Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Esse protocolo permite a integração do sequenciamento de próxima geração e da imunofluorescência multicolorida para perfilar adenocarcinoma pulmonar. O objetivo é analisar a relação entre heterogeneidade genômica e densidade imune infiltrante em tumores. Essa abordagem multidimensional facilita uma avaliação abrangente do microambiente tumoral para avaliação prognóstica pós-operatória.
O prognóstico do adenocarcinoma pulmonar (LUAD) é tradicionalmente avaliado por meio do estadiamento tumor-gânglio-metástase (TNM), que não leva em conta o estado imunológico do paciente. Esse protocolo integra perfilamento genômico e análise do microambiente imune para facilitar uma avaliação prognóstica pós-operatória mais abrangente. O método envolve uma análise retrospectiva de tecidos tumorais embutidos em parafina utilizando duas técnicas principais. Primeiro, o sequenciamento de próxima geração (NGS) é realizado com um painel personalizado de 37 genes para identificar mutações nos genes condutores e variantes de significado incerto. Segundo, a imunofluorescência multiplex (mIF) é utilizada para direcionar marcadores como HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 e PanCK. Isso permite quantificar a distribuição espacial e a densidade para subpopulações específicas de células imunes em várias regiões tumorais. Essa abordagem integrada permite a avaliação simultânea da heterogeneidade genômica e das características das células imunes infiltradoras de tumores. Os dados resultantes identificam combinações específicas de perfis mutacionais — como o status EGFR — e densidades celulares imunes. Essas combinações integradas possibilitam o estudo de seu impacto coletivo na sobrevivência do paciente, oferecendo uma abordagem promissora para o desenvolvimento de futuros modelos prognósticos do câncer de pulmão. Este protocolo demonstra um método robusto para caracterizar as complexas características biológicas do microambiente tumoral LUAD.
O LUAD é o subtipo mais prevalente de câncer de pulmão, mas a taxa média de sobrevivência em 5 anos permanece baixa, em aproximadamente 15%. A avaliação prognóstica atual baseia-se principalmente no sistema de estadiamento TNM; No entanto, esse método frequentemente ignora o estado imunológico geral do paciente, o que pode limitar sua precisão preditiva. Evidências sugerem que tanto a heterogeneidade genômica quanto o microambiente tumoral (EMT) desempenham papéis críticos na tumorigênese e progressão da doençado LUAD 2,3.
Nos últimos anos, a transição do sequenciamento tradicional de Sanger para o NGS direcionado possibilitou a análise simultânea e de alta sensibilidade de múltiplos genes drivers, como EGFR, TP53 e KRAS 4,5. Embora a NGS forneça um mapa de alta resolução das alterações genéticas, os dados genômicos sozinhos não conseguem capturar as complexas interações celulares e a organização espacial dentro da TME.
Para lidar com essas complexidades, o MFI oferece vantagens significativas em relação aos métodos tradicionais de perfilamento imunológico. Enquanto a imunohistoquímica de plexo único (IHC) é restrita a um marcador por seção, o mIF permite a detecção simultânea de múltiplos marcadores proteicos enquanto preserva a arquitetura espacial do tecido. Diferentemente do IHC sequencial, que pode causar degradação tecidual, ou da citometria de fluxo e sequenciamento de RNA a grande escala, que resultam na perda de localização espacial e resolução de célulaúnica 6,7,8, o mIF combinado com anotação por região espacial permite a caracterização in situ e multiparâmetro do cenário imune 9.
Esse protocolo estabelece um fluxo de trabalho combinado que integra NGS direcionada, mFI e avaliação da região espacial (abrangendo todo o tecido, limite tumoral e núcleo tumoral). Essa abordagem multidimensional é necessária para investigar a interação entre alterações genômicas e densidade celular imune — uma relação que abordagens monomodales frequentemente não conseguem capturar. Ao avaliar essas características integradas, este protocolo fornece uma estratégia complementar para caracterizar as características biológicas do LUAD e oferece um arcabouço mais robusto para a estratificação prognóstica pós-operatória.
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Este estudo retrospectivo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Kunming Yan'an (Aprovação nº 2021-140-01). O consentimento informado foi obtido de todos os participantes.
