É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de investigação
Uma fórmula de enema herbal combinando Sanguisorba officinalis, Bletilla striata e Acacia catechu foi avaliada usando perfil LC-MS/MS, acoplamento S100β, modelo de colite DSS e glia entérica ativada por LPS/IFN-γ. A fórmula envolveu S100β, suprimiu a ativação glial e reduziu a expressão p-NF-κB/iNOS, indicando melhoria pelo eixo S100β-RAGE-NF-κB.
A ativação das células gliais entéricas (EKG) contribui para a patogênese da colite ulcerativa (). Este estudo examinou se o Líquido de Enema Dibai (DBE) — um enema herbal que combina Sanguisorba officinalis, Bletilla striata e Acacia catechu — modula a inflamação impulsionada pelo EGC. Perfis LC-MS/MS de constituintes DBE e compostos priorizados foram acoplados ao S100β. A eficácia foi avaliada na colite murina induzida por dextrano sulfato de sódio (DSS) usando peso corporal, comprimento do cólon, histopatologia e níveis de citocinas (ELISA). Marcadores de ativação glial foram medidos por imunohistoquímica, colocalização por imunofluorescência, PCR quantitativa (qPCR) e imunobloting. Um modelo in vitro utilizou CRL-2690 com células gliais entéricas ativadas com lipopolissacarídeo mais interferon-γ, tendo como intervenção soro de rato contendo DBE (15%). O acoplamento sugeriu uma forte ligação prevista de vários componentes DBE ao S100β. O DSS aumentou o TNF-α e o IL-1β, interrompeu junções apertadas e elevou S100β/GFAP tanto em níveis de mRNA quanto de proteína, consistente com hiperativação glial; A DBE reverteu significativamente essas mudanças. In vitro, a DBE reduziu S100β, RAGE, iNOS (NOS2) e o NF-κB fosforilado p65. Coletivamente, a DBE parece aliviar a ao inibir a ativação do EGC e reduzir o eixo S100β/RAGE/NF-κB/iNOS, preservando assim a integridade mucosa.
A colite ulcerativa () é um subtipo importante da doença inflamatória intestinal (DII) caracterizada por inflamação mucosa crônica do cólon, com aumento da carga global desde 1990, e a responsável por uma proporção substancial dos casos incidentes deDII 1,2. Manifestações típicas incluem dor abdominal e diarreia com sangue, levando a considerável sofrimento físico e psicológico e custos elevados de tratamento3. Embora as opções de tratamento tenham se expandido, a exposição prolongada a imunomoduladores e biológicos que suprimem a imunidade sistêmica está associada a riscos aumentados de linfoma e infecções oportunistas, e uma proporção dos pacientes permanece refratária ouintolerante 4. A é amplamente considerada uma condição mediada pelo sistema imunológico em que a perturbação da homeostase imune mucosa é central para afisiopatologia 5. No entanto, evidências acumuladas indicam que os mecanismos imunes mucosos sozinhos são insuficientes para explicar todas as características da DII; o sistema nervoso entérico (SNE) contribui para a inflamação intestinal, estendendo o conceito de doença para a neuroinflamação dentro daDII 6.
As células gliais entéricas (EGs), que superam em número os neurônios entéricos em mamíferos adultos, são agora reconhecidas como reguladores-chave da homeostase intestinal einflamação 7,8. Os EGCs modulam a função da barreira epitelial ao liberar mediadores como GDNF, TGF-β1, S100β e 15d-PGJ2, influenciando assim a permeabilidade e a integridademucosal 9. Entre esses mediadores, o S100β pode ativar cascatas a jusante — incluindo a via RAGE/NF-κB — levando a lesão na barreira e amplificaçãoinflamatória 10,11. Os EGCs também moldam as respostas imunes regulando o fenótipo dos macrófagos e a sensibilidade visceral via connexin-43 e M-CSF, além de exercer efeitos supressores sobre as células T in vitro, destacando a ativação da EGC como alvo terapêutico tratável na UC12,13.
