O eixo NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 regula a polarização e inflamação dos macrófagos em modelos de sepse

Resumo

Esse protocolo integra amostras clínicas, macrófagos cultivados e um modelo de camundongos de ligadura e punção cecal (CLP) para investigar como o eixo NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 regula a polarização e inflamação dos macrófagos na sepse, fornecendo orientações passo a passo que podem ser adaptadas a outras vias imunes mediadas por lncRNA.

Resumo

A sepse é caracterizada por uma resposta imune desregulada do hospedeiro e continua sendo uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo. O longo RNA não codificante NEAT1 tem sido implicado em doenças inflamatórias, mas seu papel específico na polarização dos macrófagos durante a sepse não foi totalmente definido. Aqui, examinamos sistematicamente o eixo NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 em amostras clínicas, macrófagos cultivados e um modelo de camundongos CLP. PCR quantitativa, western bloting, ensaios com repórter de dupla luciferase e experimentos de RNA pull-down são usados para confirmar a interação competitiva de RNA endógeno (ceRNA) entre NEAT1, miR-181a-5p e HMGB1. Ensaios funcionais, incluindo imunofluorescência, migração transwell e marcação terminal por pontuação de desoxinucleotiltransferase dUTP (TUNEL), são aplicados para avaliar polarização, migração e apoptose dos macrófagos. In vivo, o modelo CLP combinado com ELISA e histopatologia valida o impacto do knockdown do NEAT1 nos perfis de citocinas e nas lesões de órgãos. NEAT1 e HMGB1 são regulados para cima, enquanto miR-181a-5p é regulado para baixo, em pacientes com sepse e em macrófagos estimulados por lipopolissacarídeos. Silenciar o NEAT1 promove a polarização dos macrófagos M2, reduz citocinas pró-inflamatórias, prejudica a migração dos macrófagos e alivia danos teciduais em camundongos sépticos via o eixo miR-181a-5p/HMGB1. Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo integrado a caracterizar o circuito regulatório lncRNA-microRNA-HMGB1 em sepse, utilizando abordagens clínicas harmonizadas, in vitro e in vivo. Ele fornece uma estrutura metodológica para direcionar redes de ceRNA relacionadas ao NEAT1 como potenciais estratégias terapêuticas.

Introdução

Sepse é definida como disfunção de órgãos potencialmente fatais causada por uma resposta desregulada do hospedeiro à^{infecção 1}. Apesar dos avanços no manejo clínico, sua mortalidade permanece alta, e os mecanismos moleculares subjacentes ao desequilíbrio imunológico não são totalmente^{compreendidos 2,3}. Entre os reguladores imunológicos, RNAs longos não codificantes (lncRNAs) emergiram como importantes moduladores da sinalização inflamatória e da função^{dos macrófagos 4,5}. NEAT1, um transverso abundante enriquecido nuclearmente, é um componente estrutural dos paraspeckles e tem sido associado a respostas imunes e de lesão^{tecidular 6,7}. Estudos anteriores associaram o NEAT1 à inflamação intestinal, lesões por isquemia/reperfusão e síndrome do desconforto respiratório^{agudo 8,9,10}.

No contexto da sepse, evidências acumuladas indicam que os lncRNAs regulam a polarização dos macrófagos e a sinalização inflamatória, influenciando assim a progressão da doença e o desfecho^11,12. Por exemplo, os lncRNAs KCNQ1OT1 e SNHG1 foram relatados como modulando a lesão miocárdica induzida por sepse por meio de vias mediadas por^{microRNAs 13,14}. No entanto, se o NEAT1 regula a polarização dos macrófagos através do eixo miR-181a-5p/HMGB1 na sepse ainda não foi definido sistematicamente. Para suprir essa lacuna, estabelecemos um protocolo que combina amostras de sangue do paciente, macrófagos RAW264.7 estimulados por lipopolissacarídeos e um modelo de camundongo com ligadura cecal e punção para interrogar os eixos NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1^15,16. Utilizando PCR quantitativa, western bloting, ensaios com repórter de dupla-luciferase, RNA pull-down e leituras funcionais da polarização, migração e apoptose dos macrófagos M1/M2, este protocolo fornece uma estrutura experimental reprodutível para definir o NEAT1 como regulador da função dos macrófagos na sepse e para apoiar o desenvolvimento de estratégias direcionadas a^{lncRNAs 17,18}.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram aprovados pelo Conselho de Ética do Hospital Afiliado da Universidade de Hebei (Aprovação nº HDFY-LL-2021-232). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes ou, quando aplicável, de seus representantes legais. Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e regulamentos nacionais, e aprovados pelo mesmo comitê de ética. O protocolo aprovado especificava detalhes do procedimento de ligadura e punção cecal (CLP), administração de adenovirais, regime anestésico e desfechos humanitários.

