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Artigo de método

Ensaio Dot Blot para Detectar Níveis Globais de Modificação do RNAN 6-metiladenosina

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DOI:

10.3791/69860

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6 de fevereiro de 2026

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar semi-quantitativamente os níveis globais de m⁶A usando dot blot. O RNA total é extraído, desnaturado, manchado em uma membrana de náilon, sondado com anticorpo anti-m⁶A e visualizado por quimioluminescência. A intensidade do sinal, quantificada pela análise em escala de cinza ImageJ, reflete a abundância relativa de metilação, proporcionando um fluxo de trabalho reprodutível para pesquisas.

Resumo

A N6-metiladenosina (m⁶A) é a modificação interna mais abundante no RNA mensageiro eucariótico (mRNA) e atua como um regulador chave da expressão gênica pós-transcricional. Métodos para investigar m⁶A podem ser aplicados em múltiplos níveis de resolução, incluindo quantificação global, detecção específica de nucleótidos e análise de transcritos específicos de interesse. Entre eles, o ensaio dot blot oferece uma abordagem simples, rápida e econômica para avaliação semi-quantitativa dos níveis globais de modificação de m⁶A. Neste ensaio, as células são primeiro processadas para extrair o RNA total, que é então diluído e desnaturado. As amostras de RNA são localizadas em uma membrana de nylon, sondadas com um anticorpo anti-m⁶A e visualizadas por quimioluminescência, com intensidade do sinal indicando a abundância relativa de metilação. Por fim, a quantificação e a comparação das intensidades do sinal são realizadas medindo valores em escala de cinza com o ImageJ. Comparado a métodos baseados em sequenciamento ou espectrometria de massa, o dot blot requer instrumentação mínima e expertise técnica, tornando-o particularmente adequado para triagem rotineira, estudos funcionais preliminares e análises comparativas. Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho detalhado e reprodutível para implementar o ensaio blot de pontos m⁶A tanto em pesquisas básicas quanto em aplicações translacional.

Introdução

N 6-metiladenosina (m⁶A) é a modificação interna mais prevalente no RNA mensageiro eucariótico (mRNA) e desempenha um papel essencial na regulação pós-transcricional, incluindo estabilidade, emendamento, degradação, tradução e exportação doRNA 1,2,3. A desregulação da modificação m⁶A tem sido implicada em diversos processos fisiológicos e patológicos, incluindo iniciação, progressão e metástasetumorais 4,5. No osteossarcoma, níveis elevados de m⁶A foram observados tanto em linhas celulares quanto em tecidos, sugerindo um papel da metilação aberrante de RNA na biologiada doença 6,7. Portanto, a avaliação sistemática da abundância global de m⁶A, juntamente com suas mudanças nos transcritos associados ao osteossarcoma e nas vias regulatórias, é essencial para esclarecer os mecanismos biológicos e as implicações clínicas da metilação de RNA no osteossarcoma.

Existem vários métodos analíticos disponíveis para estudar as modificações m⁶A 8,9. Cromatografia líquida-espectrometria de massas/espectrometria de massas (LC-MS/MS)10 e ensaios baseados em ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) 11 são ambos usados para medir os níveis globais de m⁶A. O primeiro oferece alta sensibilidade, mas requer equipamentos e expertise especializados, enquanto o segundooferece m 6 A levels relativos e contribui para um custo maior que o ensaio dot blot. O MeRIP-qPCR permite avaliação direcionada de transcritos específicos, mas é fortemente influenciado pela eficiência daimunoprecipitação 12. MeRIP-seq 13, m⁶A-seq14 e m⁶A-SAC-seq15 são abordagens baseadas em sequenciamento, que podem mapear com precisão sítios de metilação m⁶A; no entanto, são caras e exigem análise bioinformática extensiva.

