Este artigo apresenta um modelo isquêmico de DRC usando IRI renal unilateral com nefrectomia contralateral realizada um dia antes da coleta da amostra; esse protocolo permite avaliação funcional baseada em soro, alta sobrevivência e patologia reprodutível da DRC em 28 e 42 dias, proporcionando uma plataforma versátil para estudos mecanicistas e intervencionistas.
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Artigo de método
Modelo murino de transição aguda para crônica de doença renal induzida por isquemia/lesão de reperfusão renal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A oclusão transitória cirúrgica do pedículo renal induz lesão por isquemia-reperfusão renal (IRI), um modelo amplamente utilizado para estudar lesão renal aguda (AK) e sua progressão para doença renal crônica (DRC) em camundongos. No entanto, protocolos convencionais frequentemente impedem a avaliação funcional baseada em soro ou apresentam alta mortalidade. Embora os modelos existentes de IRI renal unilateral e bilateral enfatizem a reprodutibilidade, permanecem desafios para alcançar tanto a gravidade da lesão consistente quanto a sobrevivência a longo prazo, adequada para estudar a progressão da DRC. Aqui, apresentamos um protocolo de abordagem dorsal que fornece um modelo robusto e reproduzível da transição isquêmica de AKI para DRC. A abordagem dorsal facilita o acesso direto aos rins e minimiza a manipulação intraabdominal. Utilizamos IRI renal unilateral combinada com nefrectomia contralateral realizada um dia antes da coleta de sangue e tecido. Essa abordagem oferece duas vantagens principais: (1) minimiza a variabilidade ao evitar as inconsistências associadas à lesão bilateral, e (2) alcança quase 100% de sobrevivência mantendo lesão consistente, em contraste com protocolos em que a nefrectomia é realizada mais cedo e associada a maior mortalidade. A avaliação funcional é realizada por BUN sérico e creatinina, e a fibrose intersticial é quantificada pelos genes de deposição de colágeno à base de tricromo e marcadores de DRC de Masson aos 28 e 42 dias após a IRI renal. Juntos, esses resultados fornecem insights complementares sobre comprometimento funcional e desenvolvimento de patologia tecidual. Este protocolo estabelece um modelo confiável e versátil de DRC isquémica em camundongos para investigações mecanicísticas.
Introdução
A AKI é uma complicação comum em pacientes hospitalizados e continua sendo um grande problema global de saúde. Estudos epidemiológicos indicam que a AKI ocorre em até 20% dos indivíduos hospitalizados e em 30-60% dos pacientes em estado crítico 1,2. Embora alguns pacientes recuperem a função renal, outros apresentam recuperação incompleta, predispunzendo-os àDRC 3. A transição da IKI para a DRC é cada vez mais reconhecida como um dos principais determinantes dos desfechos de longo prazo e tornou-se foco de pesquisas mecanicistas e terapêuticas 4,5,6. Para estudar os mecanismos moleculares subjacentes e testar potenciais terapias, modelos animais reprodutíveis são essenciais.
A oclusão transitória cirúrgica do pedículo renal (artéria e veia) induz IRI renal, um dos modelos mais amplamente utilizados para estudar a AKI em camundongos. Esse procedimento causa lesão epitelial tubular aguda e uma resposta inflamatória que pode evoluir para fibrose intersticialcrônica 7,8. No entanto, protocolos convencionais de IRI renal apresentam vários desafios. A IRI renal unilateral está associada a mortalidade mínima e é amplamente empregada em investigações de longoprazo 9; No entanto, a avaliação da função renal (por exemplo, química sérica, análise de urina ou taxa de filtração glomerular) não é viável. IRI renal bilateral ou modelos que combinam IRI renal unilateral com nefrectomia contralateral simultânea ou precoce estão associados ao aumento da mortalidade, limitando seu uso para estudos crônicos. Embora variações robustas desses modelos tenham sido investigadasrecentemente 10, sua aplicação em contextos de estudos crônicos merece consideração cuidadosa. Além disso, alguns protocolos utilizam uma laparotomia ventral na linha média, que requer manipulação dos órgãos intra-abdominais para expor o pedículo renal. Isso pode aumentar a invasividade cirúrgica e a complexidade técnica. Skrypnyk et al. relataram que a nefrectomia contralateral realizada 8 dias após isquemia unilateral permite avaliação sorológica da função renal após lesão, mantendo uma alta taxa desobrevivência 11. Esse protocolo fornece um conjunto sistemático de procedimentos otimizados para avaliar a progressão da IAC para a DRC ao longo de até 42 dias.
