Artigo de método

O ensaio de hemostase de Nijmegen: Medição Simultânea de Geração de Trombina e Plasmina em um Único Poço

DOI:

10.3791/69701

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27 de fevereiro de 2026

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1Department of Hematology, Radboud university medical center, 2Hemophilia Treatment Center Nijmegen-Eindhoven-Maastricht, 3Enzyre BV, Noviotech Campus, 4Department of Laboratory Medicine, Radboudumc Laboratory of Diagnostics, Radboud university medical center, 5Department of Laboratory Medicine, Laboratory of Hematology, Radboud university medical center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve o Ensaio de Hemostase de Nijmegen, que permite a medição simultânea e resolvida no tempo da geração de trombina e plasmina para fornecer uma avaliação integrada da coagulação e fibrinólise. O ensaio visa melhorar a caracterização do equilíbrio hemostático em ambientes de pesquisa e clínicos além do escopo dos testes hemostáticos convencionais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombina e plasmina desempenham um papel central na hemostasia, regulando a coagulação e a fibrinólise, respectivamente. Ensaios hemostáticos convencionais frequentemente focam em componentes isolados ou fases limitadas da hemostasia; Por exemplo, o tempo de tromboplastina parcial ativada e o tempo de protrombina avaliam apenas o início da formação de fibrina, enquanto os ensaios de atividade dos fatores avaliam a função dos fatores individuais de coagulação. Embora valiosos, esses ensaios carecem de uma visão abrangente do processo geral de hemostásia e fibrinólise secundárias, que se desenrola dinamicamente ao longo do tempo. O Ensaio de Hemostase de Nijmegue (NHA) aborda essa limitação ao permitir a medição simultânea e resolvida no tempo da geração de trombina e plasmina em um único poço de microplaca. Utilizando dois substratos fluorogênicos sintéticos com espectros distintos de excitação e emissão e sem reatividade cruzada, o ensaio permite quantificar com precisão ambas as enzimas em paralelo. A hemostasia é iniciada em plasma pobre em plaquetas usando fator tecidicular, ativador de cálcio e plasminógeno do tipo tecido, e a fluorescência é registrada a cada 30 segundos durante 70 minutos a 37 °C. Curvas de atividade enzimática são geradas usando padrões de calibração, a partir dos quais são derivados parâmetros como tempo de atraso, potencial de trombina, tempo de lise de fibrina e altura do pico da plasmina. O ensaio captura de forma confiável a geração simultânea de trombina e plasmina com boa precisão intra e inter-ensaios, e detecta a modulação da coagulação e fibrinólise por efetores como heparina, proteína C ativada e ácido épsilon-aminocaproico. Em amostras clínicas, foi observada uma redução significativa na geração de trombina em pacientes com deficiências do fator de coagulação, enquanto pacientes com distúrbios fibrinolíticos apresentaram perfis elevados de geração de plasmina. Ao combinar as medições de geração de trombona e plasmina, o NHA oferece uma visão abrangente do equilíbrio hemostático além dos ensaios convencionais. Essa abordagem integrada tem potencial para pesquisas e aplicações clínicas, como a caracterização de fenótipos hemostáticos, avaliação do risco de sangramento e trombótica, e monitoramento de intervenções terapêuticas direcionadas. Este protocolo descreve o procedimento da NHA que visa aprimorar a compreensão e avaliação do equilíbrio hemostático.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A hemostásia é resultado de um equilíbrio dinâmico entre coagulação e fibrinólise. Trombina e plasmina são as enzimas principais que impulsionam esses processos: a trombina converte fibrinogênio em fibrina, enquanto a plasmina degrada a fibrina para dissolver coágulos. A perturbação desse equilíbrio pode levar a sangramentos ou eventostrombóticos 1,2. No entanto, os exames laboratoriais usados para avaliar a hemostasia na prática clínica normalmente focam em etapas isoladas de coagulação ou fibrinólise, fornecendo uma compreensão limitada sobre o equilíbrio hemostático geral. Em pacientes com suspeita de tendência a sangramento, exames de rastreamento de rotina, como tempo de protrombina (PT) e tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), são comumente usados para rastrear deficiências nos fatores de coagulação. No entanto, esses ensaios medem o tempo até a formação inicial da fibrina e não capturam a geração de trombona além do início da coagulação, onde ocorre a maior parte da atividade fisiologicamente relevante da trombina 1,2,3. Consequentemente, podem apresentar resultados normais em pacientes com deficiências leves do fator decoagulação 3,4,5,6,7,8. Para identificar essas deficiências específicas, são usados ensaios de atividade do fator de coagulação. Embora informativos para o diagnóstico, esses ensaios avaliam proteínas individuais isoladamente e não refletem o equilíbrio hemostático geral. Como resultado, em pacientes com deficiências leves, os níveis de fatores frequentemente se correlacionam mal com o fenótipode sangramento 9,10. Isso complica a avaliação clínica de risco e a otimização do manejo do paciente, incluindo o momento e a dosagem da terapia, bem como intervenções em resposta a eventos trombóticos ou hemorrágicos graves. Essas limitações destacam a necessidade de ensaios que ofereçam uma visão mais abrangente do processo hemostático ao longo do tempo e possam ajudar a reduzir a lacuna entre os resultados laboratoriais e a apresentação clínica.

