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Artigo de investigação

Os Efeitos Causais dos Metabólitos Plasmáticos na Lesão do Tendão de Aquiles: Um Estudo de Randomização Mendeliana

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DOI:

10.3791/69807

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27 de março de 2026

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1Department of Orthopaedic Centre Hand-Foot Surgery, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University, 2Ningxia Yinchuan Energy College, Nursing College, 3General Surgery Department, People's Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Ningxia Medical University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo combinado de randomização mendeliana e validação experimental para identificar metabólitos causais na lesão do tendão de Aquiles, identificando 19 metabólitos plasmáticos com ligações causais com lesão do tendão de Aquiles e demonstrando a aplicação terapêutica de 5,6-dihidrotimina e hidroxiasparagina na promoção da reparação tecidual e na redução da inflamação.

Resumo

Para investigar os efeitos causais dos metabólitos plasmáticos na progressão e recuperação da lesão do tendão de Aquiles (ATI), foi aplicada randomização mendeliana (RM) usando uma abordagem de duas amostras com dados genéticos de dois grandes conjuntos de dados. Os dados ATI foram obtidos do projeto IEU-OpenGWAS (ebi-a-GCST90018895), enquanto os dados de metabólitos plasmáticos incluíram 1.400 metabólitos. Variáveis instrumentais (IVs) significativas para metabólitos foram identificadas, e cinco métodos de ressonância magnética — IVW, RM-Egger, mediana ponderada, modo simples e modo ponderado — foram aplicados para avaliar as relações causais. A análise reversa por ressonância magnética foi realizada para explorar o impacto da ATI nos níveis de metabólitos. A reparação tecidual e a expressão de IL-6, TNF-α, VEGFA e TGF-β1 no tecido tendinoso de Aquiles do camundongo foram avaliadas no sétimo dia pós-tratamento com 5,6-dihidrotimina (Dih) e hidroxiasparagina (Hyd) usando coloração H&E e Western blot. A análise por RM identificou 19 metabólitos com associações causais significativas à ITA. Destes, 12 metabólitos, incluindo Dih (IVW: OR = 1,197, IC 95%: 1,074-1,334; P = 0,001) e Pregnanediol-3-glucuronito (IVW: OR = 1,098, IC 95%: 1,023-1,177; P = 0,001), estavam positivamente associados à progressão da ATI. Em contraste, 7 metabólitos, como Hyd (IVW: OR = 0,789, IC 95%: 0,707-0,880; P < 0,001), estavam ligados à recuperação da ATI. A análise reversa por RM não indicou efeitos causais significativos da ITA nos níveis de metabólitos, sugerindo uma relação unidirecional. Raios-X e análises H&E revelaram que o tratamento com Dih e Hyd melhorou significativamente a cicatrização do tendão de Aquiles de forma dependente da dose. Além disso, o tratamento com Dih e Hyd reduziu notavelmente a expressão de IL-6 e TNF-α (P < 0,05), além de aumentar os níveis de VEGFA e TGF-β (P < 0,05), indicando redução da inflamação e promoção da reparação tecidulares. Este estudo identificou possíveis relações causais entre metabólitos plasmáticos específicos e desfechos da ATI. Esses achados podem orientar futuras estratégias terapêuticas e destacar a utilidade da RM na exploração das associações metabólito-doença.

Introdução

A lesão do tendão de Aquiles (ATI) é uma condição musculoesquelética prevalente e debilitante, especialmente entre atletas e indivíduos fisicamenteativos 1,2. O tendão de Aquiles, o maior e mais forte do corpo humano, desempenha um papel fundamental na locomoção, transmitindo forças dos músculos da panturrilha para o calcanhar durante atividades como caminhar, correr epular 3,4,5,6. Seu suprimento sanguíneo limitado e o alto estresse mecânico que suporta o tornam especialmente vulnerável ao uso excessivo e alesões 2,7. A ITA se manifesta de várias formas, que vão desde tendinopatia leve até ruptura completa, causando dor significativa, mobilidade reduzida e reabilitaçãoprolongada 8,9. Apesar dos avanços no tratamento, a ITA frequentemente resulta em dor persistente, mobilidade reduzida e tempos de recuperação prolongados, com aumento do risco de complicações crônicas ere-lesão 5,10,11,12.

