Gerando visualizações espaciais 3D interativas da abundância microbiana em liteiralheiras avícolas usando RStudio

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar uma visualização tridimensional interativa das contagens microbianas e do pH em um cercado de aves usando dados de amostragem baseados em grade.

Abstract

Avaliações tradicionais da microbiologia e composição fisicoquímica da liteira de aves frequentemente dependem de tabelas estáticas ou visualizações bidimensionais que podem não capturar a heterogeneidade espacial dentro do ambiente do cercado. Este protocolo descreve visualizações tridimensionais (3D) interativas que integram dados de enumeração microbiana e parâmetros ambientais em um curral avícola. Um layout baseado em grade foi usado para aproximar a amostragem de caneta, e conjuntos de dados simulados foram gerados primeiro para demonstrar o fluxo de trabalho. O conjunto experimental foi utilizado para avaliar gradientes espaciais relativos a características ambientais, incluindo a linha d'água, os alimentadores e a entrada do curral. Os dados eram processados no RStudio usando plotly para gerar gráficos 3D interativos. As cargas bacterianas aeróbias variaram de 5,9 a 8,6 log₁₀ CFU/g, com abundância significativamente maior próxima à linha d'água (P = 0,023) e contagens menores à medida que a distância aumenta da característica. Os gráficos de superfície resultantes destacaram visualmente o agrupamento de populações microbianas em áreas ricas em umidade e demonstraram a utilidade da estrutura para interpretar padrões espaciais de comunidades microbianas em serapilheiras avícolas. Embora seja necessária uma avaliação adicional sob condições comerciais de aves, o protocolo atual fornece um método reprodutível para visualizar e analisar a heterogeneidade espacial em conjuntos de dados de serapilheiras avícolas.

Introduction

A indústria avícola inclui sistemas de produção de poedeiras e frangos de corte, cada um dos quais gera quantidades substanciais de areia por meio do acúmulo de material de cama, excrementos, partículas de ração, penas, cascas de ovos quebradas e umidade ao longo do^{tempo 1,2,3}. Essa ninhada pode sustentar várias populações microbianas, originadas de aves, insetos, roedores e aerossóis ^2,3. Alguns dos microrganismos podem incluir patógenos, como Salmonella, que podem causar doenças em aves e representar uma preocupação de saúde^{pública 2}. Como a areia avícola pode ser aplicada em terra como^{fertilizante 4,5}, compreender a distribuição microbiana tem implicações para o monitoramento ambiental, saúde dos rebanhos e segurança alimentar.

A amostragem representativa de areia de aves é, portanto, importante para caracterizar comunidades microbianas e detectar potenciais patógenos. Abordagens para amostragem de areia de aves vêm sendo exploradas há várias décadas, incluindo swab arrastados, coleta de fezes, coleta direta de lixo, capas descartáveis para sapatos ou meias^{para botas 6,7}. No entanto, o local da coleta da amostra determina fortemente o quão bem os dados representam as condições gerais da ninhada avícola. Como as aves se movem pela casa e características ambientais como bebedouros, comedouros, ventiladores e almofadas de resfriamento ou aquecimento criam ambientes localizados, as populações microbianas da liteira de aves e os fatores nutricionais não são distribuídos^{uniformemente} 3,8,9,10. Portanto, levar em conta a heterogeneidade ao interpretar dados associados à ninhada é vital para o manejo eficaz e a manutenção da saúde do rebanho.

Abordagens de mapeamento espacial têm sido amplamente aplicadas em agronomia e ciência do solo para visualizar heterogeneidade microbiana e fisicoquímica e hotspots^{localizados 11,12}. No entanto, quando dados de serapilheira de aves são coletados em múltiplas regiões dentro de um curral, tendências espaciais podem ser difíceis de interpretar a partir dos valores^{numéricos 8,9}. A visualização tridimensional (3D) oferece uma abordagem prática para integrar medições microbianas e fisicoquímicas com coordenadas espaciais para gerar modelos interativos de superfície^13,14. Comparados aos modelos 2D estáticos, os modelos 3D permitem rotação, zoom in e out, e visualização baseada em profundidade dos gradientes ao longo da grade de amostragem, o que pode melhorar a interpretação dos padrões espaciais dentro do ambiente do galpão.