O Ensaio de Hemostase de Nijmegue (NHA) foi desenvolvido para abordar essas limitações, permitindo a medição simultânea e temporal da geração de trombina e plasmina em plasminaspobres em plaquetas 8,9. Ele utiliza dois substratos fluorogênicos sintéticos com espectros distintos de excitação e emissão para quantificar ambas as enzimas no mesmo poço de microplacas sem reatividade cruzada. Curvas de geração enzimática permitem a derivação de parâmetros quantitativos que refletem a dinâmica da coagulação secundária e da fibrinólise, incluindo tempo de atraso, altura do pico da trombona, tempo de lise da fibrina e altura do pico da plasmina. O NHA oferece várias vantagens em relação aos ensaios existentes de geração de trombina, como o Trombograma Automatizado Calibrado (CAT), Ceveron s100 e ST Genesia, que fornecem informações valiosas sobre a dinâmica da trombina, mas não avaliam a atividade fibrinolítica 10,11,12,13. Os ensaios de lise de coágulos, por sua vez, capturam aspectos da fibrinólise, mas carecem de informações sobre a geração14 da trombina. Isso limita sua utilidade na avaliação das interações complexas que determinam o equilíbrio hemostático geral. Embora algumas abordagens desenvolvidas em laboratório combinem medições de geração de trombona e plasmina, estas normalmente exigem poços separados ou ensaios paralelos, limitando o alinhamento temporal e a taxade transferência 15. Ensaios globais como tromboelastografia (TEG) e tromboelastomometria rotacional (ROTEM) fornecem informações complementares ao capturar hemostagem primária, coagulação secundária e fibrinólise16,17. Sistemas de câmaras de fluxo representam outra abordagem emergente, porém experimental, para avaliar a hemostásia total sob condiçõesde fluxo 18. Embora esses ensaios globais ofereçam um contexto fisiológico mais amplo, geralmente são menos sensíveis a distúrbios hemorrágicosleves 19,20,21. Ao medir simultaneamente a geração de trombina e plasmina no mesmo poço de reação, o NHA combina a sensibilidade dos TGAs convencionais com a visão integrada de ensaios globais, possibilitando a avaliação direta da hemostáse secundária, fibrinólise e suas interações.