Desenho do estudo e coleta de amostras
Uma coorte de 63 pacientes com LUAD confirmada patologicamente ou histologicamente que passaram por resseção cirúrgica entre 2015 e 2021 foi inscrita. Os critérios de exclusão incluíam o recebimento de quimioterapia neoadjuvante, radioterapia ou imunoterapia antes da cirurgia. Além disso, pacientes com malignidades concomitantes, comorbidades graves, baixa qualidade dos tecidos ou prontuários clínicos incompletos foram excluídos da análise. Blocos tumorais fixados em formalina e parafina embutida (FFPE) foram processados em seções de 1 mm para desparafinização. Como ilustrado no fluxo de trabalho (Figura 1), essas amostras passaram por uma análise integrada usando mIF e NGS direcionado. Essa abordagem combinada permite a avaliação simultânea das alterações genômicas e das características do microambiente imunológico, fornecendo uma estrutura multidimensional para caracterizar a biologia tumoral.
Acompanhamento
Os medicamentos direcionados, a imunoterapia e a progressão ou morte da doença foram acompanhados por telefone, e informações detalhadas foram obtidas sobre o estado de sobrevivência dos pacientes, progressão ou recidiva da doença, tratamentos adjuvantes recebidos após a cirurgia e quaisquer comorbidades recém-diagnosticadas. O tempo de acompanhamento terminou em julho de 2023, e o desfecho final da observação foi a progressão da doença ou a morte. A sobrevivência geral foi definida como o tempo desde o início da cirurgia até a morte do paciente. Não houve pacientes perdidos para acompanhamento. O tempo mínimo de acompanhamento foi de 21 meses.
Preparação e sequenciamento da biblioteca NGS
Extração de DNA de seções de tecido FFPE
Obtenha seções de tecido FFPE (3–10 μm de espessura) de amostras patológicas. Coloque seções em tubos estéreis de microcentrífuga. Adicione xileno a cada tubo e incube por 5–10 minutos em temperatura ambiente para remover a parafina. Centrifuge a 12.000 x g por 5 minutos e descarte cuidadosamente o sobrenadante. Repita o tratamento com xileno 1x para garantir a desparafinização completa. Lave o pellet sequencialmente com etanol 100% duas vezes para remover xileno residual. Seque o pellet ao ar em temperatura ambiente até que o etanol residual tenha evaporado completamente. Adicione o tampão de lise e a proteinase K apropriados (fornecidos no kit de extração de DNA) e incube a 56 °C por 1–3 horas (ou durante a noite, se necessário) até que o tecido esteja totalmente lisado. Realize uma incubação adicional a 90 °C por 1 hora para reverter a reticulação de formol. Extraia o DNA genômico usando um kit comercial de extração de DNA FFPE (veja a Tabela de Materiais) conforme as instruções do fabricante. A qualidade do DNA das amostras de FFPE é frequentemente fragmentada; portanto, a qualidade do DNA deve atender a limiares mínimos de integridade (por exemplo, DIN ≥ 5) para garantir a preparação bem-sucedida da biblioteca para NGS direcionados.
Quantificação e normalização do DNA
Quantifique o DNA usando um método fluorométrico para garantir medição precisa da concentração. Normalize as amostras de DNA para uma concentração final de aproximadamente 5–10 ng/μL usando tampão Tris-HCl (pH 8,5). Realize etapas de diluição gradualmente, se necessário, para garantir precisão e estabilidade da concentração de DNA.
Preparação de bibliotecas e enriquecimento de alvos
Prepare bibliotecas de sequenciamento usando NGS direcionados baseados em captura híbrida no DNA extraído do tecidoFFPE 10. Realize o enriquecimento do alvo usando um painel de sonda personalizado que cobre regiões exônicas de genes selecionados associados ao desenvolvimento tumoral. Avalie a qualidade da biblioteca e a distribuição do tamanho dos fragmentos usando métodos padrão (por exemplo, sistemas baseados em eletroforese), se necessário.
Pooling de bibliotecas e sequenciamento
Quantifique cada biblioteca usando um ensaio fluorométrico. Agrupar bibliotecas em concentrações equimolares de acordo com os requisitos do kit de sequenciamento. Carregue bibliotecas agrupadas na plataforma de sequenciamento Illumina e realize o sequenciamento com um padrão de sequenciamento par de extremidade de 150 bp.
