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Um Procedimento Passo a Passo para Produzir Quimeras da Linha Germinativa em Galinhas por Transplante de Células Germeninas Primordiais

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DOI:

10.3791/69704

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5 de dezembro de 2025

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

Neste artigo

Resumo

Quimeras da linhagem germinativa aviária, geradas pelo transplante de células germinativas primordiais (PGCs) em embriões receptores, possibilitam aplicações em transgênese, edição gênica e conservação de espécies. Este protocolo detalha procedimentos para isolamento de PGC, expansão in vitro , microinjeção e verificação de doadores, fornecendo uma plataforma confiável para a produção de quimeras germinativas e o avanço da biotecnologia aviária.

Resumo

A geração de quimeras germinativas em galinhas por meio do transplante de células germinativas primordiais (PGCs) oferece uma plataforma robusta e reprodutível para transgênese de aves, edição genômica e conservação de espécies. Abordagens tradicionais que utilizam células blastodérmicas de embriões do estágio X de EGK são limitadas pela baixa eficiência de transmissão da linhagem germinativa devido à segregação precoce da linhagem celular. Em contraste, estratégias mediadas por PGC exploram a competência germinativa intrínseca dessas células unipotentes, permitindo a incorporação confiável nas gônadas receptoras. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para isolar PGCs de embriões HH estágios 26-28, mantê-los e expandi-los in vitro, e transplantá-los para a aorta dorsal de embriões receptores HH estágios 14-17. O enfratemento de curto prazo é monitorado usando marcadores fluorescentes como o PKH26, enquanto a contribuição germinativa de longo prazo é confirmada por análise PCR das gônadas receptoras. Essa abordagem garante a geração consistente de quimeras germinativas enquanto preserva a viabilidade e competência funcional dos PGCs doadores. Além disso, o método é compatível com ferramentas de edição genômica como CRISPR/Cas9 e vetores baseados em transposons, permitindo a produção de modelos aviários transgênicos e editados geneticamente. Além da pesquisa básica, essa estratégia apoia esforços de conservação por meio da transmissão interespécie da linhagem germinativa e preservação de recursos genéticos. No geral, esse protocolo oferece uma estrutura abrangente e confiável para manipular a linha germinativa aviária, oferecendo uma plataforma versátil tanto para estudos fundamentais quanto aplicados em biotecnologia avícola.

Introdução

A transmissão mediada pela linhagem germinativa primordial (PGC) é o método mais eficiente para transferir informações genéticas para a próxima geração emaves 1,2,3. Quimeras germinativas, definidas como indivíduos que carregam células germinativas derivadas tanto de doadores quanto de hospedeiros, permitem a transmissão de material genético doador para descendentes, apoiando aplicações em transgênese, genômica funcional e conservação de espéciesameaçadas 4,5,6,7,8. Ao contrário de abordagens que dependem de células blastodérmicas, as estratégias mediadas por PGC oferecem maior eficiência de transmissão germinativa e reprodutibilidade, o que as torna bem adequadas para manipulação genética precisa.

Em espécies aviárias, as PGCs originam-se na região central das pellúcidas do blastoderma noestágio X 9 de Eyal-Giladi e Kochav (EGK) e posteriormente migram para o crescente germinal pelo estágio 4 10 de Hamburger eHamilton (HH). Entre os estágios 9 e 12 da HH, as PGCs circulam por vasos sanguíneos embrionários antes de se fixarem na crista gonadal11, 12 e 13. Esses padrões migratórios distintos permitem o isolamento dos PGCs em múltiplos estágios, incluindo o crescente germinativo, sangue circulante egônadas 14. Notavelmente, PGCs colhidos de gônadas de estágio 26-28 da HH e transplantados para embriões receptores dos estágios 14-17 da HH demonstraram apresentar competência germinativa ótima e eficiência de enfratemento, fornecendo uma estrutura prática para a aplicação padronizada desse protocolo.

As PGCs podem ser mantidas e expandidas in vitro, mantendo a identidade e a capacidade de transmissão da linhagem germinativa, permitindo seu uso para modificação genética estável. A produção de quimeras da linha germinativa mediada pelo PGC tem sido usada para gerar aves transgênicas que expressam proteínas recombinantes, traços de linhagem germinativa, manipulam vias de determinação sexual e conferem resistência a doençasinfecciosas 6,15,16,17,18,19. Além disso, o transplante de PGC facilita a transmissão e a conservação interespécies da linha germinativa de avesameaçadas 7,8,20,21,22,23, e a criopreservação de PGC possibilita a preservação de recursos genéticos a longo prazo 24,25.