Os ensaios de geração de trombina já mostraram considerável potencial para aplicações translacionalistas, como perfil individualizado de risco de sangramento e trombóticae monitoramento terapêutico 22,23,24,25. Em pesquisas clínicas, a NHA demonstrou redução na geração de trombina em pacientes com deficiências de hemofilia A, hemofilia B e fatores de coagulação raros, bem como aumento da geração de plasmina em condições hiperfibrinolíticas como deficiência de α2-antiplasmina 26,27,28,29. Diferenças em ambas as vias também foram observadas em pacientes com hipofibrinogenemia, um distúrbio associado tanto ao sangramento quanto ao aumento do risco de trombose. Nessa população, níveis mais baixos de fibrinogênio correlacionaram com a redução da geração de plasmina, provavelmente devido à falta de locais de ligação ao plasminogênio, enquanto pacientes com histórico de trombose apresentaram aumento da geração30 de trombina. Além disso, o ensaio detecta os efeitos de agentes terapêuticos, incluindo anticoagulantes, procoagulantes e antifibrinolíticos. Em um estudo anterior, propusemos uma abordagem de padronização e normalização para melhorar a reprodutibilidade e permitir a comparação de resultados entre execuções e laboratórios, um passo essencial para a implementaçãoclínica 28. Este protocolo descreve o procedimento completo e a abordagem analítica da NHA para implementação em pesquisas clínicas ou contextos translacional.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos envolvendo amostras de plasma humano foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo comitê de ética médica de Arnhem-Nijmegen. Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os doadores antes da coleta da amostra.

1. Preparação de tampões, reagentes e amostras de plasma

  1. Preparar soluções de tampão
    1. Pesar 1,2 g de Tris (p.a.) e dissolver em 180 mL de 0,9% de NaCl.
    2. Ajuste o pH para 7,4 usando HCl.
    3. Leve o volume final para 200 mL com 0,9% de NaCl para obter 50 mM de Tampão de NaCl (TBS).
    4. Aliquota o TBS em dois tubos de 50 mL.
    5. Use os 100 mL de colher de sopa restantes para preparar o tampão contendo cálcio. Dissolva 7,34 g de CaCl2,2H 2O em 100 mL de colheres de sopa para obter o tampão Tris-NaCl-CaCl2 (TBS-Ca, pH 7,4).
    6. Aliquot o TBS-Ca em dois tubos de 50 mL.
    7. Armazene ambos os buffers a 4 °C e use dentro de uma semana.
  2. Prepare substratos fluorogênicos
    1. Dissolva 53,2 mg do substrato de trombocina (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) em 4 mL de tampão Tris-NaCl.
      NOTA: A caixa contém um folheto com um certificado de análise. O volume de tampão a adicionar depende da concentração especificada e deve ser ajustado para que 1 μL de trombina humana adicionada em um reagente de 120 μL resulte em uma concentração final de 76 nmol/L.
    2. Aliquota 100 μL em tubos Eppendorf e armazenada a −80 °C.
    3. Descongele uma aliquota de substrato fluorogênico específico para trombona por 10 minutos em temperatura ambiente antes do uso. Vortex e mantenha no gelo durante o experimento.
    4. Dissolva o conteúdo de um frasco de substrato de plasmina (CBZ-L-Phe-Arg-rodamina) em 1.955 μL de DMSO.
      NOTA: A caixa contém um folheto com um certificado de análise. O volume de tampão a adicionar depende da concentração especificada e deve ser ajustado para que 1 μL de plasmina humana adicionada em um reagente de 120 μL resulte em uma concentração final de 200 nmol/L.
    5. Aliquota 60 μL em tubos Eppendorf e armazenada a −80 °C.
    6. Descongele uma aliquota de substrato fluorogênico específico para plasmina por 10 minutos em temperatura ambiente antes do uso. Vortex e mantenha em temperatura ambiente durante o experimento.
      NOTA: Este substrato está dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) e não deve ser resfriado para evitar precipitação.
  3. Prepare reagentes de gatilho
    1. Reconstitua a cefalina liofilizada adicionando 1 mL de água destilada. Vórtice completamente até se dissolver completamente.
      NOTA: A cefalina é reconstituída para fornecer fosfolipídios, essenciais para catalisar múltiplas reações de coagulação que possibilitam uma coagulação fisiologicamente relevante no ensaio.
    2. Aliquota 60 μL em tubos Eppendorf (suficiente para 20 poços) e armazenada a −20 °C.
    3. Descongele um aliquot antes do uso e mantenha-o no gelo. Vórtice brevemente antes de pipetar.
    4. Reconstituir o conteúdo de um frasco de fator tecidicular humano recombinante (TF) em 4 mL de água destilada.
    5. Aliquota 60 μL em tubos Eppendorf e armazenada a −80 °C.
    6. Descongelar um alíquota de TF e vórtice brevemente.
    7. Prepare uma diluição 1:500 de TF por diluição sequencial:
      1. Adicione 6 μL de TF a 54 μL de buffer TBS. Vórtice.
      2. Pegue 6 μL dessa diluição e adicione a 54 μL de colheres de sopa. Vórtice.
      3. Retire 20 μL dessa segunda diluição e adicione a 80 μL de TBS para atingir uma concentração final de 0,28 pM. Vórtice.
    8. Reconstitua o conteúdo de um frasco (20 mg) de ativador de plasminogênio do tipo tecido (tPA) em 20 mL de água destilada para obter uma concentração final de 580.000 IU/mL (verificar concentração específica do lote).
    9. Aliquota 50 μL em tubos Eppendorf e armazena a −80 °C.
    10. Descongelar brevemente um alíquota de tPA e vórtice.
    11. Prepare uma diluição 1:50 de tPA adicionando 20 μL de tPA a 980 μL de tampão Tris-NaCl, atingindo uma concentração final de 11.600 IU/mL. Vórtice.
  4. Preparar amostras de plasma
    1. Colete sangue venoso em tubos de citrato de 3 mL contendo 3,2% de citrato, garantindo que pelo menos 2,7 mL (90% de preenchimento total) sejam coletados.
    2. Não use o primeiro tubo após a venapunção; descarte-a para evitar a ativação pelo fator tecidicular.
    3. Inverta o tubo pelo menos 10 vezes logo após a coleta.
    4. Centrifuge em 2 h em temperatura ambiente, primeiro a 2.500 × g por 5 minutos, seguido por 10.000 × g por 10 minutos.
    5. Use uma pipeta descartável para coletar o plasma logo acima da camada celular.
    6. Plasma aliquota em crioviais marcados, congela rapidamente em nitrogênio líquido e armazena a −80 °C.
      NOTA: Certifique-se de que a amostra esteja livre de coágulos. Use apenas plasma fresco ou descongelado. Um tubo CTAD é suficiente para análise duplicada.