O protocolo atual descreve uma abordagem estruturada e reprodutível para gerar visualizações 3D interativas de dados microbianos e físico-químicos de serapilheiras de aves, coletados usando um layout baseado em grade e analisados no RStudio. Dados microbianos e físico-químicos simulados são usados primeiro para demonstrar o fluxo de trabalho de visualização, seguidos pela aplicação da abordagem às contagens microbianas experimentais de liteiralhadas avícolas. O objetivo deste protocolo é fornecer uma estrutura reprodutível para visualizar a heterogeneidade espacial em conjuntos de dados de serapilheiras avícolas e apoiar a interpretação dos padrões de distribuição microbiana em relação às características dos viveiros.

Protocol

Esse protocolo utiliza um conjunto de dados simulado para valores microbianos e de pH para demonstrar cada etapa do fluxo de trabalho de visualização, seguido pela aplicação a contagens microbianas experimentais de seiranhada de aves para ilustrar o uso com dados experimentais e apoiar a interpretação estatística de associações microbianas relacionadas à distância. Nenhum procedimento com animais vivos foi realizado. Amostras de areia foram coletadas de um cercado de aves sem contato direto com os animais. Portanto, não era necessária aprovação institucional para cuidados com animais.

1. Coletar amostras de sareia avícola e gerar dados de abundância microbiana

1. Estabeleça um layout de amostragem baseado em grade no curral do grelhador, usando espaçamento consistente ao longo do curral.
   NOTA: Em canetas menores, isso pode ser feito usando um sistema de grade de cordas, enquanto canetas maiores podem usar marcadores de bandeira para marcar cada local de amostragem. A grade normalmente começa no canto inferior esquerdo da caneta, que é tratado como ponto de partida. Cada local de amostragem é registrado usando sua posição na grade.
2. Registre as coordenadas X e Y de cada local de amostragem e pontos ambientais, como alimentadores, linha d'água, lâmpada de aquecimento e entrada, dentro da mesma grade, usando um único local ou uma linha representando sua posição.
   NOTA: A direção X percorre o comprimento da caneta, e a direção Y percorre a largura.
3. Inclua uma coluna "Pen" no conjunto de dados para identificar a caneta ou grupo de tratamento para cada local de amostragem (por exemplo, "P1", "P2").
   NOTA: Agrupamento por caneta garante que as análises espaciais sejam realizadas dentro do ambiente habitacional correto. Para essa demonstração, uma grade estruturada 6 × 10 foi definida ao longo da área da caneta, resultando em 60 locais de amostragem (n = 60) a partir de 1 caneta. A grade 6 × 10 foi escolhida para proporcionar cobertura espacial uniforme ao longo do cercado, com um layout simétrico e espaçado uniformemente. Um exemplo do layout em grade é mostrado na Figura 1.
4. Em cada local de amostragem, colete três amostras de serapilheira para análise microbiana ou fisicoquímica. Para testes microbianos, pese 10 g de areia por réplica e coloque-a em 90 mL de água peptona estéril tamponada para fazer a primeira diluição (10⁻¹). Misture a amostra cuidadosamente para homogeneizar a suspensão.
5. Prepare diluições em série de 10 vezes da amostra de areia mista e coloque 0,1 mL de cada diluição em placas de ágar.
   NOTA: Diferentes meios podem ser usados dependendo do grupo de bactérias a ser medido. Por exemplo, bactérias aeróbicas podem ser placadas em ágar de soja tríptico (TSA), bactérias do ácido lático em ágar MRS e Enterobacteriaceae em ágar MacConkey.
6. Incube as placas a 37 °C por 24 horas e depois conte as colônias visíveis. Calcule a abundância microbiana como unidades formadoras de colônias por grama de serapilheira (CFU/g) usando:
   CFU/g = (colônias contadas × fator de diluição) ÷ volume banhado
7. Reporte o valor médio entre as réplicas.
   NOTA: O limite de detecção é determinado pelo volume de placagem (0,1 mL), correspondendo a aproximadamente 10 CFU/mL na suspensão blindada, ou 100 CFU/g de areia na amostra original.
8. Registre os resultados da enumeração microbiana em uma planilha em formato numérico para análise estatística e visualização subsequentes.
9. Crie um arquivo CSV com as seguintes colunas: ID da amostra, X (coordenada espacial), Y (coordenada espacial), Xnum (ordem numérica de ordenação para X, opcional) e contagens microbianas ou parâmetros físico-químicos como pH. Um exemplo da folha de tabela simulada é mostrado na Figura 2.
10. Gerar valores simulados de abundância microbiana usando valores aleatórios normalmente distribuídos. Defina a média, o desvio padrão e a faixa com base em medições empíricas. Aplique uma semente aleatória fixa para garantir a reprodutibilidade. Introduza gradientes espaciais na grade e adicione pequenas variações aleatórias para evitar padrões uniformes.
    NOTA: Os parâmetros de simulação usados para geração de dados, incluindo tipo de distribuição, alcance e estrutura espacial, estão resumidos na Tabela 1.