Processamento de dados e detecção de variantes
As leituras de sequenciamento bruto foram processadas usando pipelines padrão de bioinformática, incluindo corte de adaptadores, filtragem de qualidade e alinhamento ao genoma de referência humano (GRCh37/hg19). As métricas de controle de qualidade foram as seguintes: Q20 > 85%, profundidade média de sequenciamento > 2500x, taxa de alvo > 65% e penalidade base Fold 80 ≤ 2. Controle de qualidade e alinhamento: Os dados brutos do FASTQ passaram por controle de qualidade usando FastQC e Trim Galore (ou Trimmomatic) para remover contaminação por adaptadores e sequências de baixa qualidade. As leituras limpas foram alinhadas ao genoma de referência humano GRCh37 (hg19) usando o Alinhador Burrows-Wheeler (BWA). Processamento pós-alinhamento: A ordenação, a marcação duplicada e a recalibração da pontuação de qualidade base (BQSR) foram realizadas usando Picard e o Genome Analysis Toolkit (GATK) para minimizar chamadas falso-positivas. Chamadas variantes: Polimorfismos de nucleotídeo único da linha germinativa (SNPs) e InDels foram detectados usando o BWA MEM (0.7.16a - r1181). SNVs somáticos e InDels foram identificados por meio de uma abordagem consensual usando Mutect2 e VarScan2. Mutações de baixa frequência foram avaliadas adicionalmente usando o modelo estatístico Freebayes (v 1.3.2). Anotação e filtragem: Variantes foram anotadas usando ANNOVAR, integrando dados do gnomAD, ClinVar e COSMIC. Variantes germinativas foram diferenciadas das mutações somáticas ao filtrar SNPs populacionais de alta frequência e avaliar frequências aleladas variantes (VAF). Limiares de VAF: Um corte de VAF de ≥5% foi usado para eventos clonais (por exemplo, ROS1 e ALK), enquanto um limiar de 1% foi aplicado a mutações genéticas (por exemplo, EGFR) para garantir a detecção de alterações de baixa frequência, possibilitada pela alta profundidade média de sequenciamento de >500x. Mutações germinativas foram distinguidas das mutações somáticas usando os dados do Projeto 1000 Genomas (1000G) e um banco de dados local de base de indivíduos Han chineses saudáveis estabelecido em nosso laboratório. A avaliação da patogenicidade das variantes somáticas detectadas foi realizada de acordo com o framework AMP/ASCO/CAP 11, que refina a classificação das evidências para variantes somáticas por meio de uma abordagem em níveis e baseada em evidências. Variantes patogênicas/provavelmente patogênicas (P/LP) são mantidas, com sua classificação fundamentada em critérios de Nível I/II que exigem evidências A/B (aprovação FDA, ensaios clínicos) ou C/D (pré-clínicos/estudos de caso) para classificação. O Nível III (VUS) carece de evidências conclusivas, enquanto o Nível IV indica variantes benignas por frequência populacional (por exemplo, gnomAD) ou estudos funcionais; Essas mutações são excluídas das análises subsequentes. A avaliação da patogenicidade das variantes germinativas detectadas foi realizada de acordo com as diretrizes ACMG/AMP 12. Variantes de patogênico (P), provavelmente patogênico (PL) e significado incerto (VUS) foram registradas neste estudo. Apenas variantes de alta confiança que passam pelos critérios de controle de qualidade foram incluídas nas análises a jusante (QUAL ≥1; profundidade de cobertura >10 para mutação germinativa e profundidade de cobertura >500x para mutação somática)
Preparação da amostra a partir de tecido FFPE
Preparação de seções de parafina
Corte blocos de tecido FFPE em seções de 3 μm de espessura usando um micrótomo. Flutue as seções em um banho-maria a 40–45 °C para achatar o tecido. Monte seções em lâminas adesivas de microscópio e seque em temperatura ambiente. Coloque as lâminas em um forno de secagem a 65 °C por 1 hora para garantir a aderência firme das seções de tecido às lâminas e para derreter o excesso de parafina.
