Isolamento de Perícitos de Tecido Cortical de Camundongos Usando FACS para Sequenciamento de Células Únicas

Resumo

Para obter perícitos corticais cerebrais de camundongo que atendam às demandas do scRNA-seq, apresentamos um protocolo FACS criticamente otimizado baseado na seleção CD13⁺/CD31⁻. Nossos principais aprimoramentos melhoram significativamente a viabilidade celular e a integridade do RNA, permitindo um perfil transcriptômico confiável.

Resumo

Os perícitos, como componente central da unidade neurovascular, desempenham um papel vital na manutenção da integridade da barreira hematoencefálica e na regulação da homeostase hemodinâmica cerebral por meio da modulação do tônus microvascular. A disfunção dos perícitos tem sido implicada em uma variedade de distúrbios neurológicos. Para investigar a heterogeneidade dos perícitos e elucidar seus mecanismos em doenças neurovasculares com resolução de célula única, estabelecemos um protocolo otimizado e reprodutível para isolar pericitos cerebrais de camundongos adequados para sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq). Esse método se baseia na estratégia estabelecida ^{de ordenação} CD13⁺/CD31, mas incorpora melhorias importantes especificamente direcionadas para aplicações scRNA-seq. Brevemente, cérebros foram colhidos de três camundongos adultos C57BL/6. Os tecidos cerebrais foram dissociados mecanicamente e submetidos a digestão enzimática para obter suspensões de célula única. Após a centrifugação sequencial, o pellet celular final foi ressuspenso em solução de albumina sérica bovina (BSA) a 20%, um passo fundamental que introduzimos para minimizar o estresse e a agregação, maximizando assim a viabilidade e a qualidade do RNA para o sequenciamento. Essa abordagem otimizada baseada em FACS permite assim o isolamento robusto de perícitos cerebrais de camundongos viáveis que atendem aos rigorosos requisitos para scRNA-seq, oferecendo uma ferramenta poderosa para dissecar a heterogeneidade dos perícitos e seus papéis patológicos em doenças neurovasculares.

Introdução

Perícitos são um tipo importante de célula localizada ao longo de microvasos, tipicamente embutida na membrana basal capilar e envolvendo células^{endoteliais 1}. No cérebro, os perícitos, juntamente com células endoteliais, astrócitos e outros tipos celulares, formam a unidade neurovascular e são parte integrante da estrutura e função da barreira hematoencefálica (BBB). Os perícitos desempenham papéis essenciais na regulação do fluxo sanguíneo cerebral, remodelação vascular e manutenção da homeostase vascular. Eles mantêm a integridade do BBB por meio de interações físicas próximas e sinalização paracrina com células^{vizinhas 2}; regulam dinamicamente o transporte transendotelial por meio da endocitose e da expressão de proteínas transportadoras específicas; e contribuem para a estabilidade hemodinâmica cerebral por meio de suas atividades contráteis e^{relaxantes 3}. A disfunção dos perícitos, assim como alterações em sua cobertura ou densidade, pode levar à desregulação vascular e déficits neurológicos, resultando, em última instância, em alterações patológicas associadas a vários distúrbios^{neurológicos 4}. No entanto, a heterogeneidade inerente dos perícitos apresenta desafios significativos para estudos mecanicistas futuros.