2. Configurar o ambiente de computação

1. Instale e carregue os pacotes de computação estatística necessários.
   install.packages(c("plotly"))
   Biblioteca (enredo)
2. Importe o conjunto de dados CSV para o ambiente de computação e configure um diretório funcional.
   setwd ("caminho/para/sua/pasta")
   Conjunto de Dados <- read.csv("path_to_your_file.csv")
   NOTA: O conjunto de dados de entrada deve ser organizado em formato de planilha (arquivo CSV), com cada linha representando um único local de amostragem. A estrutura de dados de entrada necessária e as definições de variáveis são resumidas na Tabela 2.

3. Preparar e formatar os dados

1. Verifique o arquivo CSV para valores de dados ausentes ou inconsistentes.
   Resumo(conjunto de dados)
   any(is.na(dataset))
2. Limpe o conjunto de dados conforme necessário removendo valores 'NA'.
   Dataset <- na.omit(dataset)
3. Para normalizar e melhorar a visualização dos gráficos, transforme logarítmicamente as contagens microbianas.
4. Padronize nomes de variáveis usando notação consistente baseada em sublinhado (por exemplo, log10_CFU_A e log10_CFU_B) para melhorar a legibilidade e a reprodutibilidade.
5. Aplique a transformação log10 aos dados de contagem microbiana para estabilizar a variância e alinhar com as práticas padrão de reporte da CFU.
   dataset$Log10_CFU_A <- log10(dataset$OrganismA_counts + 1)
   dataset$Log10_CFU_B <- log10(dataset$OrganismB_counts + 1)
6. Certifique-se de que os valores das coordenadas X e Y sejam numéricos. Se os dados estiverem em ordem alfabética, converta para valores numéricos para corresponder com precisão aos locais de amostragem na grade.
   NOTA: O conjunto final de dados deve incluir todos os identificadores únicos dentro do sistema de coordenadas da caneta, coordenadas espaciais numéricas e contagens microbianas transformadas em log.

4. Gerar visualizações 3D interativas

1. Antes de construir a matriz espacial, verifique a estrutura do conjunto de dados para garantir que a grade possa ser gerada corretamente. Depois, prepare matrizes de dados espaciais combinando múltiplas partes, como coordenadas espaciais e contagens bacterianas transformadas em log, para corresponder ao layout da grade da caneta.
   NOTA: O código agrupa as observações por Pen, X e Y, calcula a média Log10_CFU_A em cada ponto da grade e depois remodela os valores em uma matriz baseada nas coordenadas únicas X e Y do conjunto de dados.
   org1_means <- agregado(Log10_CFU_A ~ Caneta + Y + X,
   dados = conjunto de dados,
   DIVERSÃO = significa,
   na.rm = VERDADEIRO)
   org1_P1 <- subconjunto(org1_means, Pen == "P1")
2. Ordene os pontos de forma que a matriz mapeie corretamente
   x_vals <- sort(unique(org1_P1$X))
   y_vals <- sort(unique(org1_P1$Y))
   ncol_grid <- comprimento(x_vals)
   nrow_grid <- comprimento(y_vals)
   org1_mat_P1 <- matrix (org1_P1$Log10_CFU_A,
   nrow = nrow_grid,
   ncol = ncol_grid,
   byrow = FALSE)
3. Certifique-se de que não haja valores faltantes para um grafo com aparência suave.
   for(i em 1:ncol(org1_mat_P1)) {
   org1_mat_P1[is.na(org1_mat_P1[,i]), i] <- significa(org1_mat_P1[,i], na.rm=VERDADEIRO)
   }
4. Visualize as contagens microbianas espacialmente como 3D.
   NOTA: Para este gráfico, o tamanho da grade refletiu a disposição espacial do conjunto de dados
   figA <- plot_ly(
   x = x_vals,
   y = y_vals,
   z = org1_mat_P1,
   tipo = "superfície", escala de cor = lista(
   c(0, "azul escuro"),
   c(1, "verde")
   )
   )
5. Adicione características ambientais, como uma linha de água, para ajudar a visualizar a distância das contagens microbianas ou outros parâmetros da lixeira até esse ponto, permitindo que os usuários vejam padrões espaciais.
   figA < - figA %>%
   add_trace(
   x = c(1, 5),
   y = c(6, 6),
   z = c(8,5, 8,5),
   Tipo = "Scatter3d",
   modo = "linhas",
   linha = lista(cor = "#1f77b4", largura = 8),
   nome = "Linha d'água"
   ) %>%
   add_text(
   x = 3, y = 6, z = 8,6,
   texto = "Linha d'água",
   textfont = lista(tamanho = 14, cor = "azul escuro"),
   showlegend = FALSO
   ) %>%
   layout(
   título = "Organismo Simulado A",
   cena = lista(
   xaxis = lista(título = "coordenada X", tickvals = x_vals),
   yaxis = lista(título = "coordenada Y", tickvals = y_vals),
   zaxis = lista(título = "log10 CFU")
   )
   )
   figA
6. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para o código usado para visualizar os níveis de pH dentro do curral de aves.