Desparafinização e reidratação
Coloque os slides em um suporte de tingimento e mergulhe em uma solução de limpeza I por 5 minutos. Transferir slides sequencialmente para a solução de limpeza II e a solução III, 5 min cada, para dissolver completamente a parafina. Transfira as lâminas para etanol 100% por 3 minutos para remover o reagente residual de limpeza. Reidrate as seções do tecido através de uma série graduada de etanol: 95% de etanol por 3 minutos e 80% de etanol por 3 minutos. Enxágue 2x em água destilada, deixando 3 minutos entre as lavagens. Xileno e etanol usados durante a deparafinização foram manuseados em uma exaustão química devido à sua volatilidade e toxicidade. Todas as soluções de resíduos contendo solventes orgânicos foram coletadas separadamente e descartadas de acordo com as diretrizes institucionais de descarte de resíduos perigosos.
Partição de coloração HE
Coloração por hematoxilina e eosina
Imerga as lâminas após a deparafinização e reidratação em solução de hematoxilina por 5–10 minutos em temperatura ambiente. Enxágue os slides sob água da torneira corrente por 5 minutos. Diferencie as lâminas em álcool ácido clorídrico a 1% por alguns segundos (3–10 s). Enxágue imediatamente com água da torneira corrente. Núcleos azuis ao imergir os lâminas em água da torneira ou solução azulada por 5 minutos. Imerga as lâminas em solução de eosina por 1–3 minutos em temperatura ambiente. Enxágue brevemente em água destilada, se necessário.
Desidratação e limpeza
Desidratação passa pelo etanol classificado: etanol 80% por 1 minuto; 95% etanol por 1 minuto, e 100% etanol 2 vezes por 1 minuto. Deslizes transparentes em xileno I–II, de 2 a 5 min cada.
Montagem
Aplique uma gota de bálsamo neutro. Coloque cuidadosamente uma manta de proteção para evitar bolhas de ar. Deixe as lâminas secarem em temperatura ambiente antes da imagem.
Coloração imunofluorescente multiplex de Seções de Tecido FFPE
A coloração múltipla sequencial por imunofluorescência foi realizada para detectar múltiplos marcadores imunes e tumorais na mesma seção de tecido. Essa abordagem permite a visualização in situ de diversas populações celulares preservando o contextoespacial 13. Coleta de Antígeno: Encha um pote de coloração com um tampão de recuperação de antígeno. Coloque o pote em um micro-ondas e aqueça em alta potência por 3 a 5 minutos até a solução começar a ferver. Transfira cuidadosamente as lâminas após a deparafinização e reidratação para o tampão de recuperação aquecido, garantindo que as seções do tecido estejam completamente submersas. O calor desliza em baixa potência de micro-ondas por 15 minutos para permitir uma desmascaramento eficiente do antígeno. Após aquecer, deixe os slides esfriarem naturalmente em temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira lâminas em água gelada por 5 minutos para interromper o processo de coleta de antígenos.
Lavagem e preparação da barreira hidrofóbica
Enxágue as lâminas 1x com água destilada para remover o tampão residual de recuperação. Use uma caneta barreira hidrofóbica para desenhar um círculo ao redor de cada seção de tecido. Enxágue novamente brevemente com água destilada. Lave os slides 2x com o buffer TBST. Após cada lavagem, coloque os slides horizontalmente por 3 minutos para garantir a remoção completa do buffer.
Bloqueio
Aplique um tampão bloqueante para cobrir totalmente a seção de tecido (~100 μL por lâmina). Incube as lâminas em uma câmara umidificada em temperatura ambiente por 15 minutos.
Incubação primária de anticorpos
Remova o buffer bloqueador batendo suavemente na borda do deslizador sobre papel absorvente. Anticorpos primários contra HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 e PanCK foram aplicados em diluições de trabalho otimizadas variando de 1:100 a 1:400. Aplique ~100 μL de solução primária diluída de anticorpos em cada seção de tecido. Incubar lâminas em uma câmara umidificada: 37 °C por 1 hora, ou 4 °C durante a noite para aumentar a sensibilidade.
Lavagem
Lave as lâminas 3x com o tampão TBST, 3 minutos em cada lavagem. Coloque os lâminas horizontalmente após cada lavagem para permitir a drenagem do amortecedor.