Embora outros tipos de células-tronco, incluindo células-tronco embrionárias (ESCs)26,27,28,29, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)30,31,32 e células-tronco espermatogoniais (SSCs)33,34, tenham sido explorados para modificação da linhagem germinativa aviária, sua eficiência de transmissão germinativa permanece menor do que a dos sistemas baseados em PGC, que atualmente são considerados os mais Fonte confiável de células competentes para a linha germinativa.

Em estudos de quimeras germinativas, a escolha da raça doadora é fundamental para distinguir células germinativas derivadas de doadores de células derivadas do hospedeiro. O Frango Ogye Coreano (KOC) possui o alelo recesivo i/i responsável pela pele e penas negras, facilmente distinguível da linhagem White Leghorn, que carrega o alelo dominante I/I 35,36. Essa diferença visível permite a identificação inequívoca dos descendentes de doadores durante a análise de transmissão da linhagem germinativa, ao mesmo tempo em que apoia a conservação da biodiversidade devido ao valor genético indígena do KOC.

No geral, a produção de quimeras na linhagem germinativa mediada por PGC oferece uma plataforma robusta para a biotecnologia aviária (Figura 1). Ao especificar os estágios ótimos do doador (HH26-28) e do receptor (HH14-17) e incorporar etapas definidas de cultura e validação, esse protocolo possibilita uma transmissão eficiente da linha germinativa e fornece uma estrutura prática para a geração de aves transgênicas e editadas pelo genoma, bem como para a preservação de valiosos recursos genéticos aviários.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo galinhas foram aprovados pelo Instituto de Recursos Animais de Laboratório, Universidade Nacional de Seul, Coreia do Sul (número de aprovação IACUC: SNU-250226-4). Os animais eram mantidos sob condições controladas e higiênicas, com água e ração esterilizadas fornecidas. Além disso, todos os resíduos químicos e biológicos gerados durante os procedimentos, incluindo soluções de tripsina/EDTA, células marcadas com PKH26 e tecidos embrionários ou gonadicos, foram manuseados e descartados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança e gestão de resíduos perigosos da Universidade Nacional de Seul. Todos os reagentes e equipamentos usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Os meios e reagentes PGCs usados para amostragem de gônadas e cultura celular de embriões doadores devem ser estéreis.

1. Isolamento dos PGCs de galinhas

  1. Incubar ovos frescos fertilizados no estágio Eyal-Giladi e Kochav (EGK) X a 37 °C por 5,5 dias até que os embriões atinjam os estágios 26-28 de HH.
    NOTA: Mantenha a umidade entre 60% e 65% para garantir o desenvolvimento embrionário normal.
  2. Isole cuidadosamente os embriões dos óvulos nos estágios 26-28 de HH usando pinças estéreis.
  3. Lave os embriões com 1× PBS, depois coloque o embrião em uma placa de carvão e prenda-o com alfinetes de inseto. Usando um estereoscópio, disseque cuidadosamente as gônadas embrionárias emparelhadas com pinças afiadas.
    NOTA: Manuseie os tecidos com cuidado para evitar danos e garantir o isolamento preciso das gônadas. Devido à proximidade com o rim mesonefrático nos estágios HH 26-28, uma pequena quantidade de tecido renal pode ser coletada inadvertidamente; no entanto, dissecação cuidadosa sob estereomicroscópio e condições de cultura seletiva garantem que apenas PGCs proliferem, mantendo a pureza.
  4. Transfira as gônadas pareadas coletadas de três embriões para um tubo de 1,5 mL contendo 500 μL de 0,05% de tripsina/EDTA e incube a 37 °C por 5 minutos para dissociar as células.
  5. Adicione 50 μL de FBS para inativar a tripsina.
  6. Centrifuge a 200 × g por 5 minutos em temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C). Remova cuidadosamente o sobrenadante sem mexer na pastilha celular.
  7. Resuspenda as células gonadais dissociadas em 1 mL de 1× PBS.