2. Preparação de instrumentos e configuração de software

  1. Prepare o leitor de placas de fluorescência
    1. Ligue o leitor de placas e deixe que ele se equilibre até 37 °C.
    2. Defina os seguintes parâmetros básicos:
      1. Greiner 96-poço, fundo plano, preto.
      2. Configurações gerais: Atraso de posicionamento: 0,1 s; Número de janelas cinéticas: 1.
      3. Janela cinética: Número de ciclos: 140; Tempo de início da medição: 0,0 s; Número de flashes por poço por ciclo: 10; Tempo de ciclo: 30 s.
      4. Óptica: Óptica superior
      5. Configurações do filtro: Número de monocromáticos: 2. Filtro de excitação: 355 nm para trombina; 485 nm para plasmina. Filtro de emissão: 460 nm para trombina, 520 nm para plasmina. Ganho: 600.
    3. Defina o layout com um máximo de 20 poços por placa.
    4. Navegue até Concentrações/Volumes/Tremores e confirme as seguintes configurações. Bomba 1 = 20 μL; Bomba 2 = 0 μL; Velocidade = 420 μL/s.
  2. Prepare o sistema de injeção
    1. Remova e enxágue as agulhas de injeção em um recipiente com tampão.
    2. Ajuste o volume de enxágue para 2.500 μL e enxágue as bombas com um tampão Tris/NaCl de 37 °C.
    3. Resetar o volume de enxágue para 500 μL.