5. Aplicação do modelo 3D à contagens microbianas experimentais de silêncio de aves

1. Colete amostras de serapilheira de aves a partir de um layout de grade definido dentro do cercado e registre os locais de amostragem usando coordenadas espaciais.
   NOTA: Neste estudo, amostras foram coletadas de um cercado de aves na Universidade de Wisconsin, Madison, WI, usando um layout de grade definido. As amostras foram coletadas usando um layout de grade de 5 × 7 m.
2. Pese uma quantidade definida de areia de cada local de amostragem e suspenda-a em soro salino tamponado com fosfato (PBS) ou diluente equivalente para preparar uma diluição inicial.
   NOTA: Neste estudo, 1 g de lixo foi coletado por local usando sacos Whirl-Pak e diluído em proporção 1:10 em soro salino tamponado com fosfato (PBS).
3. Realize a enumeração microbiana colocando amostras de areia em substrato de cultivo apropriado e incubando-as sob condições adequadas.
   NOTA: Neste estudo, as amostras foram placadas em duplicado usando o método de placagem por pontos em ágar de soja tripptico (TSA) e incubadas a 37 °C por 24 horas. Os materiais necessários para a enumeração microbiana estão listados na Tabela de Materiais.
4. Quantifique a abundância microbiana como unidades formadoras de colônias (CFU) e aplique a transformação log₁₀ aos dados para análise.
5. Integre os dados microbianos processados ao fluxo de trabalho computacional e formate-os de acordo com a estrutura de entrada exigida.
6. Gerar uma visualização espacial 3D usando os métodos descritos acima para representar a abundância microbiana no curral.
   NOTA: Neste estudo, a visualização foi gerada para representar a abundância aeróbica de bactérias em toda a amostra do cercado.

6. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas básicas para resumir padrões espaciais na abundância microbiana e variáveis ambientais.
2. Realize análises estatísticas apenas no conjunto de dados experimental de areia avícola. Use os conjuntos de dados simulados apenas para demonstrações de visualização e não os inclua em testes estatísticos.
3. Calcule valores médios para cada localização da grade quando medições replicadas estivessem disponíveis.
4. Utilize a análise de regressão linear para avaliar as relações entre abundância microbiana e distância de marcos ambientais.
5. Calcule distâncias de pontos de referência ambientais usando suas posições conhecidas na grade dentro do cercado. Trate distâncias como variáveis contínuas.
6. Use os resultados para explorar tendências espaciais e apoiar a interpretação da visualização, em vez de estabelecer relações biológicas causais.

Results

Dados microbianos e físico-químicos simulados para ilustrar o modelo 3D
O estudo atual fornece código para visualizar a abundância de organismos microbianos (Organismo A e Organismo B) e o pH da liteira dentro de um curral de aves, com base em dados simulados. Os gráficos 3D resultantes visualizaram contagens microbianas (Figura 3A,B) e pH (Figura 3C; para a experiência interativa, veja Arquivo Suplementar 3) com base no modelo baseado em grade. Os valores simulados de pH mostraram variação espacial ao longo da caneta, com mudanças graduais ao longo da grade que correspondiam aos gradientes espaciais impostos. O código completo, livre de interrupções textuais, está disponível no Arquivo Suplementar 1.