Com o avanço da tecnologia de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq), um número crescente de estudos tem utilizado o scRNA-seq para explorar a heterogeneidade celular e identificar alvos-chave na patogênese e progressão de doenças. Marcadores de perícitos comumente usados incluem receptor-beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR-β)⁵, antígeno glial neurônio 2 (NG2) e actina do músculo alfa-liso (α-SMA). No entanto, esses marcadores têm especificidade⁶ relativamente baixa, pois podem simultaneamente marcar outras células vasculares, como células musculares lisas, e células precursoras neurais, como células progenitoras do oligodendrócito, dificultando a distinção de perícitos de outras células cerebrais. Em busca de uma alternativa mais robusta, recorremos ao CD13 (Aminopeptidase N, APN), um marcador amplamente reconhecido por sua expressão forte e consistente em perícitos cerebrovasculares em estudos^anteriores 7,8,9,10. Em nosso estudo, realizamos coloração por imunofluorescência em seções de tecido cerebral, e os resultados confirmaram a expressão do CD13 em perícitos, demonstrando sua eficácia em distinguir perócitos de células endoteliais, já que o sinal do CD13 estava associado exclusivamente a células perivasculares e ausente das células endoteliais CD31⁺. (Figura 1A). No entanto, é importante notar que a expressão do CD13 não é totalmente exclusiva dos perícitos; Níveis detectáveis também são observados em células musculares lisas de arteríolas e vénulas (Figura 1B,C).

Figura 1: A coloração imunofluorescente mostra a expressão do CD13 em perícitos vasculares cerebrais e células musculares lisas, sem sinal detectável nas células endoteliais. (A) Imagem representativa de imunofluorescência da zona de transição arteríol-capilar na microvasculatura cerebral. A imagem fundida mostra perícitos CD13⁺ (verde) envolvendo células endoteliais CD31⁺ (vermelho). As células musculares lisas ^α-SMA+ (ciano) estão localizadas na região arteriolar e estão ausentes dos capilares. (B) Corte transversal de uma arteríola. As imagens demonstram clara colocalização das células musculares lisas CD13⁺ (verde) e ^α-SMA+ (ciano) na camada muscular lisa ao redor, confirmando a expressão de CD13 nas células musculares lisas arteriolares. (C) Seção transversal de uma vénula. Da mesma forma, CD13 (verde) é detectável nas células musculares lisas α-SMA (pontas de flecha) da parede venular. Barra de escala: 20 μm (A-C). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Para obter perícitos vasculares corticais de camundongos que atendam aos requisitos para scRNA-seq, realizamos a separação celular ativada por fluorescência (FACS) usando marcação de anticorpos CD13⁺/CD31⁻ para isolamento^{de pericícitos 11}. Inicialmente, os marcadores CD45 e CD41 foram usados para excluir células hematopoiéticas das suspensões de tecido^{cerebral 12}. Subsequentemente, os perícitos foram enriquecidos pela seleção de células CD13⁺ , e as células endoteliais foram ainda excluídas por meio do gating ^{para populações} CD31, isolando assim a população alvo de^{perícitos 13}.

Reconhecemos que a etapa de seleção positiva para CD13 captura simultaneamente células musculares lisas que expressam CD13 tanto de arteríolas quanto de vénulas. Para cumprir os requisitos críticos de scRNA-seq e maximizar a retenção de perícitos, selecionamos estrategicamente essa combinação de marcadores para priorizar o rendimento de perícitos na fase de separação. Embora essa abordagem leve ao co-isolamento de uma população menor de células musculares lisas, ela maximiza efetivamente a recuperação de todos os perícitos potenciais durante a fase preliminar de enriquecimento. Essa estratégia de gate progressivo minimiza significativamente a perda celular inicial. Além disso, para maximizar a viabilidade e o rendimento dos pericitos, também utilizamos uma solução de BSA de 20% para ressuspensão e filtração celular pós-dissociação, removendo efetivamente detritos enquanto preserva a viabilidade e pureza da célula^{classificada 14}.

Usando esse método, distinguimos com sucesso os perícitos vasculares cerebrais de outros tipos celulares, alcançando preparações de perícitos de alta pureza e alta viabilidade que atendem aos rigorosos requisitos para o scRNA-seq. Essa técnica fornece uma base sólida para investigações aprofundadas subsequentes sobre os papéis dos perócitos em diversos contextos de doença.

