Artigo de método

Ovulação Massiva em Mamíferos: Técnicas para Análise da Poliovulação Espontânea Natural e Poliovulação Induzida em Lagostomus maximus

DOI:

10.3791/69653

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6 de fevereiro de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Estudios Biomédicos Básicos, Aplicados y Desarrollo (CEBBAD), Universidad Maimónides, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve métodos para analisar a ovulação natural e induzida em Lagostomus maximus, incluindo a recuperação de oócitos após ovulação espontânea, induzida por hormônios ou pelo plasma seminal. Ele fornece uma estrutura abrangente para estudar a resposta ovariana e a fisiologia reprodutiva em um modelo mamífero altamente poliovulatório.

Resumo

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A vizcacha das planícies sul-americanas, Lagostomus maximus, é reconhecida como a espécie mamífera com a maior taxa de ovulação, podendo atingir até 300 óvulos. Esse notável fenômeno de poliovulação pode ser examinado por meio de várias abordagens metodológicas que refletem sua fisiologia reprodutiva distinta. A ovulação natural é avaliada pela liberação de ovocitos durante a temporada de reprodução, o que fornece insights sobre os mecanismos ovulatórios espontâneos da espécie, com os óvulos recuperados ao lavar o oviduto e os chifres uterinos. Além disso, a indução experimental da ovulação usando hormônios exógenos, como as gonadotrofinas, permite a avaliação controlada da resposta ovariana e oferece um modelo valioso para entender a regulação endócrina em roedores histricognatos. Uma terceira abordagem envolve o uso de plasma seminal autólogo como gatilho fisiológico da ovulação, destacando a coexistência de mecanismos induzidos e espontâneos nessa espécie. Juntas, essas técnicas não apenas elucidam a dinâmica do recrutamento folicular e da liberação de óvulos, mas também estabelecem a L. maximus como um modelo comparativo para a biologia reprodutiva, com potenciais implicações translacionais para entender o controle da ovulação em mamíferos.

Introdução

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A vizcacha das planícies sul-americanas (Lagostomus maximus) é um roedor histricognato distinguido por sua fisiologia reprodutiva excepcional, caracterizada por uma taxa de ovulação extraordinária que pode ultrapassar 300 óócitos por ciclo 1,2. Essa característica distinta posicionou a L. maximus como um modelo natural para estudar a função ovariana e o controle ovulatório emmamíferos 3,4,5,6,7,8,9,10,11.

Ao contrário dos ovuladores espontâneos típicos, L. maximus apresenta mecanismos ovulatórios espontâneose induzidos 2. Essa dualidade, combinada com crescimento folicular massivo e ovulação assíncrona, desafia abordagens convencionais baseadas unicamente nos critérios endócrinosou histológicos 4,12,13,14. Consequentemente, o uso de técnicas quantitativas e diretas é essencial para determinar com precisão o momento e a magnitude da liberação dos oócitos.

Fêmeas adultas de vizcachas foram obtidas de uma população residente natural mantida na Estación de Cría de Animales Silvestres (ECAS), Parque Pereyra Iraola, Berazategui, Província de Buenos Aires, Argentina (34°49′57" S, 58°06′12" W). Reconhecemos que os direitos soberanos sobre os recursos naturais são propriedade exclusiva da Província de Buenos Aires. O número de animais capturados foi autorizado pelo Ministério da Agricultura da Província de Buenos Aires. As fêmeas foram capturadas usando armadilhas vivas colocadas nas entradas das tocas em diferentes momentos ao longo do ano.

Os períodos de captura foram selecionados de acordo com o ciclo reprodutivo natural da espécie estabelecido por Llanos &Crespo 15, e refinados com base em nossa experiência de trabalhode campo 7,8,10,14. A espécie apresenta uma estação reprodutiva principal que se estende do final do verão (março) até o início da primavera, no finalde setembro 16, 17 e 18, e um período reprodutivo secundário que ocorre em outubro, especialmente em fêmeas que perderam suasfilhotes 15. Assim, foram determinados os seguintes grupos de trabalho: a) Grupo I (N= 27): final de fevereiro-início de abril (não grávida, início da principal estação reprodutiva); b) Grupo II (N= 26): meados de setembro-final de outubro (não gestantes, estro pós-lactação); Grupo III (N= 35): dezembro-janeiro (ovulação induzida por hormônios sem gravidez); Grupo IV (N= 7): dezembro-janeiro (ovulação não grávida, induzida pelo plasma seminal).