3. Configuração do ensaio em formato microplate

  1. Configuração do shaker microplate
    1. Ajuste o agitador de microplaca para 37 °C e verifique a temperatura antes do uso.
    2. Ajuste a intensidade do tremor para 1100 rpm.
    3. Use este shaker em todas as etapas de mistura do ensaio para garantir uma distribuição homogênea dos reagentes e uma atividade enzimática consistente.
  2. Adicionar reagentes aos poços
    1. Descongele o plasma do paciente e o plasma acumulado normal (NPP) em banho-maria a 37 °C por até 10 minutos.
    2. Misture bem e verifique o descongelamento completo (sem crioprecipitado).
    3. Adicione 80 μL de plasma do paciente ou NPP aos poços pré-selecionados. Use uma ponta de pipeta nova para cada amostra.
      NOTA: Inclua uma amostra de NPP em cada execução de ensaio para considerar a variabilidade entre execuções (veja mais adiante no passo 5.6).
    4. Adicione 2 μL de cefalina.
    5. Adicione 2 μL de fator tissular (diluição 1:500). Misture brevemente usando um agitador de pratos.
    6. Adicione 10 μL de tampão Tris-NaCl. Misture brevemente usando um agitador de pratos.
    7. Adicione 4 μL de substrato de trombona.
    8. Adicione 2 μL de substrato de plasmina. Misture brevemente usando um agitador de pratos.
  3. Pré-incubação
    1. Insira a microplaca no leitor de placa.
    2. Deixe a placa se equilibrar a 37 °C por vários minutos.

4. Preparação e injeção do reagente inicial

  1. Prepare o reagente para a Bomba 1
    1. Combine 672 μL de tampão Tris/NaCl, 192 μL de tampão Tris/NaCl/CaCl₂ e 96 μL de tPA (a partir da etapa 1.2.5). Vortex completamente.
    2. Perfure dois furos na tampa do tubo do reagente.
    3. Insira o tubo da bomba por um furo até o fundo do tubo.
  2. Preparar e iniciar o ensaio
    1. Use o software para preparar a bomba com 500 μL do reagente.
    2. Reinsira as agulhas de injeção em suas posições designadas.
    3. Comece imediatamente a medição de fluorescência.
  3. Iniciação manual do ensaio
    NOTA: Este procedimento manual de iniciação oferece uma alternativa ao fluxo de trabalho automatizado de injeção descrito nos passos 2.2, 4.1 e 4.2.
    1. Prepare o reagente inicial conforme descrito na 4.1.1 imediatamente antes do uso.
    2. Remova a microplaca do leitor de placas e adicione rapidamente 20 μL do reagente inicial manualmente a cada poço usando uma pipeta calibrada ou pipeta multicanal para um manuseio mais rápido.
    3. Imediatamente devolva a placa ao leitor e comece a medição de fluorescência sem demora.
      NOTA: Minimize o tempo entre a adição do reagente e o início da medição (<10 s por linha) para reduzir a variabilidade.
  4. Leitura cinética
    1. Registre a fluorescência a cada 30 segundos por 70 minutos.
    2. Mantenha a placa a 37 °C durante a medição.