Protocolo

Neste estudo, usamos três camundongos adultos C57BL/6J (3 meses de idade, 20-25 g). Todos os camundongos foram alojados sob um ciclo de 12 horas de luz/escuro com temperatura e umidade rigorosamente controladas, com livre acesso a comida e água antes dos experimentos. Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais de laboratório foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Ética de Animais de Laboratório do Instituto de Microcirculação, Academia Chinesa de Ciências Médicas e Faculdade de Medicina da União de Pequim, e foram conduzidos em estrita conformidade com as diretrizes relevantes de bem-estar animal.

1. Preparação de reagentes

1. Solução de glicose 30% (peso por volume): Dissolva 15 g de glicose em 50 mL de dH₂O livre de DNase UltraPure/RNase. Para garantir a dissolução completa, primeiro adicione glicose a 20 mL de UltraPure DNase/RNase-free_{dH 2}O e misture bem. Depois, adicione UltraPure DNase/_{dH 2}O livre de RNase a um volume final de 50 mL. Filtre a solução e armazene a 4 °C por até 6 meses.
2. DNase I (10 mg/mL): Dissolva 50 mg de DNase I em 5 mL de ddH_2Oestéril. A solução padrão pode ser armazenada a -20 °C por até 2 meses.
   NOTA: Ciclos repetidos de congelamento-descongelamento devem ser estritamente evitados para evitar a perda de atividade enzimática. Para minimizar os efeitos de congelamento-descongelamento, coloque 150 μL da solução em tubos de microcentrífuga estéreis antes do congelamento inicial e descongele aliquotas individuais conforme necessário para os experimentos.
3. Soro Fetal Bovino (FBS) 2% (vol/vol) em soro salino tamponado com fosfato (PBS): Prepare 1× PBS misturando 5 mL de 10× PBS com 45 mL de UltraPure DNase/RNase-free_{dH 2}O. Adicione 1 mL de FBS a 49 mL de 1× PBS e misture bem.
   NOTA: Prepare esta solução de forma renovada durante a Etapa 2.1.2. Aloque 15 mL por amostra de tecido.
4. Solução de colagenase e enzima dispase (CD): Dissolva 100 mg de dispase e 100 mg de colagênase separadamente em 1 mL de UltraPure DNase/dH_{livre de RNase 2}O cada. Combine as soluções para obter um volume final de 2 mL (concentração enzimática de 100 mg/mL).
   NOTA: Aliquota 500 μL em tubos microcentrífugas estéreis e armazene a -20 °C. Faça vórtice antes do uso para evitar perda de atividade devido a ciclos de congelamento e descongelamento. É importante notar que a forma em pó pode causar irritação severa na pele/olhos e dificuldades respiratórias. Sempre manuseie em uma capela química enquanto usa luvas de nitrilo e uma máscara N95. Em caso de exposição, irrigue imediatamente a área afetada com água abundante e procure atendimento médico.
5. Solução de trabalho enzimática CD: Misture 1,5 mL de solução estocada de enzima CD com 43,5 mL de FBS 2% (vol/vol) em PBS (do Passo 1.3) por inversão suave.
   NOTA: Prepare-se imediatamente antes da dissociação dos tecidos (Passo 2.3.4). Esse volume é otimizado para três mouses; Ajuste proporcionalmente conforme necessário.
6. Solução de Percoll 22% (vol/vol): Combine 11 mL de Percoll, 5 mL de 10× PBS e 34 mL de UltraPure DNase/dH₂O livre de RNase para preparar uma solução de 50 mL.
   NOTA: Filtre-esterilize através de uma membrana PES de 0,22 μm. Pode ser armazenado a 4 °C por um mês sem perda significativa de estabilidade.
7. Buffer de dissociação mecânica: Adicionar 1 mL de DNase I (10 mg/mL) a 10 mL de 2% (vol/vol) FBS no PBS (do Passo 1.3). Misture pipetando.
8. Soluções BSA: Prepare soluções BSA de 1%, 20% e 35% (peso/volume) separadamente, conforme segue:
   1. 1% (em poj/vol) BSA: Dissolva 0,15 g de BSA em 15 mL de Soro Tamponado com Fosfato (DPBS) da Dulbecco.
   2. 20% (em peso/vol) BSA: Dissolva 3 g de BSA em 15 mL de DPBS.
   3. 35% (peso por volume) BSA: Dissolva 0,7 g de BSA em 2 mL de DPBS.
      NOTA: Filtre todas as soluções através de uma membrana PES de 0,22 μm antes do uso.
9. Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)/BSA/Buffer de glicose: Adicione 167 μL de glicose a 30% (peso por volume) (do Passo 1.1) e 1,4 mL de 35% (peso/vol) de BSA (do Passo 1.8) a 50 mL de HBSS, misture suavemente.
   NOTA: Prepare esta solução fresca sob condições estéreis durante a Etapa 2.1.2. Armazene a 4 °C até o uso.
10. Buffer de Coleta de Tecido: Suplemente 12 mL de HBSS/BSA/Glicose Buffer (do Passo 1.9) com 800 μL de DNase I (10 mg/mL). Use para armazenamento temporário de tecido e enxágue de pipeta.
    NOTA: Prepare esta solução fresca sob condições estéreis durante a Etapa 2.1.2.
11. 1,25% (p/v) Solução de Tribromoetanol: Dissolva 1,25 g de 2,2,2-Tribromoetanol em 2,5 ml de 2-Metil-2-butanol e, em seguida, adicione essa mistura a 97,5 ml de ddH_2Oestéril ou solução fisiológica para obter uma solução clara de 1,25% de Tribromoetanol.
    NOTA: Prepare a solução de forma limpa antes de cada utilização. Guarde-o protegido da luz em temperatura ambiente e use prontamente.