2. Proliferação in vitro de PGCs de galinhas

  1. Prepare o meio de cultura PGC (KO-DMEM suplementado com 20% FBS, 2% soro de frango, nucleosídeos, GlutaMAX, aminoácidos não essenciais MEM, 2-mercaptoetanol, 10 mM piruvato de sódio, antibiótico-antimicol, 10 ng/mL bFGF) e aqueça o meio a 37 °C.
  2. Adicione células gonadais dissociadas coletadas de três embriões nos estágios HH 26-28 (aproximadamente 100-150 PGCs porembrião 37,38) a 1 mL de meio de cultura pré-aquecido por poço e coloque as células em uma placa de cultura de 12 poços.
  3. Balance suavemente a placa para garantir a distribuição uniforme das células.
  4. Manter os PGCs em 37 °C com 5% de CO₂, monitorar a morfologia e a densidade celular diariamente. As PGCs permanecem redondas, refratíveis e tipicamente flutuantes, enquanto as células somáticas são aderentes (Figura 2A).
    NOTA: As condições de cultura apoiam seletivamente a proliferação dos PGCs, permitindo que os PGCs se expandam enquanto as células somáticas são gradualmente eliminadas.
  5. PGCs cultivados em uma placa de 12 poços são mantidos trocando o meio de cultivo a cada 3-4 dias para apoiar a proliferação e viabilidade ótimas (Figura 2B).
  6. Opcionalmente, utilize marcadores específicos de PGC (por exemplo, CVH, DAZL, NANG e POUV) para verificar a pureza e realizar a determinação sexual por PCR (Tabela 1).
    1. Prepare amostras de PGC para extração de RNA usando o Sistema RNA Miniprep conforme as instruções do fabricante.
    2. Realize RT-PCR (por exemplo, CVH, DAZL, NANOG e POUV) ou imunocoloração usando marcadores específicos de PGC (SSEA1 e DAZL) de acordo com os protocolospadrão 39 (Figura 2C,D).
    3. Realize análise PCR de sexado de acordo com os protocolospadrão 40 (Figura 2E).

3. Validação da competência da linha germinativa de PGCs cultivados usando marcagem PKH26

  1. Colhe PGCs quando atingem a fase de crescimento logarítmico, tipicamente com uma densidade de aproximadamente 1-5 × 10células de 5 por poço em uma placa de 12 poços.
  2. Faça a peloteia centrifugando a 200 × g por 5 minutos em temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C), ressuspenda em 1× PBS e avalie a viabilidade usando azul de tripân.
  3. Prepare o Diluente C do Kit de Ligação de Células Fluorescentes Vermelhas PKH26 para marcação geral da membrana celular e equilibre-o à temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C).
  4. Reconstitua o corante PKH26 e prepare uma solução de trabalho no Diluente C em concentração final de aproximadamente 1-2 μM.
  5. Ressuspenda o pellet PGC em 1 mL de diluente C. Adicione rapidamente 1 mL de solução de PKH26 (proporção 1:1), misture suavemente e incube por 2 a 5 minutos em temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C).
  6. Adicione rapidamente 1 mL de solução de trabalho PKH26 à suspensão da célula (proporção 1:1), misture suavemente pipetando e incube em temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C) por 2-5 minutos.
    NOTA: Não exceda o tempo recomendado de incubação.
  7. Pare a coloração adicionando de 2 a 4 vezes o volume de FBS ou 1%-5% de BSA no PBS.
  8. Centrífuga a 200 × g, 5 min em temperatura ambiente (aproximadamente 20-25 °C); lave três vezes com meio de cultura PGC ou 1× PBS + 0,1% de BSA.
  9. Ressuspenda as células em buffer de injeção (meio de cultura PGC ou 1× PBS + 0,1% de BSA) em concentração de 1-5 × 104 a 1 ×10 5 células/μL. Mantenha-as brevemente no gelo para preservar a viabilidade.
  10. Verifique a marcação sob um microscópio de fluorescência antes da injeção (Figura 3A).
  11. Injete mais de 3.000 PGCs viáveis e marcados, contados usando azul de tripano, em embriões do estágio HH 14-17 e incube até o dia 6 (Figura 3B).
  12. Confirme a colonização das gônadas receptoras até o dia 6 (Figura 3C).

4. Transplante de PGCs doadores no vaso sanguíneo embrionário receptor

  1. Incube os ovos receptores até o estágio HH 14-17 (37 °C, 60-70% de umidade, balançando a 45° a cada hora).
  2. Prepare uma micropipeta capilar de vidro usando tubos de vidro borosilicato (1,0 mm de diâmetro externo, 0,5-0,75 mm de diâmetro interno). Retire o capilar usando um puxador de micropipeta e polia a ponta até um diâmetro interno de aproximadamente 10-20 μm.
  3. Crie uma pequena janela (aproximadamente 0,5 cm × 0,5 cm) na extremidade pontiaguda do ovo para permitir o acesso à microinjeção e minimizar a perturbação ao embrião.
    NOTA: Esterilize a superfície da casca do ovo com etanol a 70% antes de abrir a janela para evitar contaminação.
  4. Injetar 2 μL de uma suspensão contendo mais de 3.000 PGCs em 1× PBS ou HBSS na aorta dorsal sob um estereomicroscópio.
    NOTA: Realize a injeção sob um estereomicroscópio para evitar danificar o embrião ou os vasos sanguíneos, e manipule cuidadosamente a agulha da microinjeção para evitar lesões.
  5. Sele a janela do ovo com filme de parafina; posicione o ovo com a ponta apontada para baixo e incube até a eclosão a 37,5 °C, 60-70% de umidade, balançando a 45° a cada hora.
    NOTA: Mantenha a temperatura e a umidade adequadas para garantir a viabilidade e o desenvolvimento bem-sucedido do embrião.