Coleta de amostras de pacientes

Pacientes com sepse foram recrutados prospectivamente no Hospital Afiliado da Universidade de Hebei entre fevereiro de 2022 e julho de 2024. Um total de 50 pacientes atendeu aos critérios de inclusão, incluindo 26 homens e 24 mulheres, com idades entre 24 e 69 anos (média 52,4 ± 10,2 anos). A sepse foi diagnosticada de acordo com os critérios de Sepse-3, exigindo infecção suspeita ou confirmada, além de um aumento na pontuação da Avaliação Sequencial de Falência Orgânica (SOFA) em ≥ 2 pontos. Para cada paciente, a principal fonte de infecção (como infecção pulmonar, intraabdominal, urinária ou da corrente sanguínea) e a gravidade da doença (sepse ou choque séptico) foram registradas, e a distribuição dos escores SOFA foi resumida para caracterizar a carga da doença. Como grupo controle, 39 indivíduos saudáveis sem evidência clínica de infecção ou doença inflamatória sistêmica foram incluídos (20 homens e 19 mulheres, entre 26 e 70 anos, média 50,7 ± 11,0 anos), e não houve diferenças significativas de idade ou sexo entre os grupos.

Sangue venoso periférico foi coletado de pacientes com sepse antes do início do tratamento específico para sepse sempre que possível. O sangue (tipicamente 5-10 mL) era aspirado em tubos revestidos com ácido etilendediaminetetraacético (EDTA) e suavemente invertido várias vezes para misturar o anticoagulante. As amostras foram processadas em aproximadamente 1 hora após a coleta. O plasma foi obtido por centrifugação a 1.500 × g durante 10 minutos em temperatura ambiente, aliquotado em microtubos marcados e armazenado a -80 °C para medições subsequentes de citocinas. Para extração de RNA e proteínas, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de uma porção das mesmas amostras usando um meio de separação com gradiente de densidade, conforme as instruções do fabricante. As células foram então lavadas duas vezes em PBS, contadas e armazenadas como pellets celulares a -80 °C.

Cultura celular e transfecção

Células macrófagas murinas RAW264,7 foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal inativado por calor, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂. As células eram atravessadas por um raspador celular antes de atingirem a superconfluência para preservar um fenótipo estável.

Para transfecção, células RAW264,7 foram semeadas a 5 × 10⁵ células por poço em placas de 6 poços em 2 mL de meio completo aproximadamente 24 horas antes da exposição ao reagente. Quando as culturas atingiram 70-90% de confluência, os ácidos nucleicos (como plasmídeos de expressão NEAT1 ou HMGB1, construções de curva curta, mimadores ou inibidores de miR-181a-5p e seus controles correspondentes) foram complexados com um reagente de transfecção à base de lipídios em meio sem soro, conforme as instruções do fabricante. Normalmente, 2-3 μg de DNA plasmídico ou 50-100 pmol de RNA pequeno eram misturados com o volume recomendado de reagente, deixados para formar complexos em temperatura ambiente por 10-15 minutos e, em seguida, adicionados gota a gota às células em meio livre de antibióticos. Após 4-6 horas, o meio era substituído por meio fresco e completo, e as células eram incubadas por mais 24-48 horas antes dos ensaios a jusante.

Indução da polarização dos macrófagos

Para induzir a polarização inflamatória dos macrófagos, as células RAW264.7 foram permitidas aderir em placas de 6 poços por pelo menos 4 horas em meio completo. O meio foi então substituído por DMEM contendo 100 ng/mL lipopolissacarídeo (LPS), e as células foram incubadas por 6 horas a 37 °C com 5% de CO₂. Após a estimulação, as células foram imediatamente processadas para extração de RNA e proteínas, coloração por imunofluorescência, ensaios de migração ou análise de apoptose, dependendo do desenho experimental.

Reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real (qRT-PCR)

O RNA total foi extraído de células cultivadas, PBMCs ou tecidos de camundongos usando um reagente monofásico à base de fenol-guanidinium conforme procedimentos padrão. Resumidamente, as amostras foram lisadas em 1 mL de reagente por 10⁶ células ou 50-100 mg de tecido, incubadas por 5 minutos em temperatura ambiente e depois misturadas vigorosamente com clorofórmio (0,2 mL por 1 mL de reagente). Após incubação por 2-3 minutos, os lisados foram centrifugados a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C para separar as fases. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo, e o RNA foi precipitado com volume igual de isopropanol. A mistura foi então incubada por aproximadamente 10 minutos e centrifugada novamente a 12.000 × g por 10 minutos a 4 °C. O pellet resultante foi lavado com 75% de etanol, centrifugado a 7.500 × g por 5 minutos a 4 °C, brevemente seco ao ar e dissolvido em água livre de RNase. A concentração e pureza de RNA foram avaliadas usando espectrofotometria UV, e amostras com uma relação A₂₆₀/A₂₈₀ de aproximadamente 1,8-2,0 foram usadas para análises posteriores. Quando necessário, a integridade era verificada por eletroforese em gel de agarose.

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir do RNA total usando um kit de transcrição reversa comercialmente disponível, seguindo as instruções do fabricante. Para miR-181a-5p, primers específicos para genes ou laços de haste foram empregados conforme recomendado. A PCR quantitativa em tempo real foi realizada usando um sistema de PCR em tempo real e uma mistura master adequada (como SYBR Green- ou química baseada em sonda) em um volume total de reação de 20 μL contendo molde de cDNA e 0,2-0,4 μM de cada primer. As condições típicas de ciclagem incluíram uma desnaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, seguida por 40 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s, com análise da curva de fusão quando apropriado para confirmar a especificidade do amplicão. Os níveis de expressão de NEAT1 e HMGB1 foram normalizados para GAPDH, e a expressão de miR-181a-5p foi normalizada para RNA nuclear pequeno de U6. A expressão relativa foi calculada usando o método 2-ΔΔCt e expressa como variação de dobra em comparação com grupos controle. Sequências de primer e tamanhos de amplicã foram compilados em uma planilha separada para submissão como uma Tabela Suplementar 1.

Western blot

Para o western bloting, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado e lisadas em um tampão apropriado de radioimunoprecipitação (RIPA) suplementado com inibidores de protease. Os lisados foram incubados no gelo por 15-30 minutos com mistura suave ocasional e centrifugados a 12.000 × g por 15 minutos a 4 °C para remover detritos celulares. Os supernadantes foram coletados e as concentrações de proteína foram determinadas usando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA).

Quantidades iguais de proteína (tipicamente 40 μg por pista) foram misturadas com tampão de carga, fervidas a 95 °C por 5-10 minutos para desnaturar as proteínas, e separadas em géis de dodecil sulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida com concentração adequada de acrilamida (por exemplo, 10-12% para HMGB1). Proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) usando um sistema de transferência úmido ou semi-seco sob condições recomendadas para a faixa de peso molecular de interesse. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado ou albumina sérica bovina (BSA) em soro sorológico tampão com 0,1% de Tween-20 (TBST) por 1 hora em temperatura ambiente e depois incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra HMGB1 (por exemplo, diluição 1:500) e GAPDH (por exemplo, diluição 1:1.000) diluídos em tampão bloqueante. Após três lavagens em TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte adequados por 1 hora em temperatura ambiente. Após lavagens adicionais, as bandas proteicas foram visualizadas usando um substrato de quimioluminescência aprimorado e capturadas com um sistema de imagem digital. As intensidades das bandas foram quantificadas usando software de análise de imagem, os sinais HMGB1 foram normalizados para GAPDH, e a expressão relativa foi comparada entre os grupos.