Este estudo apresenta e valida várias abordagens metodológicas para analisar a ovulação em L. maximus: (1) avaliação da ovulação natural por meio da recuperação direta de oócitos; (2) indução da ovulação usando gonadotrofinas exógenas; e (3) indução da ovulação com plasma seminal autólogo. Cada técnica oferece insights complementares sobre a dinâmica folicular, maturação dos oócitos e os mecanismos regulatórios que regem a ovulação.

A lavagem dos ovidutos e dos chifres uterinos permite a recuperação direta dos ovócitos e a quantificação precisa da ovulação, possibilitando correlação com o desenvolvimento folicular e a morfologia dosoócitos 19,20,21. A estimulação hormonal com gonadotrofinas exógenas, adaptada a partir de protocolos usados em roedoresde laboratório 22, permite uma avaliação controlada da resposta ovariana e do momento da liberação de oócitos. Enquanto isso, o uso do plasma seminal autólogo como gatilho fisiológico da ovulação — anteriormente descrito em ovuladores induzidos como coelhos e camelídeos 23,24,25 – oferece um meio inovador de explorar os fatores endócrinos e paracrinos envolvidos na ovulação.

Ao integrar essas metodologias complementares, o presente trabalho fornece uma estrutura reprodutível para investigar os mecanismos ovulatórios em L. maximus. A combinação de modelos naturais e induzidos permite diferenciar entre recrutamento folicular espontâneo, eficiência ovulatória e respostas mediadas pelo plasma seminal. Além disso, essas abordagens revelam fenômenos como a ativação espontânea partenogenética dos ovocitos e a coexistência de óócitos "defeituosos" e "euovulatórios", contribuindo para a compreensão da seleção folicular e da competênciados oócitos 2.

Além de suas implicações específicas para espécies, o modelo vizcacha oferece uma relevância mais ampla para a biologia reprodutiva comparada. Sua estratégia ovulatória mista faz a ponte entre características de ovuladores induzidos e espontâneos, fornecendo paralelos valiosos com os processos reprodutivos em outros mamíferos, incluindo espécies domésticas ehumanos 7,14,26,27.

Os protocolos metodológicos detalhados aqui são projetados para garantir a reprodutibilidade e facilitar sua adaptação a diversos contextos experimentais envolvendo dinâmica folicular, regulação ovulatória e manipulação hormonal.

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Protocolo

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Os protocolos experimentais aqui descritos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais Experimentais (CICUAE, Universidad Maimónides, número de protocolo #6184). Capturas, manuseio e eutanásia foram realizados por equipe técnica treinada, em conformidade com todas as regulamentações locais, estaduais e federais que regem o cuidado e uso de animais de laboratório. A criação de animais seguiu as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório28 e as diretrizes da Sociedade Americana de Matalogistas (ASM) para o uso de mamíferos selvagens empesquisas 29. Todos os experimentos cumpriram as diretrizes ARRIVE 2.030. Todo esforço foi feito para minimizar o número de animais utilizados. As planícies sul-americanas vizcacha (Lagostomus maximus) não são consideradas espéciesameaçadas de extinção 31.

1. Indução hormonal da ovulação

NOTA: Esta seção apresenta a indução hormonal da ovulação em fêmeas não grávidas de vizcachas capturadas. Três opções diferentes de protocolo são discutidas.

