A resistência à Teicoplanina é detectada pelo sistema automatizado em cepas de Staphylococcus spp confiável?

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para avaliar a confiabilidade de um sistema automatizado (VITEK 2) para determinar a suscetibilidade à teicoplanina em isolados de Staphylococcus por comparação com microdiluição de caldo (DMO), com aplicações na confirmação da resistência e na orientação de terapias antimicrobianas adequadas.

Resumo

Um total de 467 isolados de Staphylococcus aureus (S. aureus) e 66 isolados de Staphylococcus (CoNS) coagulase-negativos coletados entre junho de 2022 e dezembro de 2024 foram incluídos neste estudo. O teste de suscetibilidade à Teicoplanina foi realizado utilizando o sistema automatizado de teste de suscetibilidade antimicrobiana, microdiluição de caldo (BMD) e um método de teste de gradiente. A resistência à meticilina foi detectada em 71,7% dos isolados de S. aureus e em todos os isolados de CoNS. Neste estudo, 13 isolados de S. aureus e 4 isolados de CoNS foram identificados como resistentes à teicoplanina por meio de um sistema automatizado de teste de suscetibilidade. Todos os 13 isolados de S. aureus foram considerados suscetíveis à teicoplanina tanto pelo teste de gradiente quanto pela DMO. Todos os quatro isolados de CoNS foram identificados como suscetíveis pelo teste de gradiente, enquanto a DMO classificou dois isolados como suscetíveis e dois como resistentes. A resistência à Teicoplanina foi detectada em quatro cepas [S. capitis (n = 1) e S. haemolyticus (n = 3)] entre os isolados de CoNS por DMO. As quatro cepas de CoNS resistentes à teicoplanina identificadas pela DMO foram isoladas de hemoculturas; três foram obtidos de pacientes pediátricos e um de um paciente adulto. No geral, a taxa de S. aureus resistente à meticilina (MRSA) foi relativamente alta no estudo, e todos os isolados de CoNS foram resistentes à meticilina. Além disso, sistemas automatizados mostraram-se pouco confiáveis para determinar resistência à teicoplanina, e isolados identificados como resistentes devem ser confirmados pela DMO. Considerando que a teicoplanina é um antibiótico de último recurso usado para tratar patógenos como MRSA e CoNS resistente à meticilina, sua suscetibilidade deve ser monitorada de perto.

Introdução

Staphylococcus aureus (S. aureus) é uma das espécies de Staphylococcus mais clinicamente significativas devido à sua ampla gama de fatores de virulência e à sua capacidade de causar infecções graves em diversos tecidos e órgãos. É responsável por infecções de pele e tecidos moles, infecções profundas, infecções do trato respiratório, infecções urinárias e infecções da corrente sanguínea, e continua sendo um dos patógenos mais importantes em ambientes^{hospitalares 1,2}. Em particular, a S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é uma das principais causas de infecções associadas à saúde em todo o mundo e continua sendo uma das principais causas de infecções pós-operatórias^{de feridas 2,3}. Estafilococos coagulases negativos (CoNS), embora façam parte da flora cutânea normal, têm sido cada vez mais implicados em infecções locais e sistêmicas nos últimos anos. Esse aumento levou a testes de suscetibilidade antimicrobiana mais frequentes e, consequentemente, a maior detecção da resistência a antibióticos glicopeptídicos, como a^{teicoplanina 4}.

Como as cepas de S. aureus e CoNS comumente apresentam resistência a antibióticos β-lactâmicos, os antibióticos glicopeptídicos, principalmente vancomicina e teicoplanina, são amplamente utilizados no tratamento dessas infecções5. A crescente prevalência de patógenos nosocomiais gram-positivos resistentes levou ao uso ampliado de glicopeptídeos, o que contribuiu para a diminuição da suscetibilidade bacteriana a esses^{agentes 5,6}. Vancomicina e teicoplanina têm eficácia antimicrobiana comparável; No entanto, vários estudos demonstraram que a teicoplanina está associada a menos efeitos adversos, especialmente redução da^{nefrotoxicidade 7,8}. Portanto, a teicoplanina é frequentemente considerada uma alternativa adequada à vancomicina em populações específicas de pacientes, incluindo aqueles com neutropenia, bacteriemia ou função renal^{comprometida.}