Aplicação do modelo 3D à contagens microbianas experimentais de silêncioas avícolas
Para demonstrar como o modelo funciona com dados ecológicos reais, contagens de bactérias aeróbias da liteira-avícola foram mapeadas e analisadas estatisticamente para avaliar o efeito da distância a partir de pontos ambientais, como alimentadores e linhas d'água, na abundância bacteriana usando um modelo de regressão linear (LRM). O conjunto de dados experimental utilizado para análise é fornecido no Arquivo Suplementar 2. A visualização 3D mostrou diferenças claras nas contagens aeróbias ao longo do cercado, demonstrando que a abordagem pode exibir efetivamente distribuições microbianas reais em ambientes de abrigo avícola (Figura 4; para experiência interativa, veja Arquivo Suplementar 3). Essas visualizações revelaram uma distribuição espacial heterogênea, com áreas localizadas de maior abundância bacteriana próximas a características ambientais específicas. Em todo o curral, as contagens aeróbicas variaram de 5,9 a 8,6 log₁₀ CFU/g, com as maiores concentrações detectadas próximas à linha d'água e contagens menores observadas ao redor dos alimentadores centrais e distal à linha d'água. A abundância aeróbica média diminuiu de 8,0 log₁₀ CFU/g próximo à linha d'água para 7,4 log₁₀ CFU/g na distância mais longa registrada. Contagens microbianas representam os valores médios das medições replicadas em cada local de amostragem. Além disso, a distância da linha d'água foi um preditor significativo da carga bacteriana aeróbica (LRM, P < 0,05), enquanto distâncias dos alimentadores e da entrada não foram (LRM, P > 0,05). Esses resultados quantitativos corroboram a tendência visual observada nos gráficos de superfície 3D, demonstrando um claro declínio na abundância microbiana com o aumento da distância das fontes de umidade. Em última análise, esses resultados mostram que a estrutura baseada em grade 3D oferece uma abordagem prática para a visualização e análise da heterogeneidade espacial em conjuntos de dados de ninhadas avícolas. Utilizando dados simulados e experimentais, esse modelo capturou padrões localizados de distribuição microbiana e permitiu ainda mais a interpretação estatística da associação entre abundância bacteriana e características ambientais dentro do cercado.

Figura 1: Disposição em grade do cercado de aves para coleta de amostras. Representação esquemática da estrutura de amostragem baseada em grade usada para definir coordenadas espaciais e locais de amostragem em todo o curral de aves. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Exemplo de layout de dados simulados em formato de planilha. Estrutura representativa de planilha mostrando identificadores de amostra, coordenadas espaciais (X e Y) e variáveis microbianas ou fisicoquímicas usadas para análise. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Distribuições espaciais simuladas de contagens microbianas e pH ao longo do cercado de aves. (A) Contagens simuladas do Organismo A, (B) contagens simuladas do Organismo B e (C) valores simulados de pH visualizados usando um modelo espacial 3D baseado em grade. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Distribuição espacial das contagens de bactérias aeróbias ao longo do curral de aves. Gráfico de superfície 3D mostra variação nas contagens de bactérias aeróbias (log CFU/g) ao longo das distâncias (coordenadas X–Y). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Parâmetro	Valor
Distribuição	Normal
Cruel (μ)	8.26
SD (σ)	0.77
Distribuição	7.10–9.37
Padrão espacial	Gradiente linear (direção Y)
Ruído	Normal (μ=0, variação pequena)
Semente aleatória	10

Tabela 1: Parâmetros usados para a geração simulada de conjuntos de dados microbianos. Resumo dos parâmetros de distribuição, incluindo média, desvio padrão, faixa de valores e configurações de gradiente espacial usados para gerar dados microbianos simulados.

