Construção de organoides das glândulas salivares a partir de glândulas salivares menores humanas

Resumo

Esse protocolo gera organoides das glândulas salivares menores humanas por meio da autoorganização das células-tronco das glândulas salivares menores humanas (hMSG-SCs) e das células-tronco mesenquimatosas das glândulas salivares menores humanas (hMSG-MSCs) dentro de um sistema Matrigel 3D.

Resumo

Este estudo descreve um protocolo para construir organoides da glândula salivar menor humana (hMSG) para estabelecer um modelo reprodutível para pesquisas em regeneração de tecidos. Células-tronco/progenitoras das glândulas salivares (hMSG-SCs) e células-tronco mesenquimatosas (hMSG-MSCs) foram isoladas de tecidos das glândulas salivares menores pediátricas, expandidas e co-semeadas em um sistema tridimensional (3D) baseado em Matrigel. A auto-organização levou à formação de organoides com estruturas semelhantes a ducais-acinar, recapitulando a heterogeneidade celular nativa de forma mais eficaz do que modelos apenas epiteliais. O protocolo atual enfatiza condições de cultivo otimizadas para preservar fenótipos celulares e etapas padronizadas para passagem, mistura de proporções e manuseio do Matrigel (uma matriz comercial de embasamento), aumentando assim a reprodutibilidade. Importante, a presença de células mesenquimatosas proporciona um microambiente de suporte que promove a sobrevivência epitelial, proliferação e morfogênese, superando limitações de baixa eficiência e estrutura incompleta. Essa abordagem permite a geração consistente de organoides das glândulas salivares e oferece um modelo robusto para estudar desenvolvimento, restauração funcional e mecanismos de doenças, além de apoiar potenciais aplicações translacionais em terapias regenerativas.

Introdução

As glândulas salivares são glândulas exocrinas essenciais na cavidade oral, responsáveis por secretar saliva para manter a umidade oral, auxiliar na digestão e fornecer defesa^{antimicrobiana.} Disfunções dessas glândulas, como na síndrome de Sjögren ou danos pós-radiação, podem levar a graves problemas bucais, e tratamentos regenerativos eficazes atualmente são^{insuficientes 2}. A tecnologia organoide, um método emergente para construir substitutos celulares que imitam a estrutura e função de tecidos e órgãos em um sistema de cultura tridimensional (3D), oferece uma ferramenta promissora para pesquisas sobre regeneração das glândulas^{salivares 3}.

Nos últimos anos, sistemas de cultura organoide de glândulas salivares em camundongos e humanos foram estabelecidos^{com sucesso 4,5}. Diversos tipos de células-tronco, incluindo células-tronco/progenitoras das glândulas^{salivares 4,5}, células-tronco^{pluripotentes 6,7} e células-tronco derivadas de epitelios, como células-tronco foliculares^{dentárias 8}, foram usados para gerar esses organoides. No entanto, vários desafios técnicos permanecem. Células-tronco/progenitoras primárias das glândulas salivares humanas (hSG-epiS/PCs) apresentam proliferação limitada e baixa sobrevivência in vitro, o que restringe a eficiência da formação de organoides e a reprodutibilidade⁹. Além disso, organoides derivados exclusivamente de células epiteliais frequentemente carecem de heterogeneidade multicelular e não conseguem recapitular totalmente a arquitetura ramificada e a organização funcional acinar-ductal das glândulas^{nativas 10}.

Nesse contexto, este estudo visa estabelecer um método padronizado para construir organoides das glândulas salivares menores humanas. Primeiro, isolamos células-tronco (hMSG-SCs) e células-tronco mesenquimatosas (hMSG-MSCs) de tecidos das glândulas salivares menores^humanas 11,12,13. Organoides foram posteriormente iniciados por meio de um mecanismo auto-assemblante ao co-semear hMSG-SCs e hMSG-MSCs em Matrigel. Esse método fornece uma plataforma reprodutível para a cultura de organoides das glândulas salivares e estabelece uma base importante para pesquisas futuras em regeneração das glândulas salivares e modelagem de doenças.

