Artigo de método

Desenvolvimento de um Novo Modelo de Fixação Interna para Fraturas do Rádio de Rato: Avaliação da Cicatrização de Fraturas e Isolamento do Gânglio da Raiz Dorsal

DOI:

10.3791/69707

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13 de março de 2026

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1Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, 4Nantong Tongzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Institute of Modern Biology, Nanjing University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O estudo combina de forma inovadora suturas e agulhas de titânio para fixação interna estável em um modelo de fratura radial em rato. A cicatrização das fraturas foi avaliada por meio de microtomografia computadorizada (micro-CT), e neurônios do gânglio da raiz dorsal primária (DRG) foram isolados e cultivados para investigação adicional.

Resumo

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O modelo de fratura radial em ratos é de grande importância na pesquisa ortopédica, especialmente para o estudo dos mecanismos de cicatrização de fraturas, triagem de medicamentos e avaliação de materiais biológicos. Apesar de certas limitações, seu papel na pesquisa científica permanece insubstituível. Como o raio dos ratos é relativamente fino, as placas e parafusos de aço atualmente usados na prática clínica não são adequados para o tratamento de fraturas do rádio em ratos. Para abordar essa limitação, este estudo emprega de forma inovadora a fixação por sutura e agulha de titânio, um modelo interno de fixação para fraturas radiais que proporciona fixação relativamente estável e estabelece um modelo animal robusto para investigar a fixação interna dessas fraturas. Imagens in vivo foram realizadas usando um sistema micro-CT de animais vivos para detectar a cicatrização de fraturas radiais em ratos Sprague-Dawley (SD). A extração e aplicação do DRG do rato são etapas importantes na pesquisa em neurociência, amplamente utilizadas em áreas como neurociência, patologia e biologia celular. Este protocolo é adequado para a cultura primária de neurônios ganglionares da raiz dorsal de ratos com fraturas radiais e pode ser usado para estudar mecanismos de lesão e reparo nervoso após fraturas, como apoptose neuronal e liberação de neurotransmissores.

Introdução

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Fraturas radiais estão entre as mais comuns em casos clínicos, com uma incidência global substancial, e são uma das principais causas de fraturas do osso longo nasextremidades 1,2,3. Estudos populacionais revelam uma distribuição etária bimodal para fraturas do rádio, tipicamente atingindo o pico tanto em populações pediátricas quanto emidosas 4. O tratamento atrasado frequentemente resulta em disfunção rotacional no antebraço, prejudicando gravemente as atividades da vida diária (AVDs)5,6. Persistem controvérsias no manejo das fraturas radiais, centradas principalmente nos sistemas de classificação de fraturas e na seleção de modalidadesde tratamento 7,8. Evidências clínicas sugerem que a fixação interna de redução aberta (ORIF) melhora significativamente a amplitude de movimento (ROM) e a recuperação de força (RANG) da articulação do cotovelo oupunho 9; No entanto, essa abordagem está associada a taxas mais altas de infecções pós-operatórias e complicações internas relacionadasà fixação 10,11.

A DRG serve como uma ponte anatômica e funcional crítica para a transmissão de informações sensoriais entre os sistemas nervoso periférico e central (SNC). Além de seu papel principal na coleta e retransmissão de sinais sensoriais periféricos (por exemplo, toque, temperatura), a DRG regula ativamente sensações anormais como dor, tornando-se uma estrutura fundamental subjacente tanto à função sensorial normal quanto ao manejo clínico dador 12,13,14. Alterações patológicas como lesão, inflamação ou neurodegeneração na DRG podem desencadear anomalias sensoriais (por exemplo, dormência, formigamento) ou dor crônica, posicionando-a como um ponto focal de pesquisas em neurociência e medicina da dor.

Aqui, os ratos machos SD de 8 semanas pesando aproximadamente 200 g foram selecionados para construir (1) um modelo interno de fixação para fraturas transversas radiais em ratos e avaliação pós-cicatrização, e (2) o isolamento e a cultura in vitro de DRGs de ratos com modelo de fixação interna para fraturas radiais. Esse protocolo foi desenvolvido para facilitar experimentos reprodutíveis em estudos que exploram mecanismos de cicatrização de fraturas, alterações sensoriais mediadas por DRG e potenciais alvos terapêuticos para dor ou disfunção pós-fratura.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing (Nº 202508A046). Todos os ratos usados nos ensaios a seguir foram mantidos em condições específicas livres de patógenos (FPS). Um esquema representando o protocolo é mostrado na Figura 1.