2. Procedimento Experimental (usando três camundongos como exemplo)

1. Preparação pré-experimento (Tempo: 30 min)
   1. Autoclave exigia consumíveis e desinfetar instrumentos cirúrgicos com etanol de 75% (vol/vol).
   2. Prepare soluções funcionais: 1× PBS (do Passo 1.3), FBS 2% (vol/vol) no PBS (do Passo 1.3), HBSS/BSA/solução de glicose (do Passo 1.9) e tampão de coleta de tecido (do Passo 1.10).
   3. Despeje 10 mL de 1× PBS em uma tigela de 10 cm para células e mantenha-a no gelo.
   4. Prepare três ampolas, adicione 3 mL de tampão de coleta de tecido em cada uma e mantenha-as no gelo.
   5. Prepare três tubos centrífugos de 15 mL, adicione 10 mL de FBS 2% (vol/vol) em PBS em cada um e mantenha-os no gelo.
2. Colheita de cérebro de rato (Tempo: 30 min)
   1. Os camundongos foram profundamente anestesiados por injeção intraperitoneal de tribromoetanol (a partir do Passo 1.11) em uma dose de 0,2 mL por 10 g de peso corporal. Após a perda dos reflexos pedais, a eutanásia foi realizada por luxação cervical.
      NOTA: Se o camundongo não atingiu o plano cirúrgico de anestesia (avaliado pela ausência de reflexo de retirada pedal) dentro de 5 a 10 minutos após a injeção, uma dose suplementar intraperitoneal de tribromoetanol, igual a um terço da dose inicial, foi administrada.
   2. Borrife a região da cabeça/pescoço com 75% de etanol. Faça uma incisão na linha média do couro cabeludo da região occipital até a frontal para expor o crânio. Realize uma incisão transversal anterior às órbitas bilaterais, seguida de incisões laterais ao longo das margens inferiores do cerebelo para descolar a base do crânio. Por fim, incise o calvário longitudinalmente ao longo da sutura sagital, de posterior para anterior. Levante o retalho craniano para expor o cérebro envolto em dura-máter dura. Eleve suavemente o cérebro enquanto corta os nervos ópticos e a conexão da medula oblonga com tesoura^{cirúrgica 15}. Coloque o cérebro intacto em uma panela de 10 cm contendo 10 mL de 1× PBS gelada.
      NOTA: Manuseie o tecido com cuidado para evitar danos.
   3. Transfira o cérebro para papel alumínio. Usando pinças, levante a dura-máter das margens e excise-a ao longo dos sulcos médios. Após a remoção completa da dura-máter, expor o espaço subaracnoideo. Enxágue o espaço subaracnoide com solução HBSS, depois dissece os vasos com uma agulha romba e remova cuidadosamente a pia^{mater 16}. Divide o cérebro coronalmente em fatias de 2-3 mm de espessura usando uma lâmina de barbear. Descarte as seções mais bulbosas e caudais do olfato. Isolar o córtex cerebral ao longo do corpo caloso e transferir o tecido cortical para ampolas contendo 3 mL de tampão de coleta de tecido^{gelado 11}.
   4. O isolamento de perócitos nesse protocolo tem como alvo específico o córtex cerebral. Para outras regiões de interés: coloque seções coronais em um slide de dois poços com uma queda de 2% (vol/vol) FBS no PBS. Identificar as regiões alvo sob microscopia de dissecação, isolar manualmente e prosseguir com etapas de processamento idênticas subsequentes.
3. Dissociação de tecidos (Tempo: 3-3,5 h)
   1. Picar tecidos em ampolas usando bisturi cirúrgicos em fragmentos de aproximadamente 1 mm × 1 mm.