A medicina tradicional chinesa (MTC) tem sido cada vez mais investigada na e tem demonstrado benefícios promissores em ambientes clínicos eexperimentais 14,15. O emparelhamento clássico de Sanguisorba officinalis (Diyu) e Bletilla striata (Baiji), juntamente com Acacia catechu (Ercha), há muito tempo é documentado para distúrbios disentéricos em fontes de matéria médica e está listado na Farmacopeia Chinesa para indicações hemostáticas, analgésicas e de cicatrização de feridas. Estudos contemporâneos relatam atividades antibacterianas, anti-inflamatórias, antioxidantes e anti-úlceras desses botânicos, enquanto A. catechu também demonstra propriedades neuroprotetoras com catequina como constituinteproeminente 16,17. Em relação à imunossupressão sistêmica convencional, uma formulação que envolva vias neuroimunes centradas em ECG poderia oferecer eficácia complementar com um mecanismo distinto e potencialmente menos riscos sistêmicos relacionadosao sistema imunológico 18,19.
Este estudo avalia se a preparação combinada de Diyu, Baiji e Ercha (DBE) mitiga a UC ao suprimir a ativação da EGC. Uma abordagem integrada é utilizada: perfilamento LC-MS/MS não direcionado para priorizar constituintes, acoplamento molecular contra S100β, validação em um modelo de colite induzida por sulfato de sódio de dextrano e ensaios mecanicistas em ECCs. O trabalho enfatiza um mecanismo neuroimune — S100β/RAGE/NF-κB/iNOS — explorado em terapias anteriores para, e destaca implicações práticas para seleção de dose, otimização de formulações e estudos translacionais subsequentes.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim [BUCM-2023-0912] e foram conduzidos de acordo com diretrizes institucionais e nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Nenhum sujeito humano estava envolvido.
Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Reagentes e materiais
Solventes de grau analítico e reagentes de grau de biologia molecular foram usados em todo o processo. Todas as informações comerciais, incluindo fabricantes, números de catálogo e detalhes das licenças de software, são fornecidas na Tabela de Materiais (xlsx). A água para todas as preparações era desionizada e filtrada. Todos os tampões foram preparados frescos ou armazenados sob as condições especificadas abaixo.
2. Configuração de equipamentos e software
Um sistema UPLC-MS/MS acoplado a um espectrômetro de massa de tempo de voo quadrupolar; uma centrífuga refrigerada com rotor de balde oscilante; um incubador de CO₂ mantido a 37 °C, 5% de CO₂ e ≥95% de umidade relativa; um leitor de microplacas (450 nm); um termociclador de PCR em tempo real; eletroforese e aparelho de absorção; e um microscópio de fluorescência com filtros fixos de excitação/emissão foram utilizados. O controle de instrumentos e a análise de dados foram realizados no MassLynx v4.2 para dados cromatográficos e espectrométricos de massa, e no AutoDock 4.2 com o AutoDockTools 1.5.7 para acoplamento. A análise de imagem foi realizada no ImageJ/Fiji v1.53.
3. Preparação do Líquido de Enema Dibai (DBE)
A mistura de ervas composta por Diyu (50 g), Baiji (50 g) e Ercha (20 g) foi grosseiramente triturada e deixada de molho em 1.200 mL de água desionizada em temperatura ambiente por 30 minutos para garantir total hidratação. A mistura de molho foi decoctada sob fervura vigorosa por 30 minutos, com mexer ocasionalmente para evitar aderência. A decocção quente foi filtrada através de gaze médica estéril de múltiplas camadas para obter vidros estériles para remover material insolúvel. O filtrado foi concentrado a vácuo em banho-maria não excedendo 45 °C até que um concentrado correspondente a uma concentração final de estoque de 1,98 g/mL fosse obtido (estoque de alta dose). Soluções de trabalho em doses médias e baixas, com 0,99 g/mL e 0,50 g/mL, foram preparadas por diluição com água desionizada estéril até volumes finais de 100 mL cada. Cada solução era passada por uma membrana de 0,22 μm em condições estéreis, dispensada em recipientes estéreis marcados e armazenada a 4 °C por até sete dias. Antes do uso, as soluções eram cuidadosamente misturadas; uma aparência aceitável era clara a levemente opalescente, sem partículas visíveis.
