Ensaio MeRIP-qPCR para Detecção de Níveis de Modificação M6Ade RNA Específico em Células de Osteossarcoma

Binghan Yan; Junli Chang; Suxia Guo; Peng Zhao; Fulai Zhao; Chujie Zhou; Junjie Tong; Xinyu Zhang; Yuping Hong; Mengchen Yin; Xingyuan Sun; Yanping Yang

doi:10.3791/69880

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Artigo de método

Ensaio MeRIP-qPCR para Detecção de Níveis de Modificação M^6Ade RNA Específico em Células de Osteossarcoma

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DOI:

10.3791/69880

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30 de dezembro de 2025

Binghan Yan^*¹^,² , Junli Chang^*¹^,² , Suxia Guo¹^,² , Peng Zhao¹^,² , Fulai Zhao¹^,² , Chujie Zhou¹^,² , Junjie Tong¹^,² , Xinyu Zhang¹^,² , Yuping Hong¹^,² , Mengchen Yin¹^,² , Xingyuan Sun¹^,² , Yanping Yang¹^,²

¹Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, ²Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo fornece uma abordagem detalhada para avaliar os níveis de modificação m^6Ade RNA específico usando MeRIP-qPCR.

Resumo

A modificação epitranscriptômica do RNA desempenha um papel crítico na iniciação e desenvolvimento de vários tipos de câncer, entre os quais aN6-metiladenosina (m 6 A) é a modificação mais prevalente e funcionalmente diversa. Aqui, apresentamos um protocolo simplificado e reprodutível usando MeRIP-qPCR para avaliar os níveis de modificação de m^6Ade transcritos específicos em células de osteossarcoma. Neste ensaio, o RNA total foi extraído, seguido por incubação com um anticorpo específico anti-m^6Apara a modificação de RNA imunocapturado da modificação m^6A. Em seguida, o RNA foi fragmentado e o enriquecimento de fragmentos de RNA modificados com m⁶A foi alcançado usando esferas magnéticas de proteína G. O RNA enriquecido foi liberado pela digestão da proteinase K e purificado por esferas que se ligam ao RNA. Por fim, o RNA foi submetido à transcrição reversa e à reação em cadeia quantitativa da polimerase (PCR) para avaliar os níveis de m^6Aem genes candidatos. Os resultados demonstraram que esse método distingue efetivamente diferenças de metilação e fornece uma ferramenta confiável para explorar os mecanismos funcionais da modificação de m^6Aem células osteossarcoma. Em conclusão, o MeRIP-qPCR oferece uma abordagem simples e altamente específica para estudar a modificação de m^6Aem células de osteossarcoma. Esse protocolo possui grande potencial para elucidar redes regulatórias de m^6Ae identificar novos alvos terapêuticos.

Introdução

As pesquisas mais recentes sobre epitranscriptoma revelam que a modificação RNA^{N 6-metiladenosina} (m⁶A), a metilação da posição N⁶na adenosina, é a modificação química intrínseca mais abundante conhecida do mRNA em células^{eucarióticas 1}. m⁶A está envolvida em uma ampla gama de processos biológicos, incluindo estabilidade de mRNA, emendamento, exportação nuclear e eficiência^{de tradução 2}. Importante, evidências acumuladas sugerem que a desregulação da modificação m⁶A contribui para o início e desenvolvimento de vários tipos de câncer, incluindo osteossarcoma, um tumor ósseo maligno altamente agressivo que afeta predominantemente adolescentes e jovens^{adultos 3}.

O estudo da modificação m^6Arequer metodologias robustas e confiáveis. Várias abordagens foram desenvolvidas para detectar níveis de modificação m^6A, incluindo m⁶A dot blot, m⁶A ELISA e MeRIP-seq. O ensaio de blot de ponto m⁶A é simples e econômico, mas sofre de sensibilidade limitada e quantificação ruim. Ele fornece o^{nível de}modificação m 6 A do RNA total, em vez do nível de modificação m⁶A de um^{RNA específico 4}. m⁶A ELISA oferece detecção relativamente conveniente e de alta cadência; No entanto, a reatividade cruzada e a baixa precisão continuam sendo preocupações principais, e também carecem da capacidade de revelar modificações específicas de transcrição^{ou local 5}. O MeRIP-seq permite o mapeamento em todo o transcriptoma de m⁶A; no entanto, seus requisitos para grande entrada de RNA, resolução relativamente baixa e dependência de anticorpos limitam a precisão e reprodutibilidade do^{MeRIP-seq 6}. Em contraste, o MeRIP-qPCR combina imunoprecipitação com PCR quantitativa, proporcionando maior sensibilidade e especificidade para a detecção direcionada de m^6Aem RNA⁷ específico. Esse método permite a detecção sensível e direcionada do enriquecimento diferencial de m6A em genes candidatos, tornando-o particularmente adequado para estudos de validação em pesquisas relacionadas ao câncer relacionado ao m6A. Esse método oferece uma alternativa econômica e acessível para laboratórios que desejam investigar mecanismos regulatórios mediados por m6A.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado (Figura 1) para avaliar os níveis de modificação m⁶A de c-Myc em células de osteossarcoma, usando MeRIP-qPCR como exemplo. MeRIP-qPCR, que se baseia no enriquecimento baseado em anticorpos de fragmentos de RNA metilado, também combinado com transcrição reversa e PCR quantitativa, avalia a presença e abundância relativa de m^6Aem RNA específico. Demonstramos que essa abordagem distinguia efetivamente as diferenças de metilação do c-Myc e forneceu uma plataforma confiável para investigar o papel funcional do^m6Anas células osteossarcoma. Este estudo destaca o potencial do MeRIP-qPCR como uma ferramenta prática e específica para pesquisas sobre modificação do m^6Ano osteossarcoma e prepara o terreno para a identificação de novos alvos terapêuticos.