      NOTA: Complete a moagem em até 5 minutos para preservar a frescura dos tecidos.
   2. Antes de enxaguar as pontas da pipeta com um tampão de coleta de tecido. Aspire lentamente fragmentos picados em direção ao ápice da ponta mantendo a orientação vertical (ponta para baixo). Expulse suavemente fragmentos em tubos centrífugos pré-resfriados de 15 mL (preparados no Passo 2.1.5).
      NOTA: Evite aspirar fragmentos para o barril superior para evitar aderência à parede da pipeta.
   3. Lave as ampolas contendo fragmentos (do Passo 2.3.1) com 2% (vol/vol) FBS em PBS e transfira a lavagem para tubos de centrífuga. Centrifuge a 300 x g a 4 °C por 5 minutos.
   4. Descarte os supernadantes após a centrifugação. Ressuspenda pellets em 3 mL de solução de trabalho enzimática CD (do Passo 1.5) por tubo. Aliquota cada suspensão igualmente em três tubos (total de 9 tubos, 1 mL/tubo), depois suplemente com 4 mL de solução de trabalho enzimática CD (volume final: 5 mL/tubo).
   5. Incube os tubos em um forno de hibridização a 37 °C por 100 minutos com agitação orbital a 100 x^{g 14}.
   6. Prepare a solução de dissociação tecidular durante a incubação adicionando 1 mL de solução de DNase I a 10 mL de FBS a 2% (vol/vol) no PBS (do Passo 1.10).
   7. Termine a digestão por centrifugação a 300 x g a 4 °C por 5 minutos.
      NOTA: Avalie a eficiência digertiva microscopicamente usando uma alíquota de 10-20 μL. O ponto final ideal se manifesta como fragmentos vasculares em forma de conta; Segmentos vasculares alongados indicam digestão insuficiente, enquanto células únicas predominantes indicam excesso de digestão.
   8. Ressuspenda pellets em 1 mL de solução de dissociação de tecidos por tubo. Dissocie mecanicamente pipetando 100 vezes¹¹.
      NOTA: Evite aspiração em volume total de pipeta para minimizar a formação de bolhas e preservar a viabilidade celular.
   9. Agrupe todas as suspensões (de um total de 9 tubos de digestão representando os tecidos cerebrais de 3 camundongos) em um tubo centrífugo de 50 mL. Enxague cada tubo de digestão com 2 mL de FBS 2% (vol/vol) em PBS e combine as lavagem. Centrifuge a 300 x g a 4 °C por 5 minutos.
   10. Após a centrifugação, camadas distintas ficam visíveis. Descarte cuidadosamente a camada superior (contendo impurezas e pequenos detritos celulares), mantendo a camada intermediária (composta por células ou agrupamentos celulares de menor densidade) e a camada inferior (células intactas e fragmentos de tecido parcialmente não digeridos). Adicione 12,5 mL de solução de BSA a 20% e inverta suavemente o tubo para resuspender os pellets. Centrifuge novamente a 1000 × g a 4 °C por 20 minutos.
   11. Colete o pellet inferior (enriquecido em células intactas de maior pureza) e transfira o sobrenadante (contendo principalmente detritos de mielina, lipídios e um pequeno número de células) para um novo tubo centrífugo de 50 mL. Resuspenda por inversão suave e repita a centrifugação a 1.000 x g a 4 °C por 20 minutos.
   12. Resuspenda cada pellet obtido das duas etapas de centrifugação (passo 2.3.10 e Passo 2.3.11) em 2 mL de 2% (vol/vol) FBS em PBS cada (volume combinado final: 4 mL).