Protocolo

Amostras de glândulas salivares menores humanas (hMSG) foram obtidas de pacientes submetidos a cirurgia labial no Departamento de Cirurgia Plástica e Reconstrutiva, Hospital Popular Nono de Xangai, Faculdade de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai. Os pacientes (n > 10) tinham entre 3 meses e 10 anos, sem histórico de distúrbios relacionados às glândulas ou doenças autoimunes. Todos os tecidos foram obtidos de glândulas salivares menores redundantes e histologicamente normais, excisadas durante o reparo do lábio leporino, o que fornece uma fonte eticamente aprovada e ótima de tecido viável para isolamento de células-tronco/progenitoras. O consentimento informado foi obtido pré-operatório, e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Popular Nono de Xangai (Aprovação nº 2018-56). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Coleta de tecido das glândulas salivares menores humanas

1. Imediatamente após a excisão, imerga os tecidos das glândulas salivares no Meio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com antibióticos, e mantenha-se a 4 °C até o processamento posterior (dentro de 6 horas).

2. Isolamento celular dos tecidos menores das glândulas salivares humanas

1. Garanta condições estéreis preparando um kit cirúrgico autoclavado e realizando todos os procedimentos dentro de um gabinete de biossegurança (BSC Classe II).
2. Transfira o tecido excisado para um recipiente de cultura contendo o Soro Salino Tamponado com Fosfato (PBS) da Dulbecco e lave cuidadosamente. Durante o processo de lavagem, use pinças para remover cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo e sangue residual, garantindo que o tecido da glândula salivar esteja completamente limpo.
3. Adicione 1 mL de meio sem sérum para evitar a desidratação dos tecidos. Triturar o tecido em pedaços no máximo 0,5^{mm 3} usando tesoura oftalmóloga estéril.
4. Usando pinças estériles, distribua uniformemente os pedaços de tecido no fundo de um frasco de cultura T-25.
5. Adicione 10 mL de meio de cultura ao frasco de cultura.
   NOTA: Para a cultura de células-tronco epiteliais (hMSG-SCs), o principal meio de cultivo utilizado é o Meio de Queratinócitos (KM), contendo 5 μg/mL de albumina sérica bovina, 50 μg/mL extrato de hipófise bovina, 5 μg/mL transferrina, 3,75 μg/mL de insulina, 3 ng/mL fator de crescimento de fibroblastos 2, 1 ng/mL fator de crescimento epidérmico, 500 ng/mL epinefrina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, ^10-8 M de prostaglandina_{E 2} e 30 nM_{T 3}. Para a cultura de células-tronco mesenquimatosas (hMSG-MSCs), o meio de cultivo primário consiste em DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (5.000 U/mL) e suplemento de 1% de GlutaMAX.
6. Coloque o frasco T-25 verticalmente em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ , por 4-5 horas. Na posição vertical, o meio não entra em contato com o tecido picado, permitindo que os explantantes se assentem e se fixem firmemente na superfície inferior.
7. Após 4-5 horas, mude o frasco para uma posição horizontal de modo que o meio de cultura cubra completamente os pedaços de tecido anexados e suporte o crescimento celular.
8. Substitua metade do meio no quarto dia e depois substitua o meio a cada 3 dias até aparecerem colônias celulares. Quando a inibição do crescimento celular for observada, prossiga com a passagem.

3. Passagem celular

1. Células de passagem quando colônias celulares primárias apresentam inibição de crescimento ou quando a confluência celular atinge 80%-90%.
2. Aspire o meio de cultivo e lave as células uma vez com PBS.
3. Adicione 1 mL de 0,25% de Tripsina-EDTA e incube a 37°C, 5% de_CO2 por 4 minutos para células epiteliais e 1,5 min para células mesenquimais, respectivamente.
4. Neutralize a tripsina adicionando 5 mL de meio DMEM pré-aquecido suplementado com 10% de FBS. Pipete suavemente as células para garantir a dissociação adequada, depois transfira a suspensão celular para um tubo centrífugo e centrifuge a 300 × g por 5 minutos.
5. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os hMSG-SCs em meio KM, e resuspenda os hMSG-MSCs no Meio de Células-Tronco Mesenquimalesa (MSCM).
6. Semeie as células ressuspensas em frascos de cultura T-25 em proporção 1:3, depois incube a 37 °C, 5% de_CO2 para continuar a expansão.