Estudos recentes destacaram o papel crítico dos metabólitos plasmáticos no processo de cicatrização do ATI13,14. Acredita-se que esses metabólitos, envolvidos em várias vias bioquímicas, influenciem fatores-chave como inflamação, reparação de tecidos e saúde dostendões 15. Por exemplo, aminoácidos e lipídios específicos são essenciais para a síntese de colágeno e para o manejo do estresse oxidativo, ambos cruciais na patologia dostendões 16,17. O plasma rico em plaquetas (PRP), rico em fatores de crescimento como PDGF, TGF-β, VEGF e IGF, demonstrou potencial para promover a cicatrização dos tendões, embora sua eficácia no tratamento da tendinopatia crônica de Aquiles ainda sejadebatida. Nos últimos anos, tecnologias de alta produtividade em ômicas, como metabolômica e proteômica, proporcionaram oportunidades sem precedentes para explorar o cenário molecular de condições complexas como ATI18,19. Tecnologias metabolômicas avançadas facilitaram a identificação de biomarcadores ligados aos desfechos da ATI, fornecendo insights sobre como metabólitos específicos influenciam a progressão e a recuperação da lesão.

O perfil de metabólitos e a análise das vias metabólicas tornaram-se abordagens poderosas para identificar biomarcadores e vias associadas à lesão20,21. A randomização mendeliana (RM) é um método robusto de inferência causal que utiliza variantes genéticas como variáveis instrumentais (IVs) para abordar vieses de confusão comuns em estudos epidemiológicos tradicionais 22,23,24,25,26,27. A RM é particularmente útil para estudar relações causais entre exposições, como metabólitos plasmáticos, e desfechos como ATI. Ao contrário dos estudos observacionais convencionais, que são suscetíveis a confusão e causalidade reversa, a RM utiliza variantes genéticas como IVs para fornecer inferências causais mais fortes. Uma compreensão mais profunda de como os metabólitos plasmáticos influenciam a saúde dos tendões é essencial para avançar estratégias terapêuticas e melhorar os resultados da recuperação.

Com base nesses avanços, o presente estudo investiga o papel causal dos metabólitos plasmáticos na ITA utilizando a RM. Variações genéticas associadas aos níveis de metabólitos foram analisadas para identificar metabólitos específicos ligados à progressão e recuperação da ITA. Além disso, metabólitos candidatos, como 5,6-dihidrotimina (Dih) e hidroxiasparagina (Hyd), foram validados experimentalmente em modelos animais para elucidar seus efeitos no curso e na cicatrização da ATI.

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Protocolo

Ética aprovação e consentimento para participar

Todos os desenhos experimentais em animais foram rigorosamente conduzidos de acordo com as Medidas de Manejo de Animais de Laboratório da Província de Ningxia e aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Popular da Região Autônoma Hui de Ningxia, Universidade Médica de Ningxia.

Desenho do Estudo

Este estudo investigou as relações causais entre 1.400 metabólitos plasmáticos e ATI empregando uma metodologia de ressonância magnética com duas amostras. Para garantir a validade dos IVs na inferência causal, três pressupostos críticos devem ser satisfeitos: (1) a variação genética está diretamente associada à exposição de interesse; (2) a variação genética não é confundida por possíveis fatores de confusão entre a exposição e o resultado; e (3) a variação genética influencia o resultado exclusivamente por meio da exposição e não por vias alternativas.

Fontes de dados GWAS para ATI

Os dados do Estudo de Associação Genoma Ampla (GWAS) sobre ATI foram obtidos do projeto IEU-OpenGWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/), utilizando especificamente o conjunto de dados ebi-a-GCST90018895. A análise GWAS abrangeu 357.658 indivíduos de ascendência europeia, compreendendo 7.746 casos e 349.912 controles. Após procedimentos de controle de qualidade, um total de 19.072.056 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram identificados. Os procedimentos de controle de qualidade incluíram a remoção de SNPs com frequência alelada menor<0,01, equilíbrio Hardy-Weinberg P<1×10-⁶ e taxa de chamada genótipa <0,95. A estratificação populacional foi avaliada usando análise de componentes principais, e o fator de inflação genômica (λ) foi calculado para avaliar o viés sistemático.