Incubação secundária de anticorpos
Prepare a solução secundária de anticorpos diluindo 1:3 no tampão TBST. Aplique aproximadamente 100 μL de solução secundária de anticorpos em cada lâmina. Incube as lâminas a 37 °C por 10 minutos em uma câmara umidificada. Lave as lâminas 3x com TBST, 3 minutos em cada lavagem.
Amplificação de sinal fluorescente
Dilua o reagente de amplificação fluorescente 1:100 no buffer de amplificação. Aplique 100 μL de reagente diluído em cada lâmina. Incube as lâminas em temperatura ambiente por 10 minutos no escuro para evitar o fotobranqueamento. Lave as lâminas 3x com TBST, 3 minutos em cada lavagem.
Recuperação de antígeno entre marcadores
Realize a coleta de antígenos por micro-ondas conforme descrito. Após o aquecimento, esfregue os slides sequencialmente: 5 minutos em água morna e 5 minutos em água gelada.
Coloração sequencial de marcadores adicionais
Repita as etapas primárias e secundárias de incubação de anticorpos para cada marcador adicional de anticorpos. Certifique-se de que a coleta de antígeno seja realizada após a coloração de cada marcador antes de prosseguir para o próximo anticorpo.
Contracoloração nuclear
Lave slides 1x com o buffer TBST. Aplique corante nuclear DAPI. Incube em temperatura ambiente por 5 minutos no escuro. Lave os slides 3 vezes com água destilada. Determinação do ponto final: Núcleos devem aparecer claramente corados sob microscopia de fluorescência.
Coloração apenas com marcador final
Aplique solução de biotina diluída a 1:200 em buffer de amplificação, incube por 10 minutos em temperatura ambiente. Lave os slides 3x com o buffer TBST. Realize a coleta de antígenos conforme descrito. Lave os slides 3x com o buffer TBST. Aplique um reagente endógeno bloqueador de biotina e incube a 37 °C por 30 minutos. Aplique o corante colorante 1:100 em TBST e incube por 30 minutos em temperatura ambiente, no escuro. Lave as lâminas 1x com TBST e deixe drenar por 3 minutos.
Montagem
Adicione uma gota de Meio de Montagem Antidescolorante na seção do tecido. Coloque cuidadosamente uma capa sobre o escorregador. Deixe as lâminas secarem antes da imagem.
Aquisição de imagens das seções H&E e mIF
Imagens de lâmina inteira (WSI) de seções de tecido com coragem H&E e mIF com FFPE foram obtidas usando um scanner de lâminas. A varredura em campo claro era realizada para seções H&E, enquanto a varredura por fluorescência era usada para seções mIF. Objetivo: ampliação de 20x para escaneamento geral; Ampliação 40x para imagem regional de alta resolução. Configurações de excitação e emissão: Otimizadas para cada fluoróforo de acordo com as especificações do fabricante. Tempo e ganho de exposição: Ajustados automaticamente por software de imagem para garantir intensidade adequada do sinal sem saturação.
Controle de qualidade do mIF e avaliabilidade de imagem
Para garantir a confiabilidade dos resultados do mFI, um rigoroso protocolo de controle de qualidade foi implementado antes da classificação de tecidos e quantificação celular usando o sistema digital de patologia HALO. Remoção de artefatos e definição de área avaliável: Imagens de diapositivos inteiros (WSIs) foram revisadas meticulosamente para excluir manualmente regiões contendo dobras de tecido, artefatos de coloração e sinais de fundo inespecíficos. Essa etapa foi essencial para evitar sinais falsos positivos e garantir a precisão da análise espacial. Após essa triagem, uma média de 80% (intervalo: 50%–95%) da área do tecido em todas as amostras foi designada como a região de mIF avaliável. Verificação patológica e particionamento: Para delimitar com precisão os compartimentos tumorais e estromais, as seções de MFI foram cruzadas com seções seriadas adjacentes coradas com H&E. As anotações foram revisadas independentemente por dois patologistas experientes, com quaisquer discrepâncias resolvidas por consenso. Amostras com área de tecido tumoral inferior a 30% foram excluídas do estudo para manter a rigor analítica. Validação pós-quantificação: Após fenotipagem e quantificação celular automatizadas, a distribuição espacial e os padrões de expressão das subpopulações de células imunes foram reavaliados por patologistas. Essa revisão garantiu que os dados quantitativos digitais fossem consistentes com as características histomorfológicas subjacentes, garantindo assim a confiabilidade e a precisão dos achados.