5. Análise de dados

  1. Prepare os dados para análise
    1. Exporte os dados de fluorescência cinética do leitor de placas como uma tabela com pontos de tempo e valores de fluorescência por poço.
    2. Converta os dados brutos de fluorescência em curvas de geração enzimática calculando a primeira derivada usando Excel ou outro programa.
    3. Plote as curvas de geração enzimática para cada poço para visualizar a reação enzimática.
      NOTA: Essas curvas representam a taxa de geração de trombina ou plasmina ao longo do tempo e correspondem ao resultado gráfico mostrado nas figuras.
  2. Analisar curvas de geração de trombinas
    1. Identifique os seguintes parâmetros da curva de geração de trombina (ver Figura 1):
      1. Tempo de atraso: O ponto de tempo em que a curva de geração da trombina sobe consistentemente e atinge 8% da altura máxima da trombina.
      2. Altura do pico da trombona: O valor máximo do sinal no eixo y (ou seja, a taxa máxima de geração de trombina).
      3. Momento de pico da trombona: O tempo desde o início do ensaio até o pico da trombona.
      4. Potencial de trombina (área sob a curva de geração de trombina): A área sob a curva desde o tempo de atraso até o sinal de trombina retornar ao seu ponto de partida.
        NOTA: O potencial de trombina reflete a capacidade total de geração de trombina da amostra sob condições de ensaio.
  3. Analisar curvas de geração de plasmina
    1. Identifique os seguintes parâmetros a partir da curva de geração de plasmina (veja a Figura 2):
      1. Tempo de lise da fibrina: O tempo desde o início da geração da plasmina (ou seja, o momento em que a curva de geração da plasmina sobe consistentemente e atinge 8% da altura do pico da plasmina) até o ponto em que o pico da plasmina é atingido.
      2. Altura do pico da plasmina: O primeiro máximo distinto na curva, correspondente ao surto inicial na geração de plasmina, é determinado no ponto em que a segunda derivada da curva de geração de plasmina (baseada em uma média móvel de três minutos) atinge zero após o início da geração de plasmina.
      3. Potencial de plasmina (área sob a curva de geração de plasmina): A área sob a curva desde o início da geração de plasmina até o pico da plasmina.
        NOTA: Flutuações de sinal ocorrem após o pico inicial de plasmina e não são incluídas na análise dos parâmetros de geração de plasmina.
  4. Extrair parâmetros manualmente ou usando software personalizado
    1. Use Microsoft Excel, GraphPad Prism ou um script personalizado (por exemplo, em Python ou R) para extrair parâmetros cinéticos.
    2. Salve os dados brutos, as curvas plotadas e os parâmetros calculados em um formato estruturado para arquivamento e referência futura.
      NOTA: Se estiver usando macros, verifique a correção de todos os parâmetros visual e manualmente antes de confiar na saída automatizada. Nossa macro para conversão de dados está disponível mediante solicitação.
  5. Padronização e normalização
    1. Estabeleça uma referência fisiológica medindo 40 amostras individuais de doadores saudáveis em paralelo com a amostra de NPP usada para normalização. Realize essa etapa uma vez por lote de NPP.
    2. Calcule os valores médios dos parâmetros de geração de trombona e plasmina dos doadores saudáveis e determine sua proporção com os valores correspondentes de NPP obtidos na mesma execução.
    3. Para cada amostra de paciente em uma determinada sequência, primeiro normalize o parâmetro de geração de trombina ou plasmina ao valor de NPP medido nessa mesma rodada.
    4. Divida esse resultado pela proporção saudável de doadores para NPP previamente estabelecida para o mesmo lote de NPP (veja o passo 5.6.2). Isso gera um valor relativo normalizado para o indivíduo saudável médio, com padronização para variação entre corridas usando NPP.
    5. Expresse os valores dos parâmetros como porcentagens em relação ao valor médio de indivíduos saudáveis (definido como 100%). Apresente os resultados das amostras dos pacientes de acordo.
      NOTA: Os valores relativos dos parâmetros para cada amostra individual de paciente são calculados usando a seguinte fórmula, onde a execução se refere à medição da amostra do paciente, e a corrida b refere-se à prova de referência na qual amostras saudáveis de doadores foram medidas em paralelo com o mesmo lote de NPP. Nosso arquivo Excel contendo os cálculos para normalização de dados está disponível mediante solicitação.
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6. Geração de curvas de calibração