4. UPLC - Análise MS/MS de DBE
O pó de cada componente medicinal foi pesado com precisão em 50 mg e extraído com 1,0 mL de metanol 80% (v/v) por agitação ultrassônica por 30 minutos à temperatura ambiente. Os extratos foram retornados à temperatura ambiente após a sonicação, centrifugados a 15.000 × g por 10 minutos a 4 °C, e os supernadantes foram filtrados através de membranas de 0,22 μm para frascos autoamostradores. A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna de fase invertida (2,1 × 100 mm, 1,8 μm; tipo C18 com capas polares nas extremidades) mantida a 35 °C; marca/modelo da coluna e o número de catálogo são fornecidos na Tabela de Materiais. Fase móvel A: 0,1% de ácido fórmico em água; fase móvel B: acetonitrila. Vazão: 0,30 mL/min; volume de injeção: 10 μL. Gradiente: 5% B por 0-2 min; 5→95% B de 2 a 20 minutos; 95% B por 20-23 minutos; 95→5% B de 23,0 a 23,1 min; reequilibrar em 5% B até 26 minutos (tabela completa de gradiente é fornecida na Tabela 1).
A espectrometria de massas utilizou ionização por eletrospray com comutação positiva/negativa e aquisição independente de dados com varreduras de baixa e alta energia (MSE). Faixa de massa: m/z 100-1.500; Tensão capilar: 2,0 kV; cone de amostragem: 20 V; temperatura de origem: 120 °C; temperatura de desolvação: 360 °C; gás cone: 50 L/h; gás de desolvação: 600 L/h. Função de alta energia empregava energia de colisão em degraus de 20-50 eV. Os dados foram processados no MassLynx v4.2 com correção de massa de bloqueio e parâmetros padrão de detecção de picos. Uma lista abrangente de 105 componentes identificados (fórmulas moleculares, m/z observados, tempos de retenção e escores de confiança) é fornecida na Tabela Suplementar 1.
5. Acoplamento molecular
O acoplamento foi realizado no AutoDock 4.2 sob um protocolo de ajuste induzido. A estrutura tridimensional do S100β (PDB 3HCM) foi preparada removendo moléculas cristalográficas de água, adicionando hidrogênios polares e atribuindo cargas de Kollman. Estruturas de ligantes representando constituintes característicos da DBE foram construídas, protonadas em pH fisiológico e minimizadas em energia. O local de ligação era definido pelas coordenadas do ligante nativo; Resíduos de aminoácidos dentro de 6 Å do ligante nativo foram tratados como flexíveis durante o acoplamento. As caixas de grade abrangiam todo o bolso com espaçamento de grade de 0,375 Å. Os parâmetros do algoritmo genético lamarckiano foram: tamanho populacional 150; avaliações de energia de até 2,5 × 10⁶; 100 corridas independentes por ligante. As poses finais foram classificadas pela energia livre de ligação prevista e agrupadas por RMSD; Padrões de interação (ligações de hidrogênio, contatos hidrofóbicos, interações π-π) foram visualizados para consistência com complexos S100β conhecidos.
6. Modelo animal de colite induzida por DSS e tratamento com DBE
Ratos machos C57BL/6J (8 semanas, 20-22 g) foram aclimatados por pelo menos 7 dias a 22 ± 2 °C, 50%-60% de umidade relativa, ciclo de 12 horas de luz a noite, com comida e água ad libitum. Os animais foram aleatoriamente distribuídos em seis grupos (n = 10/grupo): controle, modelo de sulfato de sódio de dextrano (DSS), controle positivo para sulfasalazina (SASP) e tratamentos de DBE em doses baixas, médias e altas. O pessoal responsável pela pontuação histológica e quantificação da imagem foi cegado quanto à alocação de grupos.