  1. Protocolo A:
    1. Administrar 200 UI de gonadotrofina coriônica equina (eCG) intramuscularmente às 0 h e 24 h, seguidas por 500 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG) às 48 horas.
    2. Descanse as fêmeas até a eutanásia.
    3. Eutanasiar mulheres de 60 a 132 horas após administração de hCG (ver seção 3).
  2. Protocolo B:
    1. Administrar 200 UI de eCG intramuscularmente às 0 h e 24 h, seguidos por 1.000 UI de hCG às 72 horas.
    2. Descanse as fêmeas até a eutanásia.
    3. Eutanasiar mulheres de 60 a 132 horas após administração de hCG (ver seção 3).
  3. Protocolo C:
    1. Administre 250 UI de eCG intramuscularmente às 0h, 24 h e 48 h, seguidas de 2 mg de hormônio luteinizante suíno (pLH) às 72 h.
    2. Descanse as fêmeas até a eutanásia.
    3. Eutanasiar mulheres 60-132 horas após administração de pLH (ver seção 3 e Tabela 1).
      NOTA: Os animais de cada grupo foram eutanasiados em diferentes momentos (variando de 60 h a 132 h após a administração da hCG). Essa distribuição temporal foi essencial para confirmar a natureza estendida do período de ovulação nesta espécie. Especificamente, para experimentos que visavam a coleta exclusiva de oócitos maduros, a eutanásia foi realizada consistentemente às 120 horas pós-hCG.

2. Indução da ovulação pelo plasma seminal

NOTA: Teste a capacidade do plasma seminal de induzir ovulação por administração intramuscular em mulheres com preparo hormonal.

  1. Coleta e preparação do sêmen
    1. Colete sêmen de machos reprodutivamente ativos por eletroejaculação, conforme descrito por Giacchino32.
    2. Centrifuge o sêmen a 200 × g por 10 minutos em temperatura ambiente para pelletar as células espermáticas e os detritos celulares.
    3. Suplemente os supernadantes (plasma seminal) com penicilina e estreptomicina e armazene a -20 °C até o uso.
  2. Indução da ovulação em mulheres não grávidas pelo plasma seminal
    1. Administre 200 UI de eCG intramuscularmente a 0 h e 24 h para cada mulher.
    2. Injetar plasma seminal intramuscularmente 48 horas após a dose final de eCG.
    3. Descanse as fêmeas até a eutanásia.
    4. Eutanasiem animais 72 horas após a injeção seminal de plasma (ver seção 3).
      NOTA: Inclua fêmeas controle injetadas com solução salina em vez de plasma seminal.

3. Anestesia, eutanásia e coleta de trato reprodutivo

NOTA: Use anestesia e métodos humanitários de eutanásia para obter tratos reprodutivos intactos para análises de oócitos e histológicas.

  1. Induzir a eutanásia por meio de uma única injeção intramuscular calculada de 13,5 mg/kg de cloridrato de cetamina e 0,6 mg/kg de clorhidrato de xilazina administrados de acordo com as recomendações do fabricante e protocolos institucionais estabelecidos.
  2. Confirme anestesia profunda pela ausência de resposta à dor (reflexos pedais).
  3. Coloque o animal em posição supina e esterilize o abdômen.
  4. Abra cirurgicamente a cavidade abdominal para expor totalmente todos os órgãos abdominais.
  5. Realize uma inspeção geral para determinar a condição geral do animal e confirme a ovulação natural ou induzida por hormônios pela presença de estigmas ovulatórios.
  6. Obtenha uma amostra de sangue por perfuração direta da veia cava superior para exame sorológico.
  7. Realize a eutanásia do animal administrando 0,5 mL/kg de pentobarbital de sódio por via intracárdica.
  8. Dissecar e remover cuidadosamente os ovários, ovidutos e chifres uterinos, tomando cuidado para não danificar suas estruturas.
  9. Mantenha os tecidos em soro salino tamponado com fosfato gelado (PBS) até o processamento (≤15 min).

4. Recuperação de oócitos

NOTA: Recuperar os óvulos dos ovidutos e dos chifres uterinos por meio de lavagem suave para garantir a coleta completa dos gametas liberados, minimizando os danos tecidos.