Este estudo demonstra um modelo isquêmico de AKI-DRC usando IRI renal unilateral, seguido por nefrectomia contralateral retardada realizada um dia antes da coleta de rim e amostra de sangue. Já empregamos procedimentos semelhantes como modelo AKI em várias publicações12, 13, 14, 15. Estendemos com sucesso essa abordagem para estudar a transição de AKI para DRC, na qual, nos dias 28 e 42, sinais claros de DRC são evidentes (Figura 1 para o esquema). Essa abordagem proporciona excelente sobrevivência, induz um fenótipo altamente fibrótico nos rins lesionados e permite a avaliação da função renal usando sangue coletado. Portanto, essa abordagem é particularmente útil para estudos que exigem avaliação sorológica (ao contrário da IRI renal unilateral apenas) e taxa de sobrevivência melhorada (em comparação com IRI renal bilateral). Uma abordagem de flanco dorsal foi usada para acessar diretamente o rim. Comparada à laparotomia ventral da linha média, essa abordagem minimiza a manipulação intraabdominal e confina a manipulação cirúrgica aos tecidos renais e perihilares, melhorando assim a consistência do procedimento.
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Protocolo
Os experimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh (IACUC; Protocolo nº 23103811), de acordo com as diretrizes institucionais. Um grupo controle de cirurgia simulada pode ser incluído, conforme apropriado, e normalmente passa por exposição cirúrgica sem clampagem vascular ou nefrectomia contralateral. Consulte a seção de Materiais para informações detalhadas sobre as ferramentas e equipamentos utilizados. Itens cortantes, incluindo agulhas, lâminas de bisturi e clipes, devem ser descartados em recipientes específicos para objetos afiados. Resíduos biológicos, incluindo tecidos e cadáveres, devem ser manuseados e descartados de acordo com os protocolos institucionais de resíduos de risco biológico. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação animal e preparativos cirúrgicos
- Autoclave de todos os instrumentos cirúrgicos antes do uso. Ao realizar cirurgias em vários animais, remova sangue e detritos dos instrumentos entre os procedimentos e depois esterilize-os por 10-15 segundos usando um esterilizador de bolas quentes. Deixe os instrumentos esfriarem antes de reutilizar.
- Instale uma almofada térmica que circule água e posicione uma lâmpada infravermelha acima do campo cirúrgico.
- Coloque o camundongo em uma câmara de indução de anestesia e induza a anestesia com isoflurano (1,5%-2% em oxigênio, 1-2 L/min) (seguindo protocolos institucionalmente aprovados). Quando o camundongo parecer ter perdido a consciência, confirme a profundidade anestésica adequada realizando um beliscão no dedo do pé para verificar a perda dos reflexos.
- Transfira o rato para a almofada cirúrgica aquecida e mantenha a anestesia por meio de um cone nasal.
- Administrar Ethiqa XR (buprenorfina de liberação prolongada; 3,25 mg/kg, s.c.) para analgesia pós-operatória.
- Coloque o rato na posição deitada sobre a almofada cirúrgica. Prenda os membros com fita adesiva se necessário para minimizar o movimento.
- Raspe os pelos dorsais ao redor do local da incisão pretendido usando uma máquina de cortar a cabeça.
- Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento durante o procedimento.
- Insira uma sonda retal, prenda-a com fita adesiva e conecte-a a um termômetro para monitoramento contínuo.
- Desinfete a área cirúrgica alternando 10% de povidona-iodo e 70% de etanol, depois cubra a área com uma cortina estéril.
2. IRI renal unilateral
- Faça uma incisão na pele dorsal média (3-4 cm) que atravessa o nível dos rins.
- Separe a pele das camadas subcutâneas usando tesouras separadoras de tecido.
- Identifique a localização do rim por palpação através da pele.
- No nível onde o rim é visualizado, aproximadamente 1 cm lateral à coluna no lado esquerdo, faça uma incisão muscular longitudinal de 1 a 1,5 cm.
NOTA: Se a incisão for muito longa, o rim pode deslizar de volta para a cavidade abdominal, complicando a manipulação subsequente. Uma incisão mínima na pele pode manter o rim exteriorizado. - Exteriorize suavemente o rim através da incisão dorsal. Se uma membrana fina obstruir o acesso, dissece-a de forma direta.
- Ao estabilizar o rim com pinças não serrilhadas, dissece de forma direta a gordura perihilar e o tecido conjuntivo ao redor do pedículo renal superior e inferior para criar um "canal" para a colocação de uma pinça vascular.
- Confirme se a temperatura central do corpo está suficientemente alta (36,8-37,2 °C) antes de induzir isquemia. Aplique uma pinça vascular não traumática na artéria renal e na veia como um feixe.