A colite experimental foi induzida por 2,0% (v/v) de DSS em água potável por 7 dias, seguida por 1,0% de DSS por 3 dias e depois água regular por 4 dias antes da eutanásia. A DBE era administrada uma vez ao dia por enema a 10 mL/kg usando um cateter flexível inserido 2,5 cm no reto; Os animais eram mantidos na vertical por 30 minutos para minimizar o vazamento. As doses diárias de DBE foram 12,35, 27,4 e 49,4 g/kg/dia para os grupos baixo, médio e alto, respectivamente; O SASP foi administrado a 0,5 g/kg/dia como controle positivo. Peso corporal, consistência das fezes e sangue oculto fecal foram registrados diariamente para calcular o índice de atividade da doença. No desfecho, os camundongos foram anestesiados com pentobarbital sódico 50 mg/kg de i.p.; O sangue era coletado do seio retroorbital usando capilares heparinizados; Os animais foram eutanasiados por luxação cervical. O cólon foi excisado da junção ileocecal até o reto, suavemente estendido, e o comprimento medido sob tensão mínima. Segmentos representativos foram fixados com 4% de paraformaldeído; o tecido restante foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido e armazenado a −80 °C.
7. Preparação de soro contendo medicamentos
Ratos machos de Sprague-Dawley foram randomizados em grupos controle e DBE (n = 6/grupo). O grupo DBE recebeu 12,34 g/kg/dia por gavage oral uma vez ao dia durante 7 dias; os controles recebiam água purificada em volume igual. Vinte e quatro horas após a última dose, os animais foram anestesiados e o sangue total foi coletado da aorta abdominal. O soro foi separado após coagulação por 30 minutos em temperatura ambiente, seguido por centrifugação a 1.500 × g por 10 minutos a 4 °C. Os soros foram inativados por calor a 56 °C por 30 minutos e filtrados por membranas de 0,22 μm em condições estéreis antes do armazenamento. O soro era alicotado em tubos estéreis e armazenado a −80 °C. Amostras hemolizadas, identificadas por absorção elevada próxima a 414 nm, foram excluídas.
8. Exame histológico (H&E)
O tecido do cólon fixado em paraformaldeído a 4% por 24 horas foi desidratado por etanol graduado, eliminado em xileno e incorporado na parafina. As seções (5 μm) foram cortadas, desparafinizadas, reidratadas e tingidas com hematoxilina por 5 minutos, azuladas em água corrente por 5 minutos e contra-coloridas com eosina por 2 minutos. Os slides foram montados com resina e examinados quanto à arquitetura cripta, densidade de células do cálice, continuidade epitelial e infiltração inflamatória. Alterações representativas serão indicadas com setas/pontas de seta e definidas nas legendas das figuras; barras de escala (por exemplo, 200 μm) e limiares visuais pré-definidos serão especificados nas legendas.
9. Imunohistoquímica (IHC)
As seções de parafina passaram por coleta de antígeno em tampão de citrato (pH 6,0) por 15-20 minutos a 95-98 °C, têmper a peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos e bloquear com soro normal a 5% por 1 hora em temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada. Após a lavagem, as seções foram processadas usando um sistema de detecção de estreptavidina-peroxidase, desenvolvido com DAB por 2 minutos (monitoramento microscópico), contra-colorido com hematoxilina, desidratado e montado. Controles negativos sem o anticorpo primário foram incluídos em cada lote.
10. Análise de imunofluorescência (FI)
Seções embutidas com parafina foram desparafinizadas e submetidas à recuperação de antígeno em tampão EDTA (pH 8,0). Após o resfriamento, a ligação inespecífica foi bloqueada com albumina sérica bovina a 3% por 1 hora em temperatura ambiente. As seções foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra GFAP (1:500) e S100β (1:200), seguidas por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo (1:500) por 1 hora em temperatura ambiente no escuro. Núcleos foram contra-tingidos com DAPI, e lâminas foram montadas em meio anti-descolorimento. As imagens foram capturadas usando objetivos idênticos, tempo de exposição fixo de 100 ms e ganho do detector de 1,0 entre os grupos. A intensidade média de fluorescência foi quantificada no ImageJ/Fiji v1.53 após calibração do tamanho dos pixels, subtração de fundo (raio da bola rolante 50 pixels) e normalização para área DAPI-positiva. Pelo menos cinco réplicas biológicas por grupo e três campos não sobrepostos por réplica foram analisados.