Ensaio de repórter dual-Luciferase

Fragmentos do tipo selvagem e mutantes do NEAT1 e da região 3′-não traduzida do HMGB1 (3′-UTR) contendo os sítios de ligação previsto do miR-181a-5p foram clonados em um vetor repórter de^{luciferase 19}. Todos os construtos foram verificados por sequenciamento de Sanger para confirmar os sítios de inserção e^{mutação 20}. Células RAW264,7 foram semeadas em placas de 24 poços e deixadas aderir durante a noite. As células foram então co-transfectadas com plasmídeos repórteres e inibidores de miR-181a-5p, mimics ou controles negativos correspondentes usando um reagente de transfecção à base de lipídios, conforme descrito para o procedimento geral de transfecção.

Após aproximadamente 24-48 horas de incubação, as células foram lavadas com PBS, lisadas em um tampão passivo de lise apropriado (por exemplo, 20 μL por poço) e suavemente agitadas para garantir a lise completa. A atividade da luciferase foi medida usando um kit de ensaio duplo de luciferase e um luminômetro, seguindo as instruções do fabricante. A atividade da luciferase de vaga-lume foi normalizada para a atividade de luciferase de Renilla para controlar a eficiência da transfecção, e a atividade relativa da luciferase de cada grupo foi comparada com o controle correspondente.

Ensaio de migração Transwell

A migração de macrófagos foi avaliada usando câmaras transwell pré-revestidas com um gel de matriz extracelular adequado para ensaios de invasão celular. O gel foi diluído 1:6 em meio sem soro sobre gelo, e 50 μL da solução diluída foram adicionados à superfície superior de cada inserção. A placa foi incubada a 37 °C por aproximadamente 4 horas para permitir que o gel solidificasse. Células RAW264,7 transfectadas ou tratadas foram colhidas, ressuspensas em meio sem soro a 1 × 10⁶ células/mL, e 100 μL da suspensão celular (1 × 10⁵ células) foram adicionados à câmara superior. A câmara inferior foi preenchida com 600 μL de meio completo contendo 10% de soro bovino fetal como quimioatrativo.

As células foram incubadas a 37 °C com 5% de_CO-2 por 24 horas. Ao final da incubação, as células não migratórias restantes na superfície superior da membrana foram suavemente removidas com um cotonete. Células migradas aderentes à superfície inferior da membrana foram fixadas com etanol 95% por cerca de 20 minutos em temperatura ambiente e depois coradas com solução de violeta cristalina a 0,5% por 10-15 minutos. O excesso de corante era removido lavando com PBS, e as membranas eram secas ao ar. Células migradas foram examinadas sob um microscópio óptico, e células em vários campos selecionados aleatoriamente por folheto foram contadas de forma cega para quantificar a capacidade migratória.

Ensaio de apoptose TUNEL

Para a detecção de apoptose, as células RAW264,7 foram cultivadas em protetores de vidro e submetidas aos tratamentos ou transfecções indicados. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% por 30-60 minutos em temperatura ambiente e enxaguadas com PBS. A atividade endógena da peroxidase foi bloqueada pela incubação em peróxido de hidrogênio 0,3% por 20 minutos, seguida por lavagens de PBS. Um kit de ensaio TUNEL foi utilizado, e a mistura de marcação foi aplicada para cobrir as células. As amostras foram incubadas a 37 °C por aproximadamente 60 minutos em uma câmara umidificada, e a reação foi interrompida conforme as instruções do kit. Após a incubação com estreptavidina-HRP ou um reagente de detecção equivalente por 30 minutos a 37 °C, núcleos foram visualizados com um substrato cromogênico como 3,3′-diaminobenzidina (DAB) até que núcleos apoptóticos coloridos de marrom se tornassem evidentes. As lâminas foram contra-coloridas com hematoxilina, desidratadas por etanol graduado, limpas em xileno e montadas com um meio permanente. Células apoptóticas e núcleos totais foram observados sob um microscópio óptico, e o índice apoptótico foi calculado como a porcentagem de células TUNEL-positivas.