1. Estabelecimento de um modelo interno de fixação para fraturas radiais em ratos

NOTA: Os ratos foram acostumados a um ambiente silencioso com iluminação suave e difusa antes da cirurgia, protegendo-os de ruídos e iluminação forte. Durante o manuseio, o abdômen e o peito dos ratos foram sustentados com uma contenção manual suave, evitando agarrar a cauda, uma prática conhecida por causar dor e sofrimento e reduzir o desconforto associado à luta.

  1. Prepare os instrumentos cirúrgicos conforme mostrado na Figura 2. Os instrumentos cirúrgicos incluem uma lâmina de bisturi, um cabo de bisturi, tesouras cirúrgicas, suporte para agulhas, pinças hemostáticas e pinças de tecido dentado. O rato macho Sprague-Dawley (SD) tinha aproximadamente 8 semanas de idade e pesava cerca de 200 g.
  2. Anestesie o rato usando uma máquina de anestesia com gás isoflurano. Para indução, utilize isoflurano a 4% e mantenha anestesia ventilatória (2% isoflurano) usando um cone nasal durante todo o procedimento cirúrgico. Mantenha a temperatura da sala de cirurgia em aproximadamente 28 °C.
    NOTA: Determine o sucesso da anestesia verificando sinais vitais (como respiração e frequência cardíaca), reflexo corneano (sem resposta indica anestesia eficaz), reflexo de piscar (ausência) e resposta à contração dos dedos dos pés (sem retração após a estimulação).
  3. Coloque o rato na posição lateral, exponha o membro dianteiro direito e raspe os pelos usando um aparador de cabelo. Coloque um lençol estéril e enrole um torniquete ao redor do membro anterior direito proximal para reduzir o sangramento cirúrgico.
  4. Prepare a pele alternando álcool e esfoliante betadine três vezes.
  5. Faça uma incisão longitudinal de 1,5 cm no lado radial dorsal do antebraço direito, conforme mostrado na Figura 3. Separe os espaços musculares e exponha totalmente o raio do membro anterior direito.
    NOTA: O raio é exposto ao separar os músculos ao longo do interespaço muscular. Apenas os músculos dorsais do rádio ficam expostos sem desmantelar completamente os músculos ao redor.
  6. Use tesouras de operação para cortar o rádio e criar uma fratura transversal. As tesouras estão orientadas em um ângulo de 90 graus em relação ao raio (Figura 4).
  7. Pegue uma agulha de titânio de 0,8 mm de diâmetro e 10 mm de comprimento e insira-a na fratura do rádio ao longo de seu eixo longitudinal (Figura 5). Fixe o raio e a agulha de titânio com sutura (4-0 [1,5 métrico] de seda trançada não absorvível), como mostrado na Figura 6.
  8. Amarre o ponto com três nós consecutivos e fixar a agulha de titânio no raio por meio de quatro pontos interrompidos.
    NOTA: As extremidades proximal e distal da fratura são fixadas duas vezes, respectivamente.
  9. Suture (seda trançada 4-0 [1,5 métrica] não absorvível) a pele, corte o excesso de sutura e feche a ferida. Desinfete a pele com esfoliantes Betadine.
  10. Cubra a ferida com gaze estéril e prenda-a com bandagens. Coloque o rato em uma gaiola para que recupere a consciência até a recuperação.
  11. Manejo da dor pós-operatória:
    1. Se o animal apresentar sinais de dor, não estiver comendo e/ou hesitar em andar sobre os membros posteriores, consulte a equipe veterinária e administre mais analgésicos.
      NOTA: Cefuroxima sódico é usada no tratamento de infecções bacterianas. O cloridrato de tramadol é usado para administrar analgésicos.