A determinação rápida e precisa da suscetibilidade aos glicopeptídeos é importante devido ao uso generalizado desses agentes em infecções por Staphylococcus resistentes à meticilina e aos crescentes relatos de cepas resistentes a^{glicopeptídeos 11}. Existem vários métodos laboratoriais disponíveis para avaliar a suscetibilidade a glicopeptídeos em espécies de Staphylococcus, incluindo diluição de ágar, testes de gradiente, microdiluição de caldo (BMD) e sistemas automatizados de testes de suscetibilidade^{antimicrobiana 5}. Estudos anteriores relataram discrepâncias entre sistemas automatizados e métodos de referência na detecção de suscetibilidade ou resistência reduzida a glicopeptídeos, particularmente teicoplanina, nas espécies^{Staphylococcus 4,11}.

O presente estudo teve como objetivo avaliar a confiabilidade do sistema automatizado de teste de suscetibilidade a antimicrobianos para determinar a suscetibilidade à teicoplanina em isolados de Staphylococcus , em comparação com o método de microdiluição do caldo, o padrão de referência. A avaliação das características de desempenho do sistema automatizado pode ajudar laboratórios clínicos a avaliar sua adequação para a detecção rotineira da suscetibilidade a glicopeptídeos na prática clínica.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo comitê local de ética em 27 de janeiro de 2025 (número do protocolo: HRU/25.02.03). O estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque.

1. Desenho do estudo

Este estudo retrospectivo avaliou o desempenho do sistema automatizado de teste de suscetibilidade antimicrobiana para determinar a suscetibilidade à teicoplanina em espécies de Staphylococcus , comparando os resultados com o método de referência de microdiluição do caldo (BMD) e um método de teste de gradiente.

2. Seleção isolada

1. Coleção de isolados clínicos
   1. Inclua um total de 467 isolados de S. aureus e 66 isolados de Staphylococcus (CoNS) coagulase-negativos obtidos de várias amostras clínicas entre junho de 2022 e dezembro de 2024.
   2. Processe todas as amostras clínicas de acordo com procedimentos microbiológicos rotineiros no laboratório diagnóstico.
   3. Inclua apenas um isolado por paciente na análise. Exclua isolados repetidos obtidos de diferentes amostras do mesmo paciente.
2. Identificação inicial e triagem
   1. Identifique todos os isolados no nível da espécie usando espectrometria de massa de tempo de voo de ionização assistida por dessorção a laser por matriz (MALDI-TOF MS).
   2. Testes S. aureus e CoNS isolam resistência à meticilina e suscetibilidade à teicoplanina usando cartões VITEK 2 AST-P664 com o sistema automatizado de teste de suscetibilidade.
   3. Registre os valores de concentração mínima inibitória (CIM) gerados pelo sistema automatizado de testes de suscetibilidade para comparação posterior.
3. Armazenamento isolado e subcultura
   1. Armazene isolados a −80 °C em caldo de soja tríptico suplementado com 20% de glicerol após o sistema automatizado de teste de suscetibilidade.
   2. Antes do teste de referência, isolação de descongelamento em temperatura ambiente e subcultura duas vezes em ágar de sangue de ovelha a 5%.
   3. Incube as placas a 37 °C por 24 horas após cada passagem para garantir pureza e viabilidade.

3. Teste de suscetibilidade a antimicrobianos

1. Microdiluição do caldo (DMO)
   1. Preparação de soluções de Teicoplanina
      1. Prepare uma solução padrão de pó de teicoplanina em concentração de 2560 mg/L em caldo Mueller-Hinton ajustado por cations (CAMHB).
   2. Procedimento de microdiluição do caldo
      1. Realize testes de microdiluição do caldo usando microplacas estéreis de fundo em U de 96 poços.
      2. Dispense 100 μL de CAMHB em cada poço. Dilua a solução de teicoplanina dez vezes mais e adicione 100 μL ao primeiro poço.
      3. Prepare diluições seriadas em duas vezes entre os poços 1 a 10 para obter concentrações finais de antibiótico variando de 64 a 0,125 μg/mL.
      4. Use o poço 11 como controle de crescimento contendo CAMHB e inoculo bacteriano. Use o poço 12 como controle negativo, contendo apenas o CAMHB¹².
   3. Preparação e incubação do inoculo
      1. Suspenda colônias bacterianas puras em soro estéril e ajuste a suspensão para uma turbidez equivalente a um padrão McFarland de 0,5.
      2. Prepare uma diluição 1:100 no CAMHB e adicione 100 μL da suspensão bacteriana aos poços 1–11 para alcançar uma concentração final do inoculo de aproximadamente 5 × 10,5 CFU/mL.
      3. Incubar as microplacas a 37 °C por 24 horas sob condições atmosféricas^{ambientes 12}.
   4. Determinação e interpretação de MIC
      1. Defina a concentração inibitória mínima (CMI) como a menor concentração de teicoplanina que inibe completamente o crescimento bacteriano visível após a incubação.
      2. Interpretar os valores de CMI de acordo com as diretrizes 14.0 do Comitê Europeu de Testes de Suscetibilidade Antimicrobiana (EUCAST^{) 13}.