Imunofluorescência

Para imunofluorescência, seções de tecido embutidas em parafina foram desenceradas em xileno e reidratadas por meio de uma série graduada de etanol para água. A coleta de antígeno foi realizada usando um tampão apropriado (como tampão de citrato, pH 6,0) e a recuperação do epítopo induzida por calor por micro-ondas ou panela de pressão, de acordo com as recomendações de anticorpos. Após o resfriamento e enxágue, as seções foram bloqueadas com 5% de soro normal em PBS por 1 hora a 37 °C para reduzir a ligação inespecífica. Os tecidos foram então incubados durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra marcadores de polarização de macrófagos e citocinas inflamatórias, incluindo CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, sintase induzível de óxido nítrico (iNOS), IL-4, IL-10 e Arg-1 (comumente na diluição 1:500), diluídos em tampão bloqueante.

No dia seguinte, as secções foram lavadas em PBS e incubadas com anticorpos secundários conjugados com fluoróforos apropriados por 1 hora a 37 °C no escuro. Os núcleos foram contra-coloridos com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por 5 minutos. Após as lavagens finais, as seções foram montadas com um meio de montagem anti-descolorido e examinadas sob um microscópio de fluorescência usando conjuntos de filtros adequados. As imagens foram adquiridas com configurações de exposição consistentes entre grupos, e barras de escala (por exemplo, 20 μm) e ampliações foram indicadas em todos os painéis e legendas das figuras.

Modelo de camundongo com sepse induzida por CLP

Machos C57BL/6 camundongos (24-32 g) foram aclimatados por pelo menos 1 semana antes da cirurgia e depois distribuídos aleatoriamente para os grupos Sham, CLP, CLP mais controle negativo curva curta ou CLP mais NEAT1 curva curta (n = 6 por grupo). Os camundongos foram anestesiados por inalação de éter em uma câmara fechada por aproximadamente 1 a 3 minutos até a perda do éter do reflexo de endireitamento ou de outro anestésico aprovado pela instituição, em dose e duração de exposição que induziram a perda do reflexo de endireitamento, mantendo a função respiratória adequada. Os pelos abdominais foram raspados e a pele desinfetada com uma solução antisséptica adequada. Foi realizada uma laparotomia da linha média de aproximadamente 1-2 cm para expor o ceco com seu intestino adjacente.

Para a CLP, o ceco foi suavemente exteriorizado e ligado com uma sutura estéril em aproximadamente dois terços de seu comprimento, tomando cuidado para não obstruir a válvula ileocecal ou comprometer o fluxo sanguíneo mesentérico. O ceco ligado foi perfurado duas vezes com uma agulha estéril do calibre especificado no protocolo aprovado (por exemplo, 21 G), e uma pequena quantidade de material fecal foi suavemente extrudida para garantir a permeabilidade dos locais da perfuração. O ceco foi então retornado à cavidade peritoneal, e a parede abdominal e a pele foram fechadas em camadas com suturas. Camundongos operados por simulação passaram pela mesma laparotomia e exposição ao ceco, sem ligadura ou perfuração.

Para alcançar a redução in vivo do NEAT1, um vetor adenoviral codificando shNEAT1 e um vetor controle negativo correspondente foram preparados em um título definido (por exemplo, 1 ×^{10 9} unidades formadoras de placas/mL). Um volume fixo de suspensão viral (como 100 μL por camundongo) foi administrado via veia caudal em um momento especificado em relação ao CLP (por exemplo, 1 hora após a cirurgia), conforme descrito no desenho experimental e aprovado pelo comitê de ética. Após a cirurgia, os camundongos receberam cuidados pós-operatórios padrão, incluindo ressuscitação com líquido subcutâneo se indicado, e foram monitorados quanto a sinais clínicos de sepse e sofrimento. No momento predeterminado, os animais eram eutanasiados humanamente por overdose de inalação de éter em uma câmara fechada, usando aproximadamente 5-10 mL de éter para garantir a rápida cessação da respiração, seguido pela confirmação da morte, coleta de sangue para análise de citocinas e coleta de órgãos para histopatologia, imunofluorescência e ensaios moleculares.