11. Cultura celular e tratamentos
Células gliais entéricas de rato (designação CRL-2690) foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂. A identidade celular foi confirmada por perfilagem rápida em tandem repetido, e as culturas foram livres de micoplasma. Experimentos foram realizados nas passagens 5 a 15. As células foram semeadas em placas de 6 poços a 2,0 × 10⁵ células/poço em meio de 2,0 mL/poço e deixadas para se fixar por 24 horas. Os grupos experimentais foram: controle não tratado, controle veicular, modelo, soro DBE e inibidor.
Para indução do modelo, as células foram expostas a lipopolissacarídeos (LPS, 1 μg/mL) mais IFN-γ (20 ng/mL) por 24 horas em meio completo; o valor correspondente de U/mL para IFN-γ é reportado na Tabela de Materiais de acordo com a potência específica do lote. Para o tratamento com soro de DBE, as células receberam soro de rato com 15% (v/v) inativado por calor (56 °C, 30 min), 0,22 μm filtrado com DBE, em meio completo por 24 horas (faixa de dose 5%-20% usada na otimização da viabilidade conforme especificado na seção CCK-8). Para o tratamento com inibidores, o inibidor seletivo de S100β SBI-4211 (10-50 μM; 45 μM para leituras de chave) foi aplicado por 24 horas. Os controles do veículo compararam o conteúdo de solvente (0,1% de DMSO (v/v)) com meio idêntico. Salvo indicação em contrário, os tratamentos foram preparados em meio pré-aquecido (37 °C), e as células foram enxaguadas 2× com PBS antes da substituição do tratamento. Após o tratamento, as células foram coletadas para extração de RNA, análise de proteínas e imunofluorescência, conforme detalhado nas seções seguintes. A replicação biológica foi n ≥ 5 culturas independentes por condição.
12. Ensaio de viabilidade de células CCK-8
As células foram semeadas em placas de 96 poços a 5 × 10³ células/poço em meio de 100 μL e deixadas aderir durante a noite. O meio foi substituído por soro tratado com DBE contendo meio a 5%, 10%, 15% ou 20% (v/v) por 24 horas. O reagente CCK-8 (10 μL/poço) foi adicionado, e placas foram incubadas por 1 hora a 37 °C. A absorvância foi registrada a 450 nm com subtração em branco (meio + reagente, sem células). A viabilidade foi expressa como % do controle do veículo. Cada condição utilizava n ≥ 5 réplicas biológicas (culturas independentes) com três réplicas técnicas por cultura.
13. ELISA para citocinas teciduais
O tecido do cólon foi homogeneizado em gelo em PBS (1:9, p/v) contendo inibidores de protease. Os homogeneados foram clarificados em 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C; supernadantes foram testados para IL-1β e TNF-α de acordo com os protocolos do kit. Padrões e amostras eram executados em duplicado, e as curvas eram equipadas com um modelo logístico de quatro parâmetros (4PL) com R² ≥ 0,99; padrões calculados retrocedentemente foram aceitos dentro de 85%-115% do nominal. A absorção era registrada em 450 nm com referência de 620-650 nm quando disponível. As concentrações de citocinas foram normalizadas ao peso do tecido (pg/mg de tecido). Cada grupo incluía n ≥ 5 réplicas biológicas.
14. PCR Quantitativa em Tempo Real (qPCR)
O RNA total do tecido do cólon (ou células, conforme aplicável) foi isolado com um kit de spin-column de membrana de sílica. A integridade do RNA foi verificada por A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1 e inspeção por gel de agarose. O cDNA de primeira fita foi sintetizado a partir de 1 μg de RNA com remoção genômica de DNA. qPCR usou mistura master SYBR Green em um termociclador calibrado com o programa: 95 °C 30 s; 40 ciclos de 95 °C 5 s, 60 °C 30 s; Curva de fusão 65-95 °C em passos de 0,5 °C/5 s. O GAPDH serviu como controle endógeno. A expressão relativa foi calculada por 2⁻ΔΔCt após verificar as eficiências dos primers (90%-110%, a partir de inclinações de curvas padrão). Controles sem RT e sem template foram incluídos. As sequências de espoletas estão listadas na Tabela 2. Cada grupo apresentou n ≥ 5 réplicas biológicas e duas repetições técnicas por amostra.