       NOTA: Evite tocar nas paredes dos tubos durante a resuspensão para minimizar a contaminação por detritos.
   13. Combine as duas suspensões ressuspensas do passo anterior em um tubo centrífugo de 15 mL. Centrifugar a 300 × g, 4 °C por 5 minutos. Descarte o sobrenadante (tampão de resíduos contendo BSA, detritos celulares e potencialmente traços de lipídios residuais de mielina). Ressuspenda o pellet (as células-alvo finais purificadas e lavadas, de alta pureza intacta) em 2 mL de solução de PBS contendo 2% de FBS.
       NOTA: Esta etapa consiste em transferir as células para um buffer de suspensão limpo e adequado para aplicações a jusante.
   14. Prepare quatro tubos centrífugos de 15 mL, cada um contendo 4 mL de solução Percoll a 22%. Coloque suavemente 0,5 mL aliquotas da ressuspensão sobre o gradiente de Percoll (quatro alíquotas no total) para maximizar o rendimento da célula. Centrifugar a 560 x g a 4 °C por 10 minutos.
       NOTA: Ajuste a centrífuga para "sem freio" para evitar a perturbação do gradiente de densidade induzida por vórtice, garantindo que os detritos de mielina permaneçam estáveis no sobrenadante.
   15. Aspire cuidadosamente os supernadantes. Ressuspenda os pellets em 1 mL de tampão HBSS/BSA/glicose por tubo. Suspensão de piscina em um novo tubo de 15 mL. Enxágue os tubos de Percoll com 2 mL de tampão HBSS/BSA/glicose e faça lavagens combinadoras. Centrifuge a 300 x g a 4 °C por 5 minutos).
4. Preparação e aquisição de ordenação por citometria de fluxo (Tempo: 50 min)
   1. Aspire cuidadosamente o sobrenadante. Resuspenda o pellet celular em 1 mL de HBSS/BSA/buffer de glicose.
   2. Adicione 5 μL de reagente bloqueador do receptor Fc (FcR) à suspensão celular e incube a 4 °C por 5 minutos.
   3. Adicione os seguintes anticorpos conjugados fluorescentes à suspensão celular nos volumes indicados (suficiente para tecido derivado de 3 camundongos): 5 μL de CD45-PE; 5 μL de CD41-PE; 20 μL de CD31-APC; 15 μL de CD13-FITC.
   4. Incube as células no gelo por 20 minutos no escuro.
      NOTA: Proteja da luz. Evite mexer.
   5. Adicione 6 mL de HBSS/BSA/buffer de glicose para lavar as células. Centrifuge a 300 x g a 4 °C por 5 minutos.
   6. Aspire o sobrenadante. Resuspenda o pellet celular em 1 mL de HBSS/BSA/buffer de glicose. Adicione 200 μL de solução 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (para excluir células mortas) e incube no gelo por 10 minutos. Em seguida, ajuste o volume para 2 mL com HBSS/BSA/buffer de glicose.
      NOTA: Proteja da luz.
   7. Adicione solução de BSA a 1% para os tubos de coleta de triagem (tubos cônicos de 15 mL), e enxague suavemente as superfícies internas. Aspire o excesso de solução, deixando exatamente 1 mL de solução de 1% de BSA em cada tubo para receber as células separadas. Armazene temporariamente no gelo.
   8. Filtre a suspensão da célula tingida por um penador de 40 μm imediatamente antes da separação.
   9. Estabeleça uma porta inicial baseada nos parâmetros de dispersão frontal (FSC-A) e dispersão lateral (SSC-A) para excluir detritos celulares que exibam sinais FSC-A/SSC-A baixos.