Análise estatística

A análise estatística era realizada usando a versão 23.0 do SPSS ou um pacote de software estatístico equivalente. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (SD), salvo indicação em contrário. Para comparações entre dois grupos, foi usado um teste t de Student não pareado quando os dados eram normalmente distribuídos com variâncias homogêneas. Para comparações entre três ou mais grupos, foi aplicada uma análise unilateral da variância (ANOVA), seguida por testes post hoc apropriados para comparações múltiplas quando um efeito geral significativo foi detectado. Um valor p bilateral < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. O significado dos símbolos estatísticos (por exemplo, p < 0,05, *p < 0,01) foi definido nas legendas das figuras, e o número de réplicas biológicas é indicado no texto ou legendas correspondentes.

Resultados

Detecção da expressão e interações de NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 em sepse

No soro de pacientes com sepse, os níveis de NEAT1 e HMGB1 foram significativamente maiores do que nos controles saudáveis, enquanto o miR-181a-5p foi significativamente reduzido. Padrões de expressão semelhantes foram observados em PBMCs e em macrófagos RAW264.7 estimulados com lipopolissacarídeo, indicando que esse eixo é consistentemente alterado em sepse e condições inflamatórias semelhantes a sepse (

Discussão

A sepse é caracterizada por uma desregulação imunológica profunda e frequentemente duradoura, na qual fases de hiperinflamação e imunossupressão coexistem e contribuem conjuntamente para falência de órgãos e desfechos^{ruins 21,22}. Evidências acumuladas indicam que RNAs longos não codificantes (lncRNAs) participam desses processos modulando a sinalização inflamatória e a polarização dos^{macrófagos 23,24<...}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vetor Adenoviral (shNEAT1)	10692-V5	Vigene Biosciences	Adenovírus usado para reduzir a expressão de NEAT1 in vivo e in vitro.
Kit de Ensaio de Proteína BCA	23227	Thermo Fisher	Kit usado para quantificar a concentração de proteínas em lisados celulares.
Kit de Ensaio de Repórter Dual-Luciferase	E1910	Promega	Kit usado para ensaios de repórteres com dupla luciferase para medir a interação miR-181a-5p.
Kits ELISA (Citocinas)	N/A	R& Sistemas D	Kits usados para medir os níveis de citocinas em amostras de soro e tecido.
Soro Bovino Fetal (FBS)	16000-044	Gibco	Suplemento usado em meio de cultivo para crescimento celular.
Anticorpo GAPDH	2118S	Tecnologia de Sinalização Celular	Anticorpo primário contra GAPDH usado como controle de carga no western blot.
Kit de Coloração de Hematoxilina e Eosina	N/A	Thermo Fisher	Kit usado para coloração histológica de seções de tecido para análise patológica.
Anticorpos de Imunofluorescência (CD206)	14693-1-AP	Proteintech	Anticorpo usado para detectar o marcador do macrófago M2 CD206 em seções de tecido.
Lipopolissacarídeo (LPS)	L2630	Sigma-Aldrich	LPS usado para induzir polarização inflamatória de macrófagos em células RAW264.7.
miR-181a-5p Mimic	N/A	N/A	Mimetismo sintético do miR-181a-5p usado para modular os níveis do miR-181a-5p.
Plasmídeo de Expressão NEAT1	N/A	N/A	Plasmídeo usado para superexpressão de NEAT1 em macrófagos RAW264.7.
Células de Macrófagos RAW264.7	TIB-71	ATCC	Linha celular de macrófagos murinos usada em experimentos in vitro.
Buffer de Lise RIPA	89901	Thermo Fisher	Tampão usado para lisar células para extrair proteína total.
RPMI-1640 Médio	11875-093	Gibco	Meio de cultivo para macrófagos RAW264.7.
SYBR Green Master Mix	4385612	Thermo Fisher	Reagente usado para análise quantitativa de PCR em tempo real.
Câmaras de Ensaio de Migração Transwell	3422	Corning	Câmaras usadas para ensaios de migração transwell para avaliar a migração de macrófagos.
Kit de Ensaio de Apoptose TUNEL	AB66110	Abcam	Kit usado para detectar apoptose em células RAW264.7 por coloração TUNEL.
Anticorpos Western Blot (HMGB1)	ab18256	Abcam	Anticorpo primário contra HMGB1 usado em western bloting.