  1. Prepare a curva de calibração da trombina
    1. Reconstitua a α-trombona humana liofilizada conforme instruído na ficha técnica do fabricante.
      NOTA: Por exemplo, se a folha técnica especificar reconstituição em 100 μL de água para render 3,34 mg/mL, isso corresponde a 0,334 mg em 100 μL.
    2. Dilua a trombina reconstituída 1:10 no buffer Tris/NaCl.
      NOTA: Isso resulta em uma concentração de estoque de aproximadamente 9,1 nmol/mL (0,0091 nmol/μL), baseada em um peso molecular de 36.700 g/mol.
    3. Prepare uma série de diluição no tampão Tris/NaCl para alcançar concentrações finais de trombina no ensaio variando de 0 a 152 nmol/L.
    4. Pipete trombina em poços selecionados que já contêm tampão para atingir um volume total de 100 μL por poço.
    5. Prepare a solução de substrato para a Bomba 1 misturando 300 μL de tampão Tris/NaCl com 200 μL de substrato de trombona do passo 1.2.2.
    6. Dilua ainda mais essa solução combinando 400 μL da mistura com 360 μL de tampão Tris/NaCl.
    7. Adicione 20 μL dessa mistura de substrato a cada poço de calibração, elevando o volume total do ensaio para 120 μL.
    8. Misture delicadamente a placa e insira-a no leitor de placa. Execute o ensaio cinético por 25 ciclos, usando as mesmas configurações de fluorescência descritas na seção 2.
    9. Exporte os dados brutos de fluorescência e determine a inclinação inicial (taxa de aumento de fluorescência por ciclo) para cada concentração de trombona usando o GraphPad Prism ou software equivalente.
    10. Gerar uma curva padrão traçando a inclinação inicial em função da concentração de trombona.
      NOTA: Certifique-se de que todos os tampões estejam pré-aquecidos a 37 °C e manuseie as enzimas no gelo. Sempre prepare diluições frescas e misture cuidadosamente. A curva padrão resultante é usada para calcular a atividade relativa da trombomba em amostras desconhecidas usando o macro descrito na seção 5.
  2. Preparação da curva de calibração da plasmina
    1. Reconstitua a plasmina liofilizada em água destilada (por exemplo, 0,543 mL) conforme as instruções do fabricante.
      NOTA: A plasmina tem peso molecular de 75.400 g/mol. A concentração resultante do estoque é aproximadamente 24,3 nmol/mL (0,024 nmol/μL), assumindo 1 mg em 0,543 mL.
    2. Prepare uma série de diluição no tampão Tris/NaCl para alcançar concentrações finais de plasmina no ensaio variando de 66 a 532 nmol/L.
    3. Pipete plasmina em poços contendo tampão Tris/NaCl para atingir um volume final de 100 μL por poço.
    4. Prepare a solução substratal para a Bomba 1 misturando 680 μL de tampão Tris/NaCl com 80 μL de substrato de plasmina/rodamina (pré-diluído 1:1, se necessário) do passo 1.2.5.
    5. Adicione 20 μL dessa solução substrato a cada poço de calibração, elevando o volume total para 120 μL.
    6. Misture delicadamente a placa e insira-a no leitor de placa. Execute o ensaio cinético por 25 ciclos usando as mesmas configurações de fluorescência descritas na Seção 2.
    7. Exporte os dados brutos de fluorescência e determine a inclinação inicial do aumento de fluorescência para cada concentração de plasmina aplicando regressão linear à fase linear da curva cinética usando o GraphPad Prism ou software equivalente.
    8. Gerar uma curva padrão traçando a inclinação inicial em função da concentração de plasmina.
      NOTA: Devido à variação da atividade de plasmina de lote para lote, a calibração deve ser repetida a cada novo lote. Se for observada atividade inesperadamente alta, recomenda-se uma diluição 1:2 do estoque antes de preparar a série de calibração.
  3. Use a curva de calibração para quantificação
    1. Use as curvas de calibração geradas na Seção 6 para converter valores de inclinação de fluorescência em atividade enzimática relativa.
    2. Use apenas a parte linear da curva de calibração para interpolar amostras desconhecidas.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Curvas representativas de geração de trombona e plasmina obtidas com o Ensaio de Hemostase de Nijmegen (NHA) são mostradas na Figura 3. A intensidade do sinal de cada curva é expressa como uma porcentagem em relação à amostra de plasma normal agrupado (NPP) medida simultaneamente. Uma amostra com NPP é incluída em cada execução como um controle interno para verificar a validade do ensaio e garantir a comparabilidade entre execuções.