NOTA: Certifique-se de que os vasos estejam centralizados nas mandíbulas da pinça e comprimidos com pressão constante. Aplique a gramposa em um local consistente no hilo. Oriente a gramposa perpendicularmente ao eixo do vaso. Essa pinça específica pode ser reutilizada para cerca de 10 procedimentos com animais. - Puxe a pele para cobrir o rim e mantê-la o mais próxima possível da temperatura corporal central.
- Mantenha a temperatura central do corpo entre 36,8 e 37,2 °C durante a isquemia, ajustando a bomba de calor entre 38-39 °C (ajuste conforme necessário) e ligando/desligando a lâmpada infravermelha para manter a temperatura corporal alvo (ajustando a distância da lâmpada conforme necessário).
NOTA: Este sistema de aquecimento "sanduíche", composto por uma almofada térmica que circula água e uma lâmpada infravermelha, mantém efetivamente a temperatura central do corpo dentro da faixa estreita de 36,8-37,2 °C. Registre a temperatura corporal central a cada minuto para garantir que ela seja mantida entre 36,8 e 37,2 °C. - Após 30 minutos do período isquêmico, remova a pinça e retorne o rim com um cotonete à cavidade abdominal.
NOTA: Confirme que o rim inteiro está uniformemente pálido antes do desclampeamento. Após remover a pinça, confirme a reperfusão bem-sucedida. Se a reperfusão estiver marcadamente atrasada, como 30 segundos ou mais, isso pode indicar reperfusão incompleta, e a exclusão do animal das análises subsequentes deve ser considerada. A suscetibilidade à IRI renal e a subsequente gravidade da DRC são significativamente influenciadas pela idade, sexo e tensão de fundo. Conduzir um experimento piloto para determinar a duração ótima da isquemia é essencial para cada desenho de estudo. - Feche a camada muscular com pontos absorvíveis 5-0 e depois a pele com clipes de ferida (por exemplo, 9 mm).
NOTA: Remova os clipes de ferida 10 dias após a cirurgia. - Interrompa a anestesia com isoflurano e permita que o camundongo se recupere em uma gaiola limpa. Se o animal já se recuperou da anestesia e não apresentar sinais de sofrimento ou hipotermia, devolva a gaiola à sala de manutenção do animal. Os animais são monitorados quanto a dor ou desconforto após a cirurgia, e doses adicionais de Ethiqa XR são administradas conforme necessário. Os critérios humanos são estabelecidos de acordo com as diretrizes institucionais da IACUC para minimizar o sofrimento animal.
NOTA: O Ethiqa XR fornece analgésia por até 3 dias. Administre uma dose adicional caso os animais apresentem qualquer sinal de dor ou desconforto 72 horas após a dose inicial.
3. Nefrectomia contralateral
- Siga o passo 1, os passos de preparação dos animais.
- Realize uma incisão na pele conforme descrito nos passos 2.1 e 2.2.
- No nível onde o rim direito é visualizado, aproximadamente 1 cm lateral à coluna do lado direito, faça uma incisão muscular longitudinal de 1 a 1,5 cm.
- Enquanto segura o rim com pinças não serrilhadas, dissece de forma direta a gordura perihilar e o tecido conjuntivo para expor o pedículo renal.
- Separe cuidadosamente a glândula adrenal do rim, mantendo a glândula suprarrenal intacta e evitando danos aos seus vasos.
- Ligar o pedicular renal com um clipe ligador (tamanho do clipe: pequeno) e suturas de seda 4-0, depois transectar os vasos do lado renal. Em seguida, corte o ureter e remova o rim.
- Feche a incisão conforme descrito no passo 2.11.
4. Coleta de sangue e tecido renal
- Induza anestesia em camundongos com isoflurano (1,5%-2% em oxigênio, 1-2 L/min) e confirme a profundidade da anestesia por uma pitada no dedo do pé para verificar a perda de reflexos.
- Coloque o rato em posição supina, depois faça uma incisão na linha média e remova o diafragma.
- Exponha cuidadosamente o coração e insira uma agulha 23-G presa a uma seringa de 3 mL no ventrículo esquerdo.
- Colete sangue lentamente (600-1.000 μL).
- Remova a agulha para evitar hemólise e transfira o sangue para o tubo de coleta.
- Retire o rim esquerdo e corte usando um bisturi (lâmina montada em um cabo) conforme os requisitos do estudo.
- Realize a eutanásia removendo o coração sob anestesia (seguindo protocolos institucionalmente aprovados).
- Processe os tecidos seccionados conforme os requisitos do estudo (por exemplo, fixação, congelamento rápido).
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Resultados
A mudança característica na cor renal observada durante a cirurgia confirmou a indução de isquemia renal uniforme, seguida de reperfusão bem-sucedida. A isquemia bem-sucedida é indicada por uma mudança na cor dos rins de preto para roxo escuro, com melhora subsequente após a remoção da pinça vascular, confirmando a reperfusão. Se a isquemia renal não for induzida com sucesso, o rim apresenta apenas uma mudança mínima de cor, e a lesão subsequente pode não ser consistente. Neste estudo, c...