Fontes de dados GWAS para metabólitos plasmáticos

O conjunto de dados Fatores de Exposição inclui dados GWAS para 1.400 metabólitos plasáticos, consistindo em 1.091 níveis de metabólitos e 309 razões de metabólitos, conforme catalogado no banco de dados GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020). As análises de ressonância magnética foram restritas a indivíduos de ascendência europeia. Informações detalhadas sobre o conjunto de dados são fornecidas em Materiais Suplementares, Tabela S1.

Seleção de IVs

Na identificação dos IVs, o limiar para significância estatística dos SNPs associados a metabólitos plasmáticos foi estabelecido em P < 1 × 10-5. Para garantir a independência das análises, os SNPs foram agregados usando limiares de r2 = 0,001 e kilobase (kb) = 10.000, excluindo 19.037.213 SNPs com r2 > 0,001 e kb < 10.000 para eliminar potenciais efeitos do Desequilíbrio de Ligação (LD). SNPs com valores F-statistic < 10 foram excluídos de análises posteriores devido à sua alta heterogeneidade, enquanto 34.843 SNPs atendendo aos critérios foram mantidos como IVs válidos.

Animais e desenho experimental

Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as Medidas de Manejo de Animais de Laboratório da Província de Ningxia e aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Popular da Região Autônoma Hui de Ningxia, Universidade Médica de Ningxia. Camundongos machos BALB/c (8 semanas, grau SPF) foram adquiridos da Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pequim, China). Os camundongos foram aclimatados por uma semana em um ambiente controlado (temperatura 23 ± 1°C, umidade 60 ± 10%), com acesso livre a alimentos e água padrão, e um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão. Após a aclimatação, foi estabelecido um modelo de lesão do tendão murino. Após uma incisão longitudinal na pele, o tendão de Aquiles esquerdo foi exposto e uma transseção transversal padronizada de espessura total foi realizada no ponto médio do tendão usando tesoura microcirúrgica. O tendão foi imediatamente reparado com suturas 6-0 não absorvíveis sob um estereoscópio. Imediatamente após a cirurgia, foram realizadas imagens de raio-X para verificar o estabelecimento bem-sucedido do modelo murino ATI. Simultaneamente, imagens de raio-X foram adquiridas para o grupo controle sob condições anestésicas idênticas para servir como controleem branco 28. Todos os procedimentos foram realizados sob anestesia geral induzida por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg·kg-1), e analgesia pós-operatória foi administrada com buprenorfina (0,05 mg·kg-1, subcutânea) a cada 12 horas durante 48h 29. Após a indução bem-sucedida do modelo, os camundongos foram aleatoriamente designados para os seguintes grupos: grupos-controle, modelo e de tratamento recebendo Dih em doses baixas (10 mg·kg-1, LD-Hyd), médias (30 mg·kg-1, MD-Hyd) e altas (50 mg·kg-1, HD-Hyd). Cálculo do tamanho da amostra: Com base em dados preliminares que mostraram uma melhora de 40% nas pontuações de cicatrização com tratamento com metabólitos (DS = 15%), determinou-se que n = 6 camundongos por grupo forneceriam 80% de potência para detectar essa diferença em α = 0,05 (duas caudas). A randomização foi realizada usando números aleatórios gerados por computador por um pesquisador cego para a alocação de grupos. Procedimentos experimentais e avaliações de resultados foram conduzidos por pesquisadores cegos para as tarefas emgrupo 30.