  1. Prepare o aparelho de lavagem prendendo uma agulha de 26-G embotada em uma seringa de 1 mL preenchida com 0,9% de NaCl suplementado com 4 mg/mL de BSA, 100 μg/mL de penicilina G e 100 IU/mL de estreptomicina.
  2. Insira suavemente a agulha no fundíbulo de cada oviduto e injete lentamente a solução de lavagem.
  3. Colete o efluente do oviduto distal e do chifre uterino em placas de Petri estéreis.
  4. Repita a lavagem até que o líquido recuperado pareça limpo e livre de oócitos visíveis ou detritos celulares.
  5. Transfira ovocitos para 100 μL gotículas de meio M2 contendo 4 mg/mL de BSA e antibióticos sob óleo mineral.
  6. Confirme a recuperação bem-sucedida inspecionando gotículas sob um estereoscópio; Espere observar óvulos livres sem células cúmulo dispersos no fluido.
  7. Continue lavando até que o efluente pareça transparente e nenhum oócito adicional seja observado sob o estereoscópio (tipicamente 3 a 5 lavagens por oviduto).
    NOTA: Os oócitos recuperados devem parecer esféricos e translúcidos sob baixa ampliação.
  8. Classifique os oócitos de acordo com a integridade morfológica descrita na seção 6.

5. Avaliação morfológica de oócitos

NOTA: Avalie a qualidade dos oócitos recuperados com base na aparência citoplasmática, uniformidade da zona pellucida e estágio de maturação nuclear.

  1. Identifique os óócitos como normais se apresentarem formato esférico, zona pelúcida uniforme, citoplasma translúcido homogêneo e uma vesícula germinativa ou corpo polar visível.
  2. Identifique os óócitos como anormais se o citoplasma parecer escuro, granular ou fragmentado, ou se a zona pelúcida for irregular.
  3. Registre o estágio de maturação nuclear como vesícula germinativa (VG), degradação da vesícula germinativa (DBG) ou metafase II (MII).

6. Avaliação da maturação nuclear dos oócitos e da integridade do fuso meiótico

NOTA: Avalie a maturação nuclear e a morfologia do fuso por meio da coloração imunofluorescente da α-tubulina e contracoloração da cromatina.

  1. Fixe os oócitos em paraformaldeído (PFA) a 2% por 20 minutos.
  2. Permeabilize em 0,2% de Triton X-100 em PBS por 40 minutos.
  3. Pós-fixar com 2% de PFA por 20 minutos e lavar três vezes em PBS (30 minutos cada).
  4. Bloqueie com 2% de sérum de cabra, 2% de BSA, 2% de leite em pó, 0,1 M glicina e 0,01% Triton X-100 em PBS por ≥ 1 hora.
  5. Incubar os oócitos durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-α-tubulina de camundongo (1:200).
  6. Lave em PBS por 30 minutos e incube por 1 hora no escuro com IgG anti-camundongo conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1/1000).
  7. Contra-tinga com 10 μg/mL Hoechst 33324 por 10 minutos e lave em PBS contendo 2% de BSA.
  8. Monte ovocitos em meio antidesfaçamento e imagem usando um microscópio confocal.
  9. Captura e processamento de imagens usando o software EZ-C1 (EZ-C1 versão 3.90); ajuste o contraste e o brilho em softwares de processamento de imagem conforme necessário.
    NOTA: A coloração bem-sucedida é indicada por um padrão de fluorescência verde clara do fuso meiótico (FITC) e contracoloração nuclear azul com Hoechst 33324.

7. Análise estatística

NOTA: Analise dados quantitativos para comparar respostas ovulatórias e qualidade dos oócitos entre grupos experimentais.

  1. Expresse os dados como média ± SD.
  2. Use o teste t do Student para comparações em dois grupos.
  3. Aplique ANOVA unidirecional seguida do teste post hoc de Bonferroni para múltiplas comparações.
  4. Considere p < 0,05 estatisticamente significativo.

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Resultados

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Ovulação natural

Doze das 27 fêmeas (grupo I) capturadas do final de fevereiro até meados de abril, coincidindo com a temporada primária de acasalamento, foram observadas ovulando, enquanto durante a segunda temporada de acasalamento (setembro/outubro) (grupo II), 10 das 26 fêmeas capturadas apresentaram ovulação. Uma taxa de sucesso comparável de aproximadamente 40% das fêmeas ovulantes foi observada durante ambos os períodos de captura. Não foi observado inchaço da região am...

