240GR100IHC
Tubo centrífugo de 50 mL  Biosharp Bioengenharia Co. LtdBS-500-MPreservação de tecidos
AccuWest ECL Plus, Raegent ANanjing Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
AccuWest ECL Plus, Raegent BNanjing Gene Easy Biotechnology Co., Ltd.Q201220WB
Etanol anidroShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.10009257IHC
Anti-coelho IgG, Anticorpo ligado à HRPTecnologia de Sinalização de Celulares.Inc,7074WB
Coquetel Inibidor da Protease cOmpleteHoffmann-La Roche Ltd 82256300WB
coberturaCITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD10212450CIHC
Solução cromogênica DABBooster Electronics Technology Co., Ltd.AR2017-1IHC
PinçasShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.SP0007-Mdissecação de rato SD
slides de vidro CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD188105IHC
Pote de verniz de vidroShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.FG010IHC
HematoxilinaShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST2067-20gIHC
Dieta rica em gorduraSuzhou Shuangshi Laboratory Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabela 1alimentação de animais experimentais
Álcool ácido clorídrico.Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.C0163MIHC
isofluranoShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10Ratos anestesiados
metanol Biofroxx67-56-1WB
MOPS Rodando líquido de buffer 20 e mais vezes;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C36842504WB
Balsâmico neutroBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.G8590IHC
Resina neutraShanghai SCR-Biotech Co., Ltd.G8590IHC
Solução PBSJiangsu Keygen Biotech Corp., LtdKGL2206-500Preservação de tecidos
Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA  Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, EUA.ZB382867
Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA  hermo Fisher Scientific Inc, Waltham, EUAZB382867WB
Cocktail de Inibidores de ProteaseHoffmann-La Roche Ltd 82256300
Membrana PVDF (Membrana de Transferência Immobilon-P, Millipore, 0000380346) e nbsp;Merck Millipore0000380346WB
Buffer de lise RIPABiosharp Bioengenharia Co. LtdBL504A, 70096436WB
SABCBooster Electronics Technology Co., Ltd.20C03AIHC
SalinaSHANXI SHENGAO ANIMAL PHARMACEUTICAL CO., LTD. 270071460Preservação de tecidos
Ratos machos SDJiangsu GemPharmatech Co., Ltd. D000017ratos
Citrato de sódioMerck Life ScienceS1804IHC
Alimentação padrão de manutençãoSuzhou Shuangshi Laboratory Animal Feed Technology Co., Ltd.Tabela2alimentação de animais experimentais
o restante concentra-se eBlot L2 5 vezes;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97212410 WB
o concentrado de transferência eBlot L2 5 vezes;Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C97211504WB
Tris Tamponado com Soro Salino, Pó & nbsp;Biosharp Bioengenharia Co. LtdBL602AWB
Tween 20BiofroxxEZ681A3EA8WB
UretanoSigma-Aldrich Co., Ltd.U2500-100GRatos anestesiados
Anticorpo policlonal de vinculinaProteintech Group, Inc,26520-1-APWB
xilenoNanjing Reagent CorporationC0430530223IHC
Young PAGE, Bis-Tirs, 10 e vezes; 8Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. C33152505WB
Equipamento
Máquina de anestesiaShenzhen RWD Life Science Co., Ltd.Modelo R5805Ratos anestesiados
moinho de bolas Retsch Technology GmbH - MicrotracMM400WB
CentrífugasEppendorf SE5418RWB
Secador biológico de tecidos computadorizadoEmpresa de Instrumentos Jinhua Kedi de Zhejiang.SC2013-G-KITIHC
reagentes de quimioluminescência (ECL) aprimorada  BIOIMAGEM DE VILBER00170961WB
microtomo Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, EUA.HM325IHC
Micro-ondasShanghai Boxun Industry Co., Ltd. 97000IHC
Sistema Mini-PROTEAN TetraBio-Rad Laboratories, Inc.1658004WB
FornoShanghai Jinghong Scientific Co., Ltd.DNP-9082IHC
água puraSichuan UPT Ultra-Pure Technology Co., Ltd.ULUP-TEZIHC

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