15. Análise de manchas ocidentais
Proteínas do tecido do cólon (ou células) foram extraídas em tampão RIPA com inibidores de protease/fosfatase e quantificadas por ensaio de BCA. Proteína igual (30 μg/pista) foi desnaturada, resolvida em SDS-PAGE com gradiente de 4-20% e transferida para PVDF (0,45 μm; 0,2 μm para ≤ alvos de 20 kDa). As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% por 2 horas em temperatura ambiente e incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra GFAP (1:1.000), S100β (1:1.000), iNOS (1:1.000), NF-κB p65 (1:1.000), fosfo-NF-κB p65 (Ser536, 1:1.000), Ocludin (1:1.000), Claudin-1 (1:1.000) e GAPDH (1:5.000). Anticorpos secundários conjugados com HRP (1:5.000) foram aplicados por 1 hora em temperatura ambiente. Os sinais foram desenvolvidos com ECL; Os tempos de exposição foram limitados à faixa dinâmica linear (10-90 s). As transferências foram verificadas por coloração reversível da membrana antes do bloqueio. As intensidades das bandas foram quantificadas no ImageJ/Fiji v1.53 após subtração de fundo e normalizadas para GAPDH. Pesos moleculares esperados: GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, Ocludin ~65 kDa, Claudin-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. Cada análise incluiu n ≥ 5 réplicas biológicas.
16. Análise estatística
Os dados foram analisados no GraphPad Prism 8.0 e apresentados como média ± SEM. Para comparações de múltiplos grupos, foi usado ANOVA unidirecional seguido pelo teste post hoc de Tukey; para comparações par a par, testes t de Student bicaudais não pareados foram aplicados quando apropriado. Para desenhos de curso temporal ou de dois fatores (por exemplo, tratamento × dose ou tratamento × tempo), ANOVA bidirecional (medidas repetidas quando aplicável) com correção de Tukey ou Dunnett foi usada conforme especificado nas legendas das figuras. Os testes de Shapiro-Wilk e Levene foram usados para examinar normalidade e homocedasticidade antes dos testes paramétricos; quando suposições foram violadas, os dados foram transformados log-transformados ou analisados com testes não paramétricos apropriados (Kruskal-Wallis com o post hoc de Dunn; Mann-Whitney U para par a par). Valores p exatos e medidas de tamanho de efeito (η² para ANOVA, d de Cohen para testes t) são relatados em legendas de figuras quando aplicável. Um p < de dois lados de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Legendas de figuras usam a seguinte notação para significado: *p<0.05, **p<0.01, *** p<0.001 vs Controle; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 vs DSS; NS, não significativa.
17. Resultados esperados e controle de qualidade
Espera-se que o DSS encurta o comprimento do cólon, eleve o índice de atividade da doença e induza danos histológicos (distorção arquitetônica da cripta, depleção das células do cálcer, erosão epitelial). O tratamento com DBE deve melhorar esses índices de forma dependente da dose e reduzir os marcadores de ativação entero-glial. Western blots devem apresentar bandas nos pesos moleculares listados acima, com sinais aumentados no DSS e atenuação com DBE ou SBI-4211; As exposições devem permanecer dentro da faixa dinâmica linear. A imunofluorescência para GFAP e S100β deve apresentar intensidades médias elevadas na DSS e redução após o tratamento com DBE. Cromatogramas LC-MS/MS devem apresentar tempos de retenção estáveis (deriva ≤ 0,2 min) e precisões de massa dentro de ± 5 ppm para íons de referência, com íons de fragmentos característicos para constituintes chave. Controles negativos (por exemplo, omissão de anticorpos primários) não devem fornecer nenhum sinal específico. Os parâmetros de aquisição de imagem (objetivo, exposição, ganho, gama) devem permanecer fixos entre os grupos para permitir comparações quantitativas válidas.