Coloração por Hematoxilina e Eosina (HE)

No sétimo dia pós-tratamento, os camundongos foram eutanasiados sob anestesia profunda induzida por injeção intraperitoneal de sódio pentobarbital (100 mg·kg-1), garantindo a perda completa dos reflexos antes da coleta de tecido, conforme corresponde. O tecido do tendão de Aquiles lesionado, incluindo uma pequena porção do tecido mole ao redor, foi cuidadosamente colhido e processado. Um pedaçode pele 2 de 15 mm centrado no tendão de Aquiles foi excisado. As amostras de pele foram fixadas em solução de paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 48 horas, seguidas por desidratação, embedding de parafina e seccionamento de 5 μm. As características estruturais da pele da ferida, a formação do tecido de granulação e a infiltração de células inflamatórias foram avaliadas usando coloração H&E. Para avaliação histológica, as seções foram desparafinizadas em xileno (2 × 10 min), reidratadas por etanol graduado (100%, 95%, 85% e 75%, 5 min cada) e enxaguadas em água destilada. As lâminas foram tingidas com hematoxilina Harris por 5 minutos, enxaguadas em água da torneira corrente por 5 minutos, diferenciadas em álcool ácido a 1% por 10 segundos e azuladas em água amoníaca a 0,2% por 30 segundos. Após a lavagem, as seções foram contra-tingidas com 0,5% de eosina por 2 minutos, seguidas de desidratação, limpeza e montagem. Confiabilidade da avaliação histológica: Para garantir a precisão da medição, 20% das amostras selecionadas aleatoriamente foram avaliadas independentemente por dois observadores cegos. A confiabilidade entre avaliadores foi avaliada usando o coeficiente de correlação intraclasse (ICC). A ICC para organização do colágeno foi 0,89 (IC 95%: 0,81-0,94), para degeneração tecidular 0,92 (IC 95%: 0,86-0,96) e para infiltração inflamatória celular 0,87 (IC 95%: 0,78-0,93), indicando excelente confiabilidade. A confiabilidade intraavaliadora foi avaliada ao fazer com que um observador reavaliasse 15% das amostras após um intervalo de duas semanas, obtendo valores ICC > 0,85 para todos os parâmetros31.

Análise do Western blot

A expressão proteica foi analisada por Western blot. A quantificação da proteína foi realizada usando o kit de ensaio de concentração de proteínas BCA. Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de 10% de sulfato de dodecil de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada por 1 hora com leite desnatado 5% em soro tampão Tris, contendo 0,1% Tween-20 em temperatura ambiente. As membranas foram incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos primários para VEGFA (1:1000, ab46154), TGF-β1 (1:1000, 21898-1-AP), IL-6 (1:1000, 26404-1-AP) e TNF-α (1:1000, 17590-1-AP). Após três lavagens com PBS, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários (1:5000) por 90 minutos em temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas usando o kit de substrato quimioluminescência ECL (veja a Tabela de Materiais para detalhes) seguindo o protocolo do fabricante e analisadas usando o software ImageJ (versão 1.8; Institutos Nacionais de Saúde). O GAPDH (10494-1-AP) era usado como controle de carga.

Análise estatística

Análises estatísticas foram realizadas usando o software R Studio. Os pacotes TwoSampleMR e ieugwasr R foram empregados para extrair dados de exposição e selecionar IVs válidos, incluindo agrupamento (r² < 0,001, tamanho da janela = 10.000 kb), harmonização de alelos e cálculo do F-statistic (F = β²_exposure/SE²_exposure). Para análises de ressonância magnética e ressonância magnética reversa, utilizamos os pacotes VariantAnnotation, gwasglue e TwoSampleMR, que facilitaram testes robustos de inferência causal e sensibilidade. Foi realizado um estudo de ressonância magnética com duas amostras para investigar características relacionadas a metabólitos plasmáticos. Cinco abordagens analíticas distintas foram empregadas: Ponderação por Inversa da Variância (IVW), MR-Egger, Mediana Ponderada (WM), Modo Simples e Modo Ponderado. Os resultados primários foram determinados usando o método de VIN, com significância estatística definida em P < 0,01. O método IVW atribui pesos para minimizar o impacto da variação, fornecendo estimativas de efeito mais precisas. A regressão de MR-Egger foi usada para avaliar a pleiotropia (o fenômeno em que os genes afetam múltiplos traços), com a pleiotropia horizontal avaliada pelo valor P do intercepto (P > 0,05) e a heterogeneidade testada usando o método de IVW combinado com a estatística Q de MR-Egger. Não foi observada heterogeneidade significativa quando P > 0,05. A correção por múltiplos testes foi aplicada usando o método da taxa de falsa descoberta (FDR) de Benjamini-Hochberg, sendo FDR < 0,05 considerada significativa. A heterogeneidade foi quantificada usando a estatística Q de Cochran e a estatística I2 , onde I2 > 50% indicaram heterogeneidade substancial. Para os valores de I2 , intervalos de confiança de 95% foram calculados seguindo o método descrito por Ioannidis et al. Análises de sensibilidade foram realizadas removendo sequencialmente cada SNP para avaliar a influência de variantes individuais nos resultados gerais.