   10. A depleção das células da linhagem hematopoiética foi alcançada por meio de gating dual-negativo para CD45 e CD41, eliminando efetivamente a contaminação por leucócitos, células imunes e plaquetas.
   11. Capturar perícitos supostos por seleção CD13-positiva a partir de células da parede vascular.
   12. Avaliar a integridade da membrana por meio de sondagem fluorescente 7-AAD; exclua células apoptóticas por meio do gating 7-AAD⁻.
       NOTA: Colete perícitos de alta pureza CD31⁻/CD13⁺ através da seleção CD31-negativa. Colete os pericícitos separados diretamente em tubos contendo 1% de BSA (do Passo 2.4.7) e coloque-os no gelo. Prepare imediatamente suspensões de célula única para contagem. Depois, carregue as amostras diretamente para sequenciamento, sem etapas intermediárias de cultura.
5. Sequência e Análise de scRNA (Tming: 3-4 dias)
   1. Suspensões de célula única de pericícitos ordenados foram preparadas seguindo o protocolo do guia do usuário dos Kits de Reagentes 10x Genomics "GEM-X Universal 3' Gene Expression v4 4-plex" (CG000731^)17,18. A suspensão de células preparada para carga teve viabilidade de > 90% e foi diluída a uma concentração dentro da faixa recomendada de 300-2000 células/μL.
   2. Combine suspensão unicelular com esferas de gel codificadas por código de barras e enzimas, depois particione em Esferas de Gel em Emulsão (GEMs) via encapsulamento microfluídico^{de gotículas 19}. Realize lise celular in situ , transcrição reversa e ligação código de barras cDNA.
   3. Quebre GEMs para recuperar produtos. Amplificar o cDNA por PCR usando o seguinte protocolo: desnaturação inicial a 9 °C por 4 segundos; seguido por ciclos (13 ciclos para <500 células-alvo, 12 ciclos para 501-6000 células-alvo) consistindo em desnaturação a 9 °C por 2 s, recozimento a 9 °C por 3 s e extensão a 7 °C por 6 s por ciclo; e uma extensão final a 72 °C por 1 minuto, seguida de uma manutenção a 4 °C. Valide os produtos amplificados para tamanho do fragmento (200-300 pb) e rendimento.
      NOTA: Os produtos de amplificação podem ser armazenados a 4 °C por até 72 horas ou a -2 °C por uma semana, ou podem ser processados diretamente na próxima etapa.
   4. Para cDNA qualificado: fragmentar, realizar reparo na extremidade, ligar adaptador P7 e amplificar com espoletas índice. Selecione o tamanho dos fragmentos para construir bibliotecas de sequenciamento.
   5. Bibliotecas de sequências na plataforma Illumina NovaSeq após validação de controle de qualidade.
   6. Dados de sequenciamento desmultiplexado para extrair códigos de barras de células, identificadores moleculares únicos (UMIs) e sequências de RNA. Align lê com o genoma de referência.
   7. Quantifique as contagens de UMI, estime números válidos de células e gere uma matriz de expressão^{gene-código de barras 20}.
   8. Remova duplos usando o pacote DoubletFinder (v2.0.6) em R. Prediga com base na identificação artificial do vizinho mais próximo para garantir a qualidade dos dados.
   9. Realize análise de componentes principais (PCA) e redução de dimensionalidade por Aproximação e Projeção de Variedades Uniformes (UMAP) usando Seurat (v5.0). Identifique agrupamentos celulares e visualize genes marcadores específicos de pericitos para validar a identidade celular.