18. Notas de solução de problemas
Turbidez ou partículas em soluções DBE indicam filtração ou precipitação inadequadas; Repita a filtração de 0,22 μm e confirme pH 6,5-7,5. Mortalidade excessiva ou perda severa de peso durante a exposição ao DSS sugere superindução; reduzir a concentração de DSS, verificar o peso molecular em lote e substituir as soluções de DSS diariamente. Quantificação inconsistente da imunofluorescência normalmente reflete exposição variável; Fixe o tempo de exposição e o ganho, e inclua uma lâmina de referência para calibração em lote. Bandas de western-blot fracas podem refletir subcarga ou ineficiência de transferência; Verifique a quantificação da proteína, selecione a porcentagem ou gradiente adequado do gel e confirme a transferência por coloração reversível de membrana. Ajuste inadequado no ELISA (R² < 0,99 ou cálculo retroativo padrão fora de 85-115%) justifica repetir a curva padrão e reensaiar amostras diluídas. Para execuções de qPCR com eficiência de primers fora de 90-110%, reotimize a temperatura de recozimento ou a concentração de primer antes da análise.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Identificação de componentes DBE e soro contendo medicamentos
O LC-MS/MS identificou 105 constituintes químicos únicos na DBE, com erro de massa < 10 ppm. A identificação foi confirmada por fórmula molecular, padrão isotópico e correspondência de fragmentos. As principais classes incluíam triterpenos, flavonoides, bifenantrenos e ácidos orgânicos. O soro contendo medicamento revelou 59 componentes derivados d...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
A colite ulcerativa () é uma doença inflamatória crônica do intestino com patogênese multifatorial. Além das respostas imunes desreguladas, a disfunção da barreira epitelial intestinal e a disbiose da microbiota intestinal são contribuintes bem reconhecidos, enquanto anormalidades do sistema nervoso entérico (SNE) são cada vez mais identificadas como um dos principais fatores que impulsionam a progressão da23. Especificamente, tanto a desregulação estrutural quant...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores não têm nada a revelar.
Essa pesquisa foi apoiada pelo Projeto de Construção de Disciplinas Médicas Chave de Alto Nível da Administração Nacional de Medicina Tradicional Chinesa (ZYYSZX-2023256).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AutoDock 4.2 | Software de acoplamento molecular | - | O Instituto de Pesquisa Scripps |
| Dextran Sulfato de Sódio (DSS) | Químico para induzir colite em camundongos | 9011-18-1 | Sigma-Aldrich |
| Líquido de Enema Dibai (DBE) | Mistura herbal para tratamento da colite ulcerativa | - | Universidade de Medicina Chinesa de Pequim |
| DMEM (Eagle Medium Modificado da Dulbecco) | Meio de cultura celular | 11965-092 | Thermo Fisher |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | Suplemento para cultura celular | 16000-044 | Thermo Fisher |
| Microscópio de fluorescência | Instrumento para imagem por imunofluorescência | - | Olympus |
| Sistema LC-MS/MS | Espectrômetro de massa para análise de LC-MS | - | Waters Corporation |
| Lipopolissacarídeo (LPS) | Indutor de inflamação em cultura celular | L2630 | Sigma-Aldrich |
| Ciclador Térmico de PCR | Equipamentos para qPCR | T100 | Bio-Rad |
| Anticorpo Primário (S100) | Anticorpo para detecção de proteínas S100 | ABC1234 | Abcam |
| Kit de Ensaio de Proteína (BCA) | Kit de quantificação de proteínas | 23225 | Thermo Fisher |
| Interferon Recombinante - (IFN) | Citocina para ativação de EGC em cultura celular | - | Sigma-Aldrich |
| Anticorpo Secundário (conjugado com HRP) | Anticorpo secundário para imunohistoquímica | XYZ5678 | Thermo Fisher |
| Sulfazazinalina (SASP) | Controle positivo para colite ulcerativa | - | Sigma-Aldrich |
| Equipamentos Western blot | Sistema de eletroforese para análise de proteínas | - | Bio-Rad |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Este artigo foi publicado
Vídeo em breve