2. Imagem micro CT

  1. Anestesie o rato usando uma máquina de anestesia com gás isoflurano (dose de indução de 4%).
  2. Coloque o rato em posição deitada dentro da câmara de varredura, ajuste a posição dos membros e da cabeça para centralizar a área de varredura do alvo no campo de visão e mantenha ventilação contínua e anestesia (2% de isoflurano) durante todo o procedimento.
  3. Empurre a cama fixa para dentro da câmara de escaneamento e feche a porta da câmara.
  4. Defina os parâmetros de micro-CT da seguinte forma. Modo de varredura: padrão; Tempo de exposição: 2 min; campo de visão: 72 mm; Tamanho do voxel: 144 μm; tensão: 90 kV; corrente: 88 μA; filtro: 3D-suave.
    NOTA: Os dados da varredura são transmitidos automaticamente para o software, e uma imagem de tomografia tridimensional é gerada.
  5. Separe os tecidos alvo.
    1. Analise a área selecionada do tecido ósseo a partir das imagens originais da micro-CT. Deslize a linha da função de transferência para separar o osso do músculo, evitando incluir excesso de tecido muscular. Realize a reconstrução em alta resolução na área segmentada do tecido ósseo para gerar um modelo 3D.
  6. Exporte as imagens processadas.
    1. Após processar as imagens, localize e clique no botão de finalizar para finalizar o fluxo de trabalho atual.
    2. Uma janela pop-up vai aparecer, primeiro selecione a imagem fixa para confirmar que você quer exportar uma imagem estática (não uma sequência dinâmica).
    3. Escolha jpeg como formato de arquivo de saída entre as opções disponíveis.
    4. Selecione tamanho grande para garantir que a imagem exportada mantenha alta resolução adequada para análise ou documentação.
    5. Clique em OK para concluir o processo de exportação.

3. Isolamento e cultura de DRG em ratos com fraturas radiais

NOTA: A eutanásia é administrada com anestesia por inalação de isoflurano a 4%, seguida de uma rápida luxação cervical para eutanasiar os animais. Os DRGs são extraídos 20 dias após o estabelecimento do modelo de fratura radial.

  1. Corte a coluna, remova os corpos vertebrais C1-C7. Corte a coluna cervical ao longo das linhas médias anterior e posterior, e divida-a em metades esquerda e direita. Se necessário, corte os processos espinhosos para facilitar a operação.
  2. Limpe suavemente o tecido da medula espinhal e as fibras nervosas dentro dos forames intervertebrais. Enxágue os forames intervertebrais com uma seringa cheia de PBS para remover o sangue e expor as recessões laterais.
    NOTA: A DRG está localizada dentro dos recessos laterais, apresentando-se como um nódulo amarelo-claro, com fibras nervosas conectadas em ambas as extremidades.
  3. Use pinças de tecido dentadas para pegar a DRG, levante-a suavemente e depois use tesouras para cortar as fibras nervosas em ambas as extremidades.
  4. Transfira os DRGs extraídos para um tubo centrífugo de 1,5 mL com meio de extração; colocar no gelo.
    NOTA: Prepare o meio de extração adicionando 2% de soro fetal bovino (FBS) ao Meio Essencial α-Mínimo (α-MEM). Os DRGs são incubados no meio de extração por cerca de 30 minutos antes de prosseguirem para a próxima etapa.
  5. Aspire lentamente e descarte o meio de extração. Adicione 1 mL da solução funcional de enzimas digestivas mistas. Didiga em banho-maria a 37 °C por 60-70 minutos.
    NOTA: Para preparar a solução de trabalho enzimática digestiva mista, dissolva 100 mg de colagênase tipo I e 100 mg de dispase em 1 mL de Soro Salino Tamponado com Fosfato (PBS). Ao usar, dilua até uma solução funcional de 5 mg/mL e armazene no gelo.
  6. Recubra uma placa de Petri pipeteando um volume apropriado da solução de trabalho com fibronectina, depois incube a 37 °C por 1 hora.
    NOTA: A solução de trabalho de fibronectina plasmática humana (solução de trabalho de fibronectina) é preparada diluindo a solução de estoque de fibronectina de 1 mg/mL com ddH₂O para uma solução de trabalho de fibronectina de 0,02 mg/mL.
  7. Após a digestão, aspire e descarte a solução mista de enzimas digestivas ativas. Adicione 1 mL de meio completo e pipete suavemente o tecido DRG várias vezes.
    NOTA: Para preparar o meio completo, misture 45 mL de meio MEM-α, 4,5 mL de FBS e 0,5 mL de solução de penicilina-estreptomicina (PS), e esterilize por filtração através de uma membrana microporosa de grau esterilizante de 0,22 μm.
  8. Colete filtrado, centrifuge a 75 × g por 8,5 min a 25 °C.
  9. Após a centrifugação, aspire e descarte o sobrenadante no tubo da centrífuga, adicionando 1 mL de meio completo para resuspender o precipitado.
  10. Tire a placa de Petri. Descarte a solução de trabalho de fibronectina e lave com PBS duas vezes.
  11. Inocule as células na placa de Petri revestida, adicione 1 mL de meio completo e incube em uma incubadora de temperatura constante a 37 °C com 5% de CO₂ por 8 a 12 horas.
  12. Após 8-12 horas, substitua o meio completo por meio substituto. Depois, substitua metade do volume pelo meio de reposição a cada 2-3 dias.
    NOTA: Para preparar o meio de reposição, misture 44,5 mL de meio MEM-α, 4,5 mL de FBS, 0,5 mL de solução de Penicilina-Estreptomicina (PS) e 0,5 mL de Desoxiuridina. Esterilize por filtração através de uma membrana microporosa de grau esterilizante de 0,22 μm.