Nome da coluna	Descrição	Tipo de Dado	Obrigatório
Caneta	Identificador para caneta ou grupo de tratamento	Texto	Sim
X	Localização das coordenadas X na grade	Numeric	Sim
Y	Localização das coordenadas Y na grade	Numeric	Sim
Log10_CFU_A	Contagem microbiana transformada em logarítmica (Organismo A)	Numeric	Sim
Log10_CFU_B	Contagem microbiana transformada em logarítmic (Organismo B)	Numeric	Opcional
pH	Valor de pH medido	Numeric	Opcional
Distância de Marco	Distância da característica ambiental (por exemplo, linha d'água)	Numeric	Opcional

Tabela 2: Estrutura de conjunto de dados de entrada necessária para análise espacial. Lista de variáveis necessárias, incluindo identificadores de amostra, coordenadas espaciais e medições microbianas ou fisicoquímicas, juntamente com os formatos de dados correspondentes.

Arquivo Suplementar 1: Código para gerar visualizações espaciais simuladas de microbianos e pH.Script R usado para processar conjuntos de dados simulados e gerar gráficos de superfície 3D para o Organismo A, Organismo B e pH em todo o curral de aves. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Conjunto de dados microbianos experimentais de silêncio avícola. Planilha contendo contagens de bactérias aeróbicas e coordenadas espaciais associadas, usada para visualização 3D e análise estatística. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Links interativos de acesso à visualização 3D e códigos QR. Códigos QR e links web correspondentes para acessar gráficos 3D interativos de conjuntos de dados simulados e experimentais.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Os gráficos baseados em simulação apresentados neste estudo foram desenvolvidos para demonstrar o potencial do mapeamento espacial 3D para aprimorar a visualização das distribuições microbianas e fisicoquímicas nos ambientes de serapilheira avícola (Arquivo Suplementar 3). Além disso, combinamos essa abordagem com dados de enumeração microbiana e marcadores ambientais e espaciais dentro da caneta para avaliar padrões de distribuição localizados e identificar relações dependentes da distância (Arquivo Suplementar 3).

Um passo crítico no protocolo atual é o estabelecimento preciso da estrutura de amostragem baseada em grade. Como a superfície 3D depende de coordenadas espaciais confiáveis, a designação correta dos pontos de origem, espaçamento uniforme e registro preciso das posições X e Y são essenciais. A parte mais laboriosa do método é traçar a grade e confirmar que cada amostra corresponde à sua coordenada designada e ao marco ambiental, como alimentadores, linhas d'água, pontos de entrada ou zonas de aquecimento. Pequenos erros posicionais nessa fase podem afetar análises posteriores. Em ambientes maiores ou comerciais, ferramentas de medição baseadas em laser ou auxílios de posicionamento similares podem reduzir a mão de obra e melhorar a reprodutibilidade. A anotação cuidadosa dos pontos de referência dos currais também é importante porque essas características fornecem contexto ecológico para entender gradientes microbianos em ambientes de serapilha, criados pela atividade das aves, umidade e distribuição de^{nutrientes 2}.

O protocolo atual é adaptável a aplicações agrícolas mais amplas. Além das contagens microbianas e do pH, pode ser aplicado a outras variáveis associadas à serapilheira ou ao solo, incluindo umidade, temperatura, distribuição de nutrientes, medidas relacionadas à amônia ou características comunitárias microbianas derivadas do sequenciamento. Modificações práticas incluem agrupar dados por caneta, gerar matrizes dinamicamente a partir de conjuntos de dados registrados e rastrear valores ausentes antes de plotar. Passos comuns para resolver problemas incluem converter rótulos de coordenadas em valores numéricos, fazer a média dos valores replicados em pontos compartilhados, verificar coordenadas duplicadas ou ausentes, e confirmar que a estrutura matricial corresponde ao layout original da caneta. A estrutura também pode ser ampliada para incluir análises multivariadas e profundidade da serapilha, permitindo avaliar tanto a heterogeneidade horizontal quanto vertical.

Várias limitações também devem ser reconhecidas. O método não melhora essencialmente a resolução de amostragem ou a representação biológica; em vez disso, melhora a organização espacial e a interpretação dos dados após a coleta. Assim, a qualidade do modelo final ainda depende do desenho da amostragem e da consistência da execução em campo. A construção de grade pode ser fisicamente exigente e demorada. Além disso, a implementação bem-sucedida requer acesso ao computador e habilidades básicas de processamento de dados. Erros nos padrões de nomeação, na entrada de coordenadas ou na falta de células da grade podem interromper a geração de matrizes ou produzir visualizações enganosas. De modo geral, a abordagem atual deve ser vista como uma estrutura exploratória baseada em visualização, e não como um substituto da estatística espacial formal ou da inferência mecanicista.