5. Validação da quimera germinativa

  1. Colete o testículo ou ovário do filhote de G0 após a eclosão.
  2. Extraia DNA genômico dos tecidos gonadais coletados para confirmar a formação da quimera da linhagem germinal. Realize extração genômica de DNA dos tecidos gonadais coletados da seguinte forma:
    1. Colete testículo ou tecido do ovário, homogeneize em 300 μl de tampão de lise (2 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1% SDS) contendo 1,5 μL de proteinase K e incube a 60 °C para o h, garantindo a lise completa.
    2. Adicione 100 μL de solução de precipitação de proteínas (7 M de acetato de amônio), misture bem e centrifuge a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C.
    3. Transfira o sobrenadante (fase aquosa) para um novo tubo, adicione 500 μL de isopropanol para precipitar o DNA e centrifuge a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C.
    4. Descarte o sobrenadante, adicione 1 mL de etanol a 70% e centrifuge a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C.
    5. Remova o etanol, seco o pellet de DNA ao ar em temperatura ambiente por 10 minutos.
    6. Elude o DNA com 50 μL de água livre de RNase e meça a concentração e pureza do DNA usando um espectrofotômetro (A260/A 280 ≈ 1,8).
    7. Ajuste o DNA para 10-5 ng por reação de PCR.
  3. Realize amplificação por PCR usando primers específicos de espécie que foram projetados (Tabela 1) sob as seguintes condições: 94 °C por 3 minutos seguidos por 35 ciclos de 94 °C por 30 s, 68 °C por 30 s e 72 °C por 30 s, além de uma extensão final a 72 °C por 5 min (Figura 4A).
  4. Colete sêmen de machos G0 sexualmente maduros, extraia DNA de esperma usando o mesmo protocolo e realize PCR usando espoletas específicas para cada espécie (Figura 4B).

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Resultados

Proliferação in vitro e caracterização de PGCs de galinhas
Células gonadais inteiras contendo PGC foram isoladas de embriões nos estágios 26-28 da HH e cultivadas sob condições definidas de cultura PGC. Com o tempo, as células estromais gonadais aderiram à superfície da cultura ou passaram por degradação, enquanto as PGCs permaneceram em suspensão e começaram a proliferar ativamente (Figura 2A). Após aproximadamente duas semanas de cultivo, a pop...

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Discussão

O transplante de células germinativas primordiais (PGCs) cultivadas em embriões receptores fornece um método confiável para produzir quimeras germinativas em galinhas. Esse protocolo aproveita o potencial germinativo intrínseco dos PGCs e melhora a consistência experimental em comparação com sistemas tradicionais baseados em blastoderme, que são propensos ao mosaicismo e à variabilidade do desenvolvimento. Uma vantagem crítica desse método é a expansão seletiva in vitro dos PGCs...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pela bolsa da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiada pelo governo coreano (MSIT) [RS-2024-00418297] e pelo Programa Cooperativo de Pesquisa para Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia Agrícola [RS-2025-02213489] da Administração Coreana de Desenvolvimento Rural.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1x PBS HycloneSH30256
2-MercaptoetanolGibco21985023
Solução Antimicótica Antibiótica (100X)Gibco15240062
Anticorpo anti-DAZLAbcamab215718
Soro de Frango EstérilRocklandD102-00-0500
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovinoSigma aldrich9003-98-9
Microcaps Drummond Micropipets Descartáveis  Drummond Scientific Company1-000-0500
Nucleósídeos EmbryoMax (100X)MerckES-008-D
FBS (Caracterização para Seurm Bovino Fetal, Origem dos EUA, 500ml)HycloneSH30919
Suplemento GlutaMAXGibco35050061
KnockOut DMEMGibco10829018
Solução de Aminoácidos Não Essenciais do MEMGibco11140050
Filme do Laboratório Parafilm MAmcorPM996 
Kit de Ligação de Células Fluorescentes Vermelhas PKH26 para Marcagem Geral de Membranas CelularesSigma aldrichPKH26GL-1KT
Anticorpo purificado anti-camundongo/humano CD15 (SSEA-1)Biolenda125602
Proteína recombinante humana FGF básica/FGF2/bFGF (146 aa) Proteína  R& Sistemas D  233-FB
Sistemas Miniprep de RNA ReliaPrepPromegaZ6011
Piruvato de Sódio (100 mM)Gibco11360070
Solução azul de tripanSigmaT8154-100ML
Tripsina-EDTA (0,5%), sem fenol vermelhoGibco & Trade;15400054

Referências

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