Resultados

Para alcançar o isolamento preciso dos perícitos cerebrais, células dissociadas do tecido cerebral foram coradas com PE Texas Red conjugado anti-mouse CD41/CD45, FITC conjugado anti-mouse CD13 e APC conjugado anti-mouse CD31, estabelecendo uma estratégia de classificação em múltiplas etapas integrando marcadores superficiais e detecção de viabilidade (Figura 2). O gating inicial baseado nos parâmetros de dispersão frontal (FSC-A) e dispersão lateral (SSC-A) ...

Discussão

Este estudo descreve uma estratégia FACS sistematicamente otimizada e validada baseada na rotulagem multicolorida CD13⁺/CD31⁻ para o isolamento altamente eficiente dos pericícitos vasculares cerebrais^{de camundongos 24}. Análises citométricas de fluxo e subsequentes de scRNA-seq confirmaram que o método discrimina precisamente perócitos de células endoteliais e produz células que atendem consistentemente a todos os indicadores críticos de controle de qualidade para ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibicol	A5669701	Aliquotar e armazenar a -20°C; pode ser armazenado a 4°C por até 1 semana após o descongelamento
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7,4)	Life Technologies	70011-044	Diluir antes do uso para lavagem celular
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	Para preparar buffer energético celular
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A1933-25g	Protege as células e previne a adesão
Dulbecco's  Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)	Gibco	14190-144
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1×)	Life Technologies	14175-095	Para lavagem celular e ressuspensão
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Life Technologies	10977-015	Para preparar sistemas de reação livres de nuclease
Collagenase/Dispase	Sigma-Aldrich	11097113001-100mg	Para digestão de tecido e dissociação celular; aliquotar e armazenar a -20°C
DNaseI(RNase-Free)	TIANGEN	RT411-1500U	Previne agregação de DNA; aliquotar e armazenar a -20°C
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-100ML	Para separação celular; armazenar a 4°C
FITC Rat Anti-Mouse CD13	BD Biosciences	558744	Conjugado fluorescente; armazenar protegido da luz a 4°C por até 1 mês
APC Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	551262	Armazenar protegido da luz a 4°C por vários meses
PE Rat Anti-Mouse CD41	BD Biosciences	558040	Armazenar protegido da luz a 4°C por vários meses
PE Rat Anti-Mouse CD45	BD Biosciences	553081	Armazenar protegido da luz a 4°C por vários meses
FITC Rat IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	552916	Controle de fluorescência; armazenar protegido da luz a 4°C
APC Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	553932	Armazenar protegido da luz a 4°C por vários meses
PE Rat IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	553989	Armazenar protegido da luz a 4°C por vários meses
RNase AWAY Decontamination Reagent	Ambion	10328011	Para eliminar contaminação por RNase
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Prevenir ligação de anticorpos não específicos
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	559925	Para exclusão de células mortas.
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25g	Para a preparação da Solução de Tribromoetanol 1,25% (p/v)
2-Methyl-2-butanol	Psaitong	M20008-500mL	Para a preparação da Solução de Tribromoetanol 1,25% (p/v)
C57BL/6 mouse	Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	SYXK (Su) 2020-0041
50 mL centrifuge tube	Corning	430291
15 mL centrifuge tube	Corning	430791
cell cluture dish 100mm×20mm	Corning	430167
Cell Ranger		3.1.0/4.0.0	Software de Análise de Dados de Sequenciamento de Célula Única
Loupe Cell Browser		4.1	Navegador de Células
STAR		2.5.1b	Alinhamento de RNA
irlbpy		-	Análise de Componentes Principais
tsne		0.15	Barnes-Hut t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) Analysis
k-means		0.17	K-Means Clustering
graph-based clustering		0.17	Clustering Baseado em Gráfico
FastQC		v0.11.2	Controle de Qualidade de Dados (QC)