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Discussão

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O protocolo apresentado aqui para estudar a ovulação nas vizcachas das planícies fornece uma estrutura reprodutível para avaliar eventos ovulatórios naturais e induzidos experimentalmente. Uma grande vantagem desse protocolo reside em sua capacidade de quantificar e caracterizar diretamente o número extraordinariamente alto de oócitos liberados pela vizcacha das planícies, uma característica incomparável em outros modelos de mamíferos. Ao contrário de métodos indiretos baseados em perfis...

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Divulgações

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Os autores declaram que não há conflito de interesses que possa ser percebido como prejudicando a imparcialidade da pesquisa relatada.

Agradecimentos

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Esse trabalho foi apoiado pela ajuda financeira intramuros da Universidad Maimónides, Argentina, e da agência FONCYT-AMPCYT, Argentina (PICT-2018-04619, concedido ao NPL). Os autores são especialmente gratos ao Ministério da Agricultura da Autoridade do Governo da Província de Buenos Aires, Argentina, por autorizar a captura de animais; ao pessoal da Estación de Cría de Animales Silvestres (ECAS, Província de Buenos Aires, Argentina) pela ajuda inestimável na captura e manuseio dos animais; e ao DVM Sergio Ferraris e ao DVM Fernando Lange, do CCV-Universidad Maimónides, pela assistência durante a anestesia e procedimentos cirúrgicos.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Adobe PhotoshopAdobe Systems Inc., EUAN/AProcessamento de imagem
Albumina Sérica Bovina (BSA)Sigma-Aldrich, EUAA9647Usado em meio de lavagem e bloqueio de buffer
Centrífuga (para processamento de sêmen)Eppendorf, Alemanha5417RPreparação do plasma seminal
Microscópio Confocal (C1 Eclipse E800)Nikon Ltd., JapãoN/AImagem de oócitos
Eletro-ejaculadorProjetado no laboratório; Adaptado de mamíferos domésticos para uso em roedores caviomorfosN/AColeta de sêmen
Eutanila (pentobarbital de sódio, difenilhidantoína de sódio)Brouwer S.A., ArgentinaN/AEutanásia
IgG anti-camundongo conjugado com FITC (AP124F)Chemicon, EUAAP124FAnticorpo secundário
Kit de coloração de Hematoxilina-EosinaSigma-Aldrich, EUAVáriosHistologia
Hoechst 33324Thermo Fisher Scientific, EUAH3570Coloração nuclear
Cloridrato de cetaminaHolliday Scott S.A., ArgentinaN/AAnestesia
Exaustor de fluxo laminarThermo Scientific, EUAN/AManuseio asséptico
Microscópio ópticoOlympus, JapãoBX51Histologia
Lutropina-V (pLH)Bioniche Animal Health Care, CanadáN/AIndução hormonal
M2 médioSigma-Aldrich, EUAM7167Recuperação de oócitos
Óleo mineralSigma-Aldrich, EUAM8410Cultura de oócitos
Novormon 5000 (eCG)Syntex S.A., ArgentinaN/AIndução hormonal
Ovusyn (hCG)Syntex S.A., ArgentinaN/AIndução hormonal
Paraformaldeído (PFA, 2% e 4%)Sigma-Aldrich, EUA158127Fixação
Penicilina GSigma-Aldrich, EUAP3032Antibióticos para meios
EstereoscópioLeica Microsystems, AlemanhaM80Identificação de ovocitos
EstreptomicinaGibco, Thermo Fisher Scientific, EUA11860038Antibióticos para meios
Seringa com agulha de ponta romba (1 mL)BD em Biociências, EUA305219Lavagem dos ovidutos/útero
Triton X-100Sigma-Aldrich, EUAT8787Permeabilização
Médio de montagem VectaShieldLaboratórios Vector, EUAH-1000Montagem para fluorescência
Cloridrato de xilazinaLaboratórios de Richmond, ArgentinaN/AAnestesia
XyleneSigma-Aldrich, EUA534056Desceramento de seções de parafina
Anticorpo monoclonal de &alfa;-tubulina (anti-&alfa;-tubulina de camundongo, SC-5286 B7)Santa Cruz Biotechnology, EUASC-5286 B7Para imunocoloração por fuso meiótico

Referências

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