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O Ensaio de Hemostase de Nijmegue (NHA) é um ensaio fluorogênico com duas enzimas que permite a medição simultânea e temporal da geração de trombona e plasmina em plasma pobre em plaquetas. Ao capturar ambos os processos em um único poço, o método facilita a análise cinética de alta resolução da hemostásia secundária e fibrinólise. Essa dupla leitura oferece vantagens metodológicas distintas em relação aos ensaios convencionais e tem sido aplicada com sucesso no estudo de deficiências de...

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Divulgações

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W.L. van Heerde é fundador e funcionário da Enzyre BV e co-proprietário da Van Heerde Holding BV, que é acionista da Enzyre. A Enzyre recebeu financiamento para pesquisas contratadas da Takeda e da Novo Nordisk. W.L. van Heerde também recebeu apoio de bolsas de viagem da SOBI e CAF-DCF. Os autores restantes declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este estudo foi conduzido de acordo com os objetivos do EuroBloodNet.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais
Cloridrato de cálcio (CaCl2.2H2O)Merck1.02382
Cefalina (kit de reagentes C.K. Prest 5 APTT)Stago00847Estável por 6 meses em -20 °C. 
Água destiladaAnote a data de abertura. Use dentro de 1 dia após a primeira abertura.
Dimetilsulfóxido (DMSO)Merck1.02950.0500
Alfa-trombona humanaLaboratórios de Pesquisa em EnzimasHT 1002aA caixa contém um folheto com um certificado de análise. O volume de buffer a adicionar depende da concentração especificada e deve ser ajustado para que 1 & micro; L de trombona humana adicionada em 120 & micro; O reagente L produz uma concentração final de 76 nmol/L.
Plasmina humanaLaboratórios de Pesquisa em EnzimasHPlasA caixa contém um folheto com um certificado de análise. O volume de buffer a adicionar depende da concentração especificada e deve ser ajustado para que 1 & micro; L de plasmina humana adicionada em 120 & micro; O reagente L resulta em uma concentração final de 200 nmol/L.
Plasma normal em poolPreparação internaNão aplicávelEstável por 3 horas após o descongelamento se mantido no gelo.
Plasma do pacienteNão aplicávelNão aplicável
Substrato de plasmina (CBZ-L-fenilalalil-L-amida de arginina)-rodamina-morfolino ureiaSymeresEstável por 6 meses em -80 &°C. 
Fator tecidular humano recombinante (TF): InnovinDade BehringB4212Estável por 6 meses em -80 &°C. 
Ativador de plasminógeno do tipo tecidual recombinante (tPA): Alteplase/ActilyseBoehringer IngelheimEstável por 12 meses em -80 °C. 
Tris(hidroximetil)aminometano (H2NC(CH2OH)3)Merck1.08382.2500
Tampão Tris-NaCl, pH 7,4 (TBS)Preparação internaNão aplicável
Tampão Tris-NaCl-CaCl2 tampão, pH 7,4 (TBS-Ca)Preparação internaNão aplicável
Substrato de trombina Bz-beta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-metilcumarinaSymeresEstável por 6 meses em -80 &°C. 
Equipamento
Fluorímetro / leitor de microplacas Fluostar Optima com controle de temperatura e injetores de reagentesBMG Labtech
Placa microtitulada de 96 poços, poliestireno, fundo plano, preta, superfície de ligação média (equivalente Microlon)Greiner BIO-ONE655076
Balanço analítico (balanço de carga superior)
Pontas de pipeta azul (para 100-1000 e micro; L)
Tubos de Coleta de Sangue de Citrato 3mL (3,2% Citrato)BD Vacutainer
Balde de gelo
Máquina de gelo
Incubadora / agitador microplate
Agitador magnético
Rack de tubos para microcentrífugas
Tubos de microcentrífuga, fechados
Medidor de pH
Pontas da pipeta 0,1-10 & micro; L, não estéril
Pipetas (2, 10, 20, 100 e 1000 & micro; L)
Chave de fenda (usada como sonda)
Misturador de válvulas
Banho-maria
Pontas de pipeta amarelas (para 20-200 e micro; L)

Referências

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