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Resultados

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As imagens micro-CT confirmaram o estabelecimento bem-sucedido de modelos de ratos de fratura radial na Figura 7 e o modelo de fixação interna para fraturas radiais em ratos na Figura 8. As imagens micro-CT foram comparadas entre o dia da construção do modelo de fixação interna da fratura e vinte dias após o estabelecimento do modelo. Vinte dias após a modelagem, a análise micro-CT de ratos SD no grupo modelo de fratura revelou ...

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Discussão

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A fratura radial é uma das fraturas de osso longo mais comuns na prática clínica. Seu processo de cicatrização envolve interações complexas entre reparação do tecido ósseo e regulação neural (como a regulação de osteoblastos/osteoclastos por neuropeptídeos e fatores neurotróficos liberados pelo gânglio da raiz dorsal)15,16,17,18. Os ratos são um modelo clássico...

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Divulgações

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Todos os autores declaram que não têm conflitos de interesse potenciais.

Agradecimentos

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Esse trabalho foi apoiado por subsídios do projeto de pesquisa científica da Sociedade de Medicina Tradicional Chinesa de Jiangsu (XYLD2024038) e do projeto de pesquisa científica do Comitê de Saúde e Bem-Estar de Nantong (QNZ2023115).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5-Fluoro-2' desoxiuridinasigmaF0503
Cefuroxima sódica Shandong Runze Pharmaceutical Co., Ltd., ChinaGuoyao Zhunzi H20205058
Solução de Coloração DAPIBiyotimeC1005
DispersaseShanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd.S25046
Soro fetal bovino (FBS)Termodinâmica16000-044
pinça hemostática  Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J31070
Fibronectina plasmática humana (Fibronectina Humana) & nbsp;sigmaF0895
IsofluranoRWDR510-22-10 
Sistema de micro-CT de animais vivosPerkinElmer nos EUAQuantum GX 
Meio de cultura MEM-ALPHA  BIC3060
suporte para agulhas Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;200622
tesouras operacionais Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J21130
PenicilinaSolarbio140051251
Solução de penicilina-estreptomicina NovaCellsN-PSS125
Povidona-iodoMeilunbioMB1313800g
Lâmina de bisturiShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd.RYY070
Cabo de bisturiShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J11010
sutura Johnson & Johnson MEDICAL (CHINA) Ltd. SA84G
agulha de suturaEquipamentos médicos Shanghai XIAOYU.& Delta; 3/8 & middot; 3 vezes; 6
agulha de titânioDispositivo Médico Tianjin Yutong  2-0X250 
pinças de tecido dentado  Shanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd. & nbsp;J41055
Cloridrato de tramadolJiangsu Jiuxu Pharmaceutical Co., Ltd., ChinaCYHB2201997
Tubulina beta-IIIsigmaCBL412X
Colaganose tipo I  Termodinâmica17100-017
Microscópio de fluorescência invertida Zeiss Axio Vert A1ZeissAxio Vert A1

Referências

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