Análise digital de patologia e anotação regional
As imagens escaneadas panorâmicas foram importadas para a plataforma digital de análise de imagens de patologia para processamento. O HALO AI Nuclei Seg-Plugin foi usado para segmentar e identificar células. Usando a coloração H&E como referência, as seguintes regiões de interesse (ROIs) foram anotadas manualmente: Região do tumor total (WSIT); Limite tumoral (TB); Núcleo tumoral (TC). A detecção de sinais positivos foi determinada com base nos limiares de intensidade de fluorescência e na localização subcelular esperada de cada marcador. Essa abordagem específica de compartimento foi aplicada para minimizar a interferência de fundo e melhorar a precisão da identificação das células imunológicas. A densidade de células imunes foi quantificada como o número de células marcadores positivas por região tumoral selecionada. Alinhe imagens de mIF com anotações derivadas de H&E correspondentes baseadas na morfologia tecidual. Os pacientes foram estratificados em grupos de alta e baixa densidade de acordo com o valor mediano da densidade de células imunes para cada marcador.
Análise estatística
O software SPSS 17.0 era utilizado para análise. Os dados normalmente distribuídos foram expressos como média ± desvio padrão, e dados quantitativos distribuídos de forma não normal foram expressos como mediana (faixa de quantis de 25%-75%). A correlação entre cada tipo de mutação genética, densidade celular imune e características clínicas foi analisada pelo modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox, utilizando o modelo de linhas de vida da píton. De acordo com o tamanho da amostra e se os dados estavam em conformidade com a distribuição normal, o teste de Student ou o teste Mann-Whitney U foram usados para comparação entre variáveis contínuas. O teste de patente sinalada de Wilcoxon foi usado para comparação de variáveis de patente. O teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher foi selecionado para análise de variáveis categóricas não ordenadas de acordo com o tamanho da amostra e a frequência teórica. O teste de Spearman ou teste de Pearson foi usado para análise de correlação. A taxa geral de sobrevivência dos pacientes foi obtida pelo método Kaplan-Meier, e o teste de Log-rank foi usado para os testes. As curvas de sobrevivência foram desenhadas usando a linguagem R baseada no software RStudio. O valor p <0,10 foi considerado estatisticamente significativo.
Aplicabilidade prática e limitações
Para a implementação confiável desse fluxo de trabalho integrado, os blocos de tecido FFPE devem atender a rigorosos padrões de qualidade, incluindo uma celularidade tumoral ideal de ≥30% e ausência de necrose extensa ou artefatos teciduais significativos. O sucesso técnico do MFI depende fortemente da preservação tecidual; Fatores como superfixação, danos excessivos ou alta autofluorescência de fundo podem resultar em penetração inadequada de anticorpos e intensidade de sinal subótima. Além disso, várias limitações inerentes a este estudo devem ser consideradas. Primeiro, a análise é baseada em uma coorte retrospectiva de 63 pacientes de um único centro, o que pode limitar o poder estatístico e a ampla generalização dos achados para outras populações. Segundo, o escopo da avaliação é restrito a um painel fixo de 37 genes NGS e um conjunto específico de marcadores imunes (HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 e PanCK; Tabela Suplementar 1). Como observado nas fontes, embora essa abordagem combinada forneça um arcabouço mais robusto para a estratificação prognóstica, estudos prospectivos maiores e multicêntricos são necessários para validar ainda mais essas associações e refinar a utilidade preditiva dos biomarcadores identificados.
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Características clínicas dos pacientes com adenocarcinoma pulmonar
Um total de 63 pacientes diagnosticados com LUAD e passarampor tratamento cirúrgico em nosso hospital entre 2015 e 2021 e que atenderam aos critérios de inclusão foram coletados neste estudo. As características clínicas dos pacientes incluídos estão apresentadas na Tabela 1. Entre os pacientes inscritos, a idade mediana era de 60 anos (47-73 anos), incluindo 30/63 pacientes do...