4. Controle de qualidade

1. Use Staphylococcus aureus ATCC 29213, com uma faixa de referência de MIC de teicoplanina de 0,25–1 mg/L, como cepa de controle de qualidade.

5. Análise estatística

1. Comparação de métodos
   1. Compare os resultados de CIM de teicoplanina obtidos usando o sistema automatizado de teste de suscetibilidade com os obtidos pelo método de referência BMD.
   2. Defina concordância categórica (AC) como resultados concordantes suscetíveis ou resistentes entre os dois métodos.
2. Classificação de erro
   1. Defina erros muito graves (VME) como isolados categorizados como suscetíveis pelo sistema automatizado de testes de suscetibilidade, mas resistentes à DMO.
   2. Defina erros maiores (ME) como isolados categorizados como resistentes pelo sistema automatizado de testes de suscetibilidade, mas suscetíveis pela DMO.
3. Critérios de desempenho
   1. Considere o desempenho do método aceitável quando o acordo categórico é ≥90% e as taxas de VME e ME são ≤3%, de acordo com os critérios de avaliação^{publicados 14,15}.

Resultados

Um total de 533 isolados recuperados de amostras clínicas ao longo de um período de 2,5 anos foram incluídos na análise. Todos os isolados de CoNS resistente à meticilina (MR-CoNS), e 71,7% dos isolados de S. aureus , foram considerados resistentes à meticilina. Amostras de swab de feridas foram as amostras clínicas mais comuns que forneceram isolados de S. aureus , enquanto os isolados de MR-CoNS foram mais frequentemente recuperados de hemoculturas (

Discussão

A resistência aos antimicrobianos é uma das ameaças mais significativas à saúde pública global, contribuindo para o aumento dos custos de saúde, falhas de tratamento e^{mortalidade 3}. A incidência de infecções adquiridas tanto na comunidade quanto em hospitais causadas pelo Staphylococcus aureus continua a aumentar nacional e globalmente. A resistência à meticilina, em particular, está associada ao aumento da morbidade e mortalidade; portanto, perfis de res...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo Mueller Hinton Ajustado por Cations	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha	CM0405B	Para crescimento bacteriano no método de microdiluição do caldo
MALDI-TOF MS	VITEK MS, BioMé rieux, França	410893	Para identificação bacteriana
Padrão McFarland	bioMé rieux, França	95060-958	Padronização do inóculo bacteriano
Placas de Petri	RTA, Tü Rkiye	2102	Para preparação em meio e cultivo bacteriano
Ponta de Pippette 20 - 200 e mu; L	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha	Z740105	Para a distribuição de Mueller e traço ajustados catiônicamente; Caldo Hinton (CAMHB) em microplacas U-bottom e preparação de diluições seriadas
Ágar de sangue de ovelha	RTA, Tü Rkiye	2001	Isolamento e cultivo de microrganismos
Staphylococcus aureus	Coleção de Cultura do Tipo Americano	29213	Cepa de referência utilizada neste estudo
Pó de teicoplanina	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha	T0578	Antibióticos
Caldo de soja tríptico	Merck, Alemanha	1,054,590,500	Isolamento e cultivo de microrganismos
Placa do poço inferior em U	Thermo Fisher Scientific	163320	Para testes de suscetibilidade antimicrobiana pelo método de microdiluição de caldo
VITEK 2 cartões AST-P664	bioMé rieux, França	414197	Para testes de suscetibilidade a antimicrobianos
VITEK2 Compact	bioMé rieux, França	4700030	Para testes de suscetibilidade a antimicrobianos