O ensaio blot de pontos m⁶A oferece um método simples, rápido e econômico para determinar os níveis globais de modificação de m⁶A no RNA. Como um imunoensaio semi-quantitativo, sua principal vantagem está em gerar uma visão geral da abundância de m⁶A sem a necessidade de equipamentos especializados ou análises bioinformáticas complexas. Isso torna o ensaio blot de pontos m⁶A uma ferramenta valiosa para triagem rotineira, validação funcional preliminar e pesquisa clínica, além de um complemento prático para abordagens avançadas baseadas em sequenciamento e espectrometria de massas. O protocolo atual oferece um fluxo de trabalho detalhado passo a passo, garantindo detecção reprodutível e ampla aplicabilidade.

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Protocolo

NOTA: O protocolo está organizado em três seções: preparação de RNA, ensaio dot blot e quantificação. A Tabela de Materiais resume os materiais necessários, a Tabela Suplementar 1 detalha as formulações dos reagentes e a Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho experimental.

1. Preparação de RNA

  1. Preparação celular
    1. Retire células 143B com SNHG21-knockdown estável (shSNHG21), células controle negativas (shCtrl) e células tratadas com 3-deazaadenosina (3-DAA); [100 μM, 24 h]) e ácido meclofenâmico (MA; [100 μM, 24 h]) do incubador de 37 °C.
    2. Verifique se a confluência celular está em aproximadamente 80-90% e que as células estão em boas condições sob o microscópio.
    3. Remova o meio de cultivo e depois enxágue as células duas vezes com 1 mL de PBS.
    4. Remova PBS e adicione 1 mL de tripsina por recipiente de 6 cm.
    5. Sacode suavemente para distribuir a tripsina de forma uniforme e incube por 1 minuto.
    6. Remova a tripsina e depois adicione 1 mL de meio contendo 10% de FBS para interromper a digestão.
    7. Pipete a suspensão celular várias vezes para dispersar as células.
    8. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga livre de RNase de 1,5 mL.
      NOTA: Rotule o tubo antes de usar. Os passos 1.1.3 a 1.1.8 devem ser realizados em condições estéreis.
    9. Centrifuge a 1000 × g por 3 minutos e depois remova completamente o sobrenadante.
  2. Extração de RNA
    NOTA: A extração de RNA é realizada usando o kit de purificação de RNA EZ-press.
    1. Adicione 600 μL de tampão de lise (presente no kit de purificação de RNA) ao pellet e vórtice cuidadosamente para lisar completamente as células, e deixe repousar por 5 minutos.
      NOTA: Aproximadamente 2 × 106 células são usadas para isolamento de RNA.
    2. Adicione um volume igual de 100% de etanol e faça vórtice cuidadosamente.
    3. Adicione 600 μL da mistura em uma coluna de spin montada com um tubo coletor.
      NOTA: Monte a coluna de centrifugação e o tubo de coleta antes do uso, e etiquete o tubo antes do uso.
    4. Centrifuge a 12.000 × g por 1 minuto e descarte o líquido no tubo de coleta.
      NOTA: Evite contato entre o fundo da coluna e o líquido ou o operador.
    5. Repita os passos acima 1.2.3-1.2.4 para a mistura restante.
    6. Adicione 500 μL de tampão de lavagem (presente no kit de purificação de RNA) a cada coluna de spin, deixe-a em temperatura ambiente por 1 minuto.
    7. Centrifuge a 12.000 × g por 1 minuto e descarte o líquido no tubo de coleta.
    8. Centrifuge novamente a coluna vazia a 12.000 × g por 1 minuto para remover o líquido residual.
    9. Transfira a coluna de spin para um novo tubo livre de RNase de 1,5 mL, abra a tampa e sece ao ar por 2 minutos.
      NOTA: Rotule o tubo antes de usar.
    10. Adicione 25-50 μL de tampão de elução (água sem enzimas) ao centro da coluna de spin.
    11. Incube em temperatura ambiente por 2 minutos.
    12. Centrifuge a 12.000 × g por 1 minuto para eluir RNA.
    13. Descarte a coluna de spin e coloque o RNA no gelo.
      NOTA: Armazene RNA a -80 °C até o uso.
  3. Diluição de RNA
    1. Medindo a concentração de RNA de células 143B shSNHG21, células 143B shCtrl e células tratadas com 3-DAA e MA usando um espectrofotômetro DS-11.
    2. Prepare 1 μg de RNA total de cada linha celular.
    3. Diluir em série o RNA para 400 ng, 200 ng e 100 ng com água tratada com pirocarbonato de dietílico (DEPC).
      NOTA: Ajuste o gradiente de concentração conforme necessário.
  4. Desnaturação de RNA
    1. Amostras de RNA diluídas aquecendo a 95 °C por 3 minutos.
    2. Transfira imediatamente as amostras para gelo para esfriar.
      NOTA: RNA desnaturado pode ser armazenado a 4 °C por até 1 semana.