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Protocolo

1. Preparação do RNA

NOTA: A extração de RNA é realizada usando um kit de extração de RNA. Trabalhe dentro de um armário de biossegurança limpo ao manusear células e reagentes de RNA. Use equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas, óculos de proteção). Pré-resfrie a centrífuga a 4 °C antes de começar.

Prepare as celas.
1. Retire o meio de cultura da panela de 3,5 cm e lave suavemente as células uma vez com PBS pré-resfriado. Adicione um volume apropriado de tampão de lise de RNA diretamente ao recipiente para lisar completamente as células e pipete suavemente para homogeneizar.
2. Transfira a suspensão da célula para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
3. Centrifuge a 1000 × g por 5 minutos a 4 °C.
  NOTA: Certifique-se de que o rotor esteja equilibrado e a tampa fechada de forma segura.
4. Retire cuidadosamente o tubo da microcentrífuga após a centrifugação.
5. Aspire completamente o sobrenadante usando uma pipeta de 1 mL sem perturbar o pellet na parte inferior.
  NOTA: Não toque na célula com a ponta da pipeta.
Células de lisis.
1. Adicione 300 μL de Lisação Buffer ao pellet celular.
2. Misture bem invertendo o tubo 30 vezes até que a solução pareça clara e viscosa, sem grumos visíveis.
3. Incube o tubo em temperatura ambiente por 2 minutos.
RNA precipitado.
1. Adicione 300 μL de etanol 100% ao lisado (volume igual de Lysis Buffer).
2. Pipete suavemente para cima e para baixo imediatamente (cerca de 8-10 vezes) para misturar completamente.
Realize a ligação na coluna de RNA.
1. Coloque uma coluna de purificação de RNA em um tubo de coleta fornecido de 2 mL.
2. Transfira toda a mistura para a coluna de purificação.
  NOTA: Evite tocar na membrana branca no centro.
3. Feche a tampa e a centrífuga a 12.000 × g por 1 minuto.
4. Descarte o líquido inferior e bata suavemente o tubo de coleta de cabeça para baixo sobre papel absorvente para remover o líquido residual.
5. Retorne a coluna de purificação ao tubo de coleta.
Lave as impurezas.
1. Adicione 500 μL de Wash Buffer (água sem nuclease) à coluna de purificação.
  NOTA: Evite tocar na membrana branca no centro.
2. Centrifuge a 12.000 × g por 1 minuto e descarte o líquido mais leve.
3. Centrifuge novamente a 12.000 × g por 1 minuto para remover o líquido residual.
4. Transfira a coluna de purificação para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 mL.
5. Abra a tampa e deixe a coluna descansar por 2 minutos em temperatura ambiente.
RNA eluto.
1. Coloque a coluna de purificação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Adicione 25 μL de Elution Buffer diretamente no centro da membrana.
3. Incube em temperatura ambiente por 5 minutos.
4. Centrifuge a 12.000 × g por 1 minuto para coletar RNA no tubo inferior.
5. Reaplique o eluato à membrana e centrifuge novamente a 12.000 × g por 1 minuto para maximizar o rendimento.
  NOTA: Sempre adicione o tampão de elução diretamente no centro da membrana da coluna. Evite adicioná-lo à parede lateral, pois isso pode impedir a dissolução do RNA e reduzir muito o rendimento. Além disso, não perfure a membrana com a ponta da pipeta.
Meça a concentração de RNA.
1. Enxágue a porta da amostra do espectrofotômetro com 1,5 μL de Elution Buffer.
2. Use 1,5 μL de Elution Buffer como um blank. Confirme que a leitura está próxima de zero.
3. Carregue 1,5 μL de amostra de RNA e meça a concentração.
4. Avalie a qualidade das amostras de RNA usando um espectrofotômetro (A260/A280 = 1,8-2,2, A260/A230 = 2,0-2,5) e eletroforese em gel de agarose.

2. Imunoprecipitação de RNA metilado (MeRIP)

Preparação da mistura de imunocaptura
1. Adquira um novo tubo de PCR de 0,2 mL.
2. Adicione componentes conforme listado na Tabela 1 (exemplo de uma reação).
Imunocaptura
1. Feche bem a tampa do tubo. Coloque o tubo de PCR em um rotador ou agitador rolante.
2. Incube em temperatura ambiente por 90 minutos.
  NOTA: Certifique-se de que a solução seja misturada de forma contínua e suave.
Clivagem de RNA
1. Após a incubação, adicione 10 μL de Potenciador de Digestão Nuclear (EMI) e 2 μL de Mistura de Enzimas de Clivagem (CEM) a cada tubo.
2. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo 5 a 6 vezes.
3. Incube em temperatura ambiente por 4 minutos.
4. Preparação do controle de RNA de entrada
  1. Para garantir consistência entre imunoprecipitação (IP) e amostras de entrada, processe uma porção de RNA em paralelo como controle de entrada.
  2. Transfira 1 μg de RNA total (10% de entrada) de cada amostra para um tubo de PCR separado. Adicione 20 μL de tampão de captura imunológica (ICB), 1,5 μL de EMI, 1 μL de CEM e incube em temperatura ambiente por 2 minutos.
Enriquecimento magnético e lavagem
1. Coloque o tubo de PCR em um suporte magnético