Apesar dessas limitações, o protocolo oferece vantagens claras em relação a abordagens típicas que dependem de amostras agrupadas e medições pontuais isoladas, que podem mascarar variações espaciais em escala fina dentro de uma caneta ou casa 3,4,5,6,7. No estudo atual, a aplicação do quadro às contagens de bactérias aeróbias demonstrou que populações microbianas podem se agrupar espacialmente dentro da liteira avícola. Especificamente, a abundância bacteriana foi maior próxima à linha d'água e diminuiu em direção ao centro do curral, produzindo um gradiente claro no gráfico 3D da superfície (Arquivo Suplementar 3). Esse padrão apoia a interpretação de que condições ambientais localizadas distintas, particularmente a umidade, podem influenciar fortemente a distribuição microbiana na serapilheira avícola. Variáveis adicionais, como pH e composição dos nutrientes, podem esclarecer ainda mais essas relações. Trabalhos anteriores também mostraram que as comunidades microbianas da serapilheira de aves e as condições ambientais variam ao longo do espaço em relação ao pH, vazamento de ração e atividade das^{aves 2}. Ao vincular medições microbianas ou fisicoquímicas a posições definidas dentro do ambiente animal, esse método torna esses padrões mais visíveis e interpretáveis. Também é paralelo às abordagens de mapeamento espacial usadas em ciências do solo e agronômicas para identificar gradientes, irregularidades e pontos focais localizados, ao mesmo tempo em que aplica esses conceitos ao sistema de produção^animal 11,12,13. No futuro, o mapeamento espacial repetido entre cercas, bandos e ciclos de produção pode apoiar a modelagem preditiva de hotspots microbianos e o manejo mais direcionado de zonas ecológicas de alto risco.

Embora a visualização 3D não melhore a precisão ou precisão dos dados, ela aprimora a interpretação de fatores estatisticamente relevantes que influenciam padrões microbianos e tendências na sareia avícola. Visualizações mais acessíveis podem apoiar a comunicação e a tomada de decisões informadas sobre emendas na ninhada, saúde das aves e substituição da^{cama 14, 15, 16}. Além das aplicações de pesquisa, essa ferramenta tem valor prático para produtores de aves e profissionais de extensão^{acadêmica 17}. Esses plots 3D podem servir como ferramentas eficazes para apresentar dados microbianos complexos de forma mais acessível e acionável para gestores de fazendas, partes interessadas e pequenos produtores^avícolas. A capacidade de acessar esses gráficos em um celular por meio de um código QR pode aumentar ainda mais sua utilidade para suporte técnico em campo. À medida que a produção avícola continua a avançar em tecnologia de sensores e geração de dados, tais abordagens podem se tornar cada vez mais úteis dentro da informática avícola^{integrativa 18,19}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Balanço analítico	Fisher Scientific	15997490	Para pesar areia (por exemplo, 10 g/amostra)
Computador com acesso à internet	Qualquer	N/A	Para rodar RStudio
Incubadora (37 & deg; C)	Termo Científica	50125590H	Para crescimento bacteriano de 24 horas
Mídia microbiológica (TSA)	BD Difco & nbsp;	236950	Para enumerar bactérias aeróbias
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Usado para diluições e suspensões microbianas
Amostras de areia avícola	Corte de frangos de corte ou curral de pesquisa	N/A	Lixo fresco coletado usando um design baseado em grade
Pacotes R: plotly, dplyr, htmlwidgets	CRAN	https://cran.r-project.org	Para visualização 3D e manuseio de dados
Ambiente de computação estatística R (v4.3 ou posterior)	Projeto R	https://cran.r-project.org	cran.r-project.org
RStudio (v2024.12.0.467 ou posterior)	Postular	https://posit.co/download/rstudio-desktop	posit.co
Software de planilha (Excel, Google Sheets)	Microsoft/Google	https://www.microsoft.com/exce	Para organizar dados antes da importação no RStudio
Tubos cônicos estéreis de 10 mL	Thermo Fisher Scientific	339650	Para transporte de alíquotas
Pipetas estéreis e pipetas estéreis; Dicas	Fisher Scientific	N/A	Para manuseio preciso e estéril de líquidos
Bolsas Whirl-Pak estéreis	Nasco	B01062	Para coleta e homogeneização de amostras
Misturador de vórtice	VWR	10153-838	Para homogeneização de amostras