2. Mancha de pontos

  1. Spotting de RNA
    1. Corte a membrana de nylon carregada positivamente para o tamanho desejado.
    2. Desenhe linhas de referência e rotule a membrana com o nome da amostra.
    3. Misture o RNA cuidadosamente por meio de vórtices suaves ou pipeteamento.
    4. Coloque 1-2 μL de cada amostra de RNA nas posições designadas da membrana.
      NOTA: Use pontas de pipeta sem RNase o tempo todo. Evite contato direto entre a ponta da pipeta e a membrana. Permita que o RNA se difunda naturalmente na membrana. Use uma nova ponta de pipeta para cada amostra. Não exceda 2 μL por ponto para evitar difusão irregular.
  2. Reticulação de RNA
    1. Seque a membrana ao ar por 3 minutos.
    2. Realize a reticulação de RNA irradiando a membrana em um reticulador UV a 254 nm, 120 mJ/cm².
      NOTA: Incube a membrana a 37 °C por 30 minutos como opção alternativa.
    3. Lave a membrana com 10 mL de 1x TBST em uma plataforma de balanço por 5 minutos para remover RNA não ligado.
  3. Bloqueio de membrana
    1. Prepare uma solução de BSA de 5%.
      NOTA: Prepare esta solução limpa antes do uso.
    2. Incube a membrana na solução bloqueadora em temperatura ambiente por 2 horas.
  4. Incubação de anticorpos
    1. Incube a membrana com anticorpo anti-m⁶A durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Diluir o anticorpo 1:1000 em solução de 5% de BSA antes do uso. Incube a membrana em uma plataforma de balanço com um leve sacudimento (50 rpm).
    2. Lave a membrana três vezes com 10 mL de 1x TBST em uma plataforma de balanço por 10 minutos.
    3. Incube a membrana com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de raiz-forte (HRP) por 1 hora em temperatura ambiente.
      NOTA: Diluir o anticorpo 1:1000 em solução de 5% de BSA antes do uso.
    4. Lave a membrana três vezes com 10 mL de 1x TBST em uma plataforma de balanço por 10 minutos.
  5. Detecção de quimioluminescência
    1. Aplique uniformemente o substrato quimioluminescente de HRP em direção à gota sobre a membrana.
      NOTA: Incube a membrana com substrato por 1 minuto em temperatura ambiente, balançando suavemente.
    2. Detectar sinal usando um sistema de imagem quimioluminescência.
    3. Use uma função de autoexposição no sistema de imagem por quimioluminescência como pré-varredura inicial.
      NOTA: Aceite auto-tempo apenas se o sinal mais brilhante estiver com saturação inferior a 65%; caso contrário, reduza a exposição pela metade e recupere até que o sinal de pico fique entre 30-60%.
  6. Coloração com azul de metileno (MB)
    1. Incube a membrana na solução de coloração de MB por 1 minuto.
    2. Lave a membrana três vezes com 10 mL de 1x TBST em uma plataforma de balanço por 5 minutos, e imagine como controle de carga.
      NOTA: Tinga a mesma membrana usada para quimioluminescência. Evite perturbar sedimentos na solução de tingimento. Use roupas de proteção e máscara, pois a MB é difícil de remover.
    3. Remova a membrana manchada com MB após a imagem, utilizando uma solução contendo 1% de SDS em uma plataforma de balanço por 15 minutos para facilitar a documentação ou possível re-sondagem.

3. Quantificação

  1. Medição de valores em escala de cinza
    1. Importe a imagem para o software ImageJ.
    2. Converta a imagem para o formato de 8 bits usando o Tipo > Imagem > 8 bits.
    3. Subtrair o fundo com Processo > Subtrair o Fundo.
      NOTA: Raio: 50,0 pixels, verifique o fundo claro.
    4. Use a ferramenta Retângulo para selecionar a área de análise.
    5. Defina as faixas sequencialmente com Analisar > Gels > selecionar a Primeira Faixa.
    6. Gerar perfis de intensidade usando Analisar > Gels > Traçar Pistas e medir picos.
    7. Meça os valores em escala de cinza de m⁶A e MB, respectivamente.
  2. Copie os dados em uma tabela para análise.
  3. Compare intensidades de sinal para avaliar os níveis globais de modificação de m⁶A.

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Resultados

Para validar rigorosamente o desempenho do ensaio dot blot e examinar o papel do SNHG21 na regulação dos níveis globais de m6A , 143 células B foram submetidas a perturbações farmacológicas que suprimem ou aumentam a metilação de m6A e monitoraram a abundância de m6A em ambas as direções.

Quantificação por mancha de pontos da abundância global de m6 A
Primeiro avaliamos a capacidade desse ensaio de detectar reduçõ...

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Discussão

Neste estudo, a redução do SNHG21 em células osteosarcoma 143B resultou em redução da intensidade do sinal m⁶A, demonstrando o valor desse ensaio para avaliar se modificações genéticas afetam a metilação do RNA. Além disso, este ensaio serve como ferramenta para múltiplas aplicações, incluindo: 1) Estudos funcionais e validação mecanicista: Este ensaio pode ser usado para triagem preliminar rápida para determinar se os níveis globais de m⁶A estão associados a processos biológicos específ...

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Divulgações

Os autores relatam que não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado por bolsas da National Nature Science Foundation (82174408, 82374477 e 82474535). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-deazaadenosina (3-DAA)MCEHY-W013332A1 mg
Anticorpo monoclonal anti-m6AProteintech68055-1-IG50 & mu; L
Albumina sérica bovina (BSA, Fração V)BioFroxx4240GR100 100 g
Sistema de Imagem MP ChemiDocBIO RAD12003154
DMEM Glicose AltaWISENT319-005-CL500 mL
Espectrofotômetro DS-11DeNOVIXDS-11
Kit de Purificação de RNA EZ-pressEZB B0004DP100 Preparativos
FBS - Qualidade superiorWISENT086-150500 mL
IgG Anti-Camundongo conjugado com HRP (H+L)BeyotimeA02161 mL
Substrato Immobilon Western Chemical Luminescenescente HRP  MilliporeWBKLS05002 e vezes; 250 mL
Ácido meclofenâmico (AM)MCEHY-1172751 mg
Solução de coloração com azul de metilenoSolarbioG13000,1%, 100 mL
Membrana de transferência de náilonLABSELECTTM-NY-XS-457,4 e vezes; 8,5 cm, 0,45 & mu; m, 10 PCS/BAG
PBS buffer (pó seco pronto para uso)biosharpBL601ApH: 7,2-7,4, 2 L/bag
Dodecilsulfato de sódio (SDS)SigmaL5750-500G500 g
Pó pré-misturado tampão TBSSangon  A510025-00011EA (243,9 g de pólvora)
Enzima TrypLE ExpressGibco12604-0211 vezes, 500 mL
Pré-adolescente-20SangonA600560-0500500 mL
Cruzamento UVUVPCL-1000

Referências

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