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Discussão
Esse protocolo fornece um modelo reprodutível induzido por IRI renal da transição de AKI para DRC, caracterizado por disfunção renal sustentada e fibrose intersticial progressiva, amplamente consideradas características daDRC 17,18. A obstrução ureteral unilateral (UUO) é um modelo amplamente utilizado de DRC, que induz nefropatia obstrutiva e conduz principalmente à fibrose por meio de obstrução tubular
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Agradecimentos
Esse trabalho foi apoiado pelo NIDDK K01-DK133635; Prêmio UPMC VMI P3HVB; Prêmio da Fundação Samuel e Emma Winters; Subsídio inicial da UPMC CHP RAC; Prêmio dos Financiadores da Fundação UPMC CHP Children's Trust; Programa de Oportunidades da Aliança de Recursos Renais George M. O'Brien (OKRA OPP) (para TC), NIDDK R01-DK121758; DK134346; R25-DK119180 (para SSL), NIDDK R01-DK125015; R01-DK137410 (para JH), e Carolyn e Mark Snyder e a Família Snyder (para JH e SSL). Agradecemos ao Laboratório Central de Histologia da UPMC CHP pela assistência com histologia e imagens escaneadas, e aos Laboratórios de Diagnóstico Veterinário da Kansas State University pelo suporte em química sérica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtro de gás anestésico | A.M. Bickford | F-AIR | |
| Câmara de indução de anestesia, aquecimento | Produtos do Laboratório AIMS | WCS8 | |
| Tubo de coleta de sangue | BD Microtainer | 365967 | |
| Etanol | Laboratórios de Descontaminação | 2701 | |
| Ethiqa XR (buprenorfina de liberação prolongada) | Saúde Animal Fidelis | NDC 86084-100-30 | |
| Pomada para os olhos | AKORN | NDC 17478-062-35 | |
| Compressas de gaze, estéreis | Dynarex | 3353 | |
| Aparador de cabelo para pequenos animais | WAHL | CLP-9868 | |
| Lâmpada de calor, infravermelho | Instrumentos Physitemp | HL-1 | |
| Bomba de calor para circulação de água quente | BrainTree Scientific | HTP-1500 | |
| Sistema de Calor/Anestesia para pequenos animais, Versaflex & nbsp; | BrainTree Scientific | EZ-7150 | |
| Cortinas cirúrgicas que retêm calor | Braintree Scientific | SPDR-MPS | |
| Esterilizador de esferas quentes | Simon Keller | Steri 250 | |
| Solução de isoflurano | Covetrus | 29405 | |
| Aplicador de clipe de ligação | NOSSO | 533140 | |
| Ligaduras | NOSSO | 533837 | |
| Microsonda para temperatura retal | Fisitem | RET-3 | |
| Termômetro Microsonda | Fisitem | BAT-12 | |
| Microscópio, óptico | Leica | DM2500 | |
| Microscópio, scanner deslizante | Leica | Scanner de slides Aperio CS2 | |
| Mouse (FVB/NJ) | Laboratório Jackson | 001800 | |
| Agulha (23G) | BD | 305145 | |
| Povidone iode swabsticks | Dynarex | 1201 | |
| Lâminas de Bisturi | Ferramentas Científicas Finas | 10020-00 | |
| Cabo de Bisturi | Ferramentas Científicas Finas | 10060-13 | |
| Pinças cirúrgicas, não serrilhadas | Instrumento Cirúrgico Roboz | RS-5228 | |
| Pinças cirúrgicas, serrilhadas | Ferramentas Científicas Finas | 11051-10 | |
| Pinça cirúrgica, dentada | Ferramentas Científicas Finas | 11019-12 | |
| Luvas cirúrgicas | CTI | SPGF750 | |
| Tesoura separadora de tecido cirúrgico | Ferramentas Científicas Finas | 14072-10 | |
| Sutura, Ácido Poliglicólico (PGA)/absorvível (5-0) | Dynarex | 9131 | |
| Sutura, seda (4-0) | Oasis | MV-683-V | |
| Seringa (3ml) | BD | 309628 | |
| Cortinas de toalha, estéreis | Dynarex | 4410 | |
| Pinça vascular aplicando pinças | Ferramentas Científicas Finas | 15057-14 | |
| Pinça vascular, não traumática | Ferramentas de Ciência Fina | 18055-03 | |
| Aplicador de clipe de enrolamento | Ferramentas Científicas Finas | 12020-09 | |
| Clipes de ferida | Ferramentas Científicas Finas | 12022-09 |
Referências
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Reimpressões e permissões