Para avaliar a confiabilidade da medição, análises teste-reteste foram realizadas em medidas-chave de resultado (quantificação em WB e pontuação histológica) usando os coeficientes de correlação intraclasse (ICCs). O ICC foi utilizado para avaliar a confiabilidade interavaliador e intraavaliador da quantificação e pontuação histológica do Western Blot (WB). Os critérios foram interpretados da seguinte forma: abaixo de 0,50 (ruim), entre 0,50 e 0,75 (moderado), entre 0,75 e 0,90 (bom) e acima de 0,90 (excelente)32. Três pesquisadores independentes avaliaram cegamente o mesmo conjunto de amostras em dois momentos separados por uma semana. Os ICCs para quantificação Western blot de IL-6, TNF-α, VEGFA e TGF-β variaram de 0,87 a 0,93, indicando excelente confiabilidade. As ICCs para pontuação histológica foram 0,85 para organização do colágeno e 0,82 para avaliação de neovascularização.

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Resultados

Relação causal entre 1.400 metabólitos plasmaticos e ATIs

Foi realizada uma análise abrangente de ressonância magnética de 1.400 metabólitos plasmáticos para avaliar seus efeitos causais sobre a IAC. A análise primária utilizou a abordagem de TIF, com controles rigorosos para LD e potenciais fatores de confusão, para identificar metabólitos que impactam significativamente a progressão e recuperação da ITA. A Figura 1 mostra as associações causais ...

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Discussão

Este estudo realizou uma análise abrangente de ressonância magnética para explorar as relações causais entre 1.400 metabólitos plasmáticos e a ATI. Dezenove metabólitos plasmáticos foram identificados como significativamente associados à progressão e cicatrização da ITA, com Dih e Hyd emergindo como fatores-chave que influenciam os desfechos da ITA. Experimentos in vivo subsequentes confirmaram os papéis benéficos desses metabólitos na promoção da cicatrização dos tendões. O tra...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Pesquisa de Aplicação Clínica em Avaliação da Flora Intestinal e Tratamento Baseado em Etapas de Úlceras Crônicas em Pé Diabético, Projeto de Inovação em Ciência e Tecnologia de Yinchuan (2024SF005). Pesquisa de Aplicação sobre os Efeitos de Diferentes Métodos Cirúrgicos no Suprimento de Sangue do Tecido Peritendal e no Reparo Biomecânico da Ruptura Aguda do Tendão de Aquiles Fechado sob o Programa de Pesquisa e Desenvolvimento Ningxia Key (2019BEG3036).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5,6-DihidrotiminaReagente696-04-8Reagente
Kit de Ensaio de Proteína BCAReagenteP0012Reagente
Kit de Substrato de Quimioluminescência ECLReagenteP0018SReagente
Anticorpo GAPDHAnticorpo10494-1-APAnticorpo
Kit de Coloração de Hematoxilina e EosinaReagenteG1120Reagente
HidroxiasparaginaReagenteH1126Reagente
Anticorpo IL-6Anticorpo26404-1-APAnticorpo
ImageJSoftwareVersão 1.8Software
Membrana de NitroceluloseConsumíveisHATF08130Consumíveis
ParaformaldeídoReagenteP0099-3LReagente
RStudioSoftwareVersão 4.5.2Software
Kit de Preparação de Gel SDS-PAGEReagenteP0012ACReagente
Pentobarbital de sódioAnestésico200-323-9Anestésico
TGF-β 1 AnticorpoAnticorpo21898-1-APAnticorpo
TNF-&alfa; AnticorpoAnticorpo17590-1-APAnticorpo
Anticorpo VEGFAAnticorpoab46154Anticorpo
Sistema de raios XInstrumentoMX-20Instrumento

Referências

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