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Perfilamento genômico integrado e espacialmente resolvido do LUAD
Este estudo demonstra um fluxo de trabalho integrado que combina NGS direcionado e mIF para caracterizar a paisagem multidimensional do LUAD. Nossos achados genômicos estão alinhados com a literatura anterior, especialmente no que diz respeito a variações étnicas nas frequências de mutações. A taxa observada de mutação EGFR (aproximadamente 40%-60%) é consistente com as frequências relatadas em...
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Os autores declaram que não há relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Esse trabalho foi apoiado pelo Projeto de Plano de Ciência e Tecnologia Médica e da Saúde da Província de Zhejiang (2022KY1237); O Projeto do Fundo de Pesquisa Científica do Departamento de Educação de Yunnan (2025Y0387); O Programa Chave de Pesquisa e Desenvolvimento de Yunnan (202403AC100002).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AlphaTSA Multiplex IHC Kit | alphaxbio Technology Co., Ltd. | AXT36025011 | Coloração por imunofluorescência multiplex |
| Meio de Montagem Antifade | Leagene Technology Co., Ltd. | IH0252, Lote 0525A17 | Coloração por imunofluorescência multiplex |
| CD163 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0428 | RRID:AB_3714707; Coloração por imunofluorescência multiplex |
| CD206 | Abcam, Inc | Cat# 5307-1 | RRID:AB_10896526; Coloração por imunofluorescência multiplex |
| CD68 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0060 | RRID:AB_2904190; Coloração por imunofluorescência multiplex |
| Painel Personalizado de Genes do Câncer | TWIST Co., Ltd. | Preparação para a Biblioteca NGS & nbsp; | |
| Buffe de Deparafinização | QIAGEN Co., Ltd. | 19093 | Extração de DNA com coloração HE; Coloração imunofluorescência multiplex a partir de Seções de Tecido FFPE |
| Dynabead M-270 estreptavidina | Thermo Co., Ltd. | 65602 | Preparação para a Biblioteca NGS & nbsp; |
| Fluorômetro | ThermoFisher Scientific Co., Ltd. | QUBIT 4.0 | Preparação para a Biblioteca NGS & nbsp; |
| Plataforma digital de análise de imagens patológicas HALO | Indica Labs, Inc., Albuquerque | Versão 3.6.4134 | Coloração por HE e análise de coloração por imunofluorescência multiplex |
| Kit de Coloração por Hematoxilina-Eosina | Wuhan elabscience Technology Co., Ltd. | E-IR-R117 | Mancha HE |
| HiPure FFPE DNA Kit | Guangzhou Magen Biotechnology Co., Ltd. | D6323 | Extração de DNA de Seções de Tecido FFPE |
| HLA-DR & NBSP; | HUABIO Co., Ltd. | ET1610-66 | RRID:AB_3069950; Coloração por imunofluorescência multiplex |
| Sequenciador de DNA Illumina | Illumina, Inc | 550DX | Sequenciamento |
| Bálsamo neutro | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | Mancha HE |
| Panck | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0069 | RRID:AB_2941997; Coloração por imunofluorescência multiplex |
| PD-L1 | Sistemas de P e D | Catálogo # AF1019 | RRID:AB_354540; Coloração por imunofluorescência multiplex |
| Buffer TBST | abclonla Technology Co., Ltd. | RM00013 | Coloração HE e coloração por imunofluorescência multiplex |
| UN-Blocker | homgen Co., Ltd. | Preparação para a Biblioteca NGS & nbsp; | |
| Contas Limpas de DNA VAHTS | Vazyme Co., Ltd. | N411 | Preparação para a Biblioteca NGS & nbsp; |
| Biblioteca uniersal de DNA VAHTS Kit de preparação para illumina | Vazyme Co., Ltd. | ND610 | Preparação para a Biblioteca NGS & nbsp; |
| Sistema de imagem com lâmina inteira | ZEISS Co., Ltd. | ZEISS AXIOSCAN 7 versão 3.3 | Coloração por HE e análise de coloração por imunofluorescência multiplex |
| Kit de Hibridização e Lavagem xGen | IDT Co., Ltd. | 1080577 | Preparação para a Biblioteca NGS & nbsp; |
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