4. Auto-organização dos hMSG-MSCs e hMSG-SCs para construção de organoides

1. Descongelar Matrigel no gelo por 3-4 horas.
2. Pré-aqueça uma placa de 24 poços a 37 °C em uma incubadora e pré-resfrie as pontas da pipeta a 4 °C para manuseio preciso.
3. Adicione 450 μL de PBS estéril pré-resfriado a 1 mL de Matrigel totalmente descongelado.
4. Misture delicadamente usando pontas de pipeta pré-resfriadas e distribua 350 μL do Matrigel diluído por poço na placa pré-aquecida de 24 poços, garantindo que não formem bolhas.
5. Incline a placa suavemente para garantir um revestimento uniforme com Matrigel.
6. Coloque a placa em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO₂ , por 20-30 minutos para permitir que o Matrigel solidifique. Evite secar demais o Matrigel.
7. Cultive hMSG-MSCs e hMSG-SCs nas passagens 3-5 separadamente até atingirem confluência de 80%-90%. Digere células com 0,25% de Tripsina-EDTA, neutralize com meio completo e conte o número celular usando um contador celular automatizado ou hemocitômetro.
8. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos, descarte o sobrenadante e resuspenda em meio cultivado fresco.
9. Misture hMSG-MSCs e hMSG-SCs em uma proporção de 1:1.
10. Semeie as células em placas de 24 poços revestidas com Matrigel a uma concentração total de 2 x 10^{5 células} por poço.
11. Adicione 1 mL de meio de cultivo organoide (MSCM:KM = 1:1) a cada poço.
12. Incube a 37 °C, 5% de_CO2 e troque o meio a cada 3 dias.
13. Subcultura dos organoides a cada 7 dias na proporção de 1:2 para 1:4, e resuspende em meio congelante celular para armazenamento a -80 °C.

5. Estatística e reprodutibilidade

1. Analise todos os dados usando softwares estatísticos e gráficos e apresente como média ± desvio padrão (DS). Testes t de Student bidirecionais e não pareados foram usados para comparações entre dois grupos. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
   NOTA: Todos os experimentos foram repetidos independentemente pelo menos três vezes com resultados semelhantes, e todas as análises estatísticas foram baseadas em pelo menos três experimentos ou amostras independentes.

Resultados

Explantações de tecido salival menor em humanos cultivadas em frascos T25 apresentaram crescimento celular claro ao redor dos blocos de tecido após aproximadamente 5 dias. Em meio de cultura de células-tronco rico em soro, as células apresentaram morfologia em formato de fuso característica dos hMSG-MSCs (Figura 1A,B). A análise de citometria de fluxo revelou que essas células expressaram altos níveis de marcadores de células-tronco mesenquimatos, incluindo CD29, CD90, CD105...

Discussão

Esse protocolo permite a construção bem-sucedida de organoides das glândulas salivares menores humanas por meio do isolamento e cultura de hMSG-SCs e hMSG-MSCs. A formação dos organoides depende da preparação cuidadosa dos explantes de tecido, manutenção de condições de cultivo distintas para células epiteliais e mesenquimatosas, e co-semeadura precisa de ambos os tipos celulares em Matrigel. Proporções celulares e densidades de semeadura apropriadas são críticas para apoiar a auto-organ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco' s Eagle Medium Modificado (DMEM)	Gibco	C11885500BT
0,25% Tripsina-EDTA	Gibco	25200056
Dulbecco' s Eagle Medium Modificado (DMEM)/F12	Gibco	C11330500BT
Soro fetal bovino (FBS)	Gibco	10270106
GlutaMAX	Gibco	35050061
Meio de Queratinócitos	Sciencell	2101
Matrigel	BD	356230
Meio de Células-Tronco Mesenquimalesa (MSCM)	Sciencell	7501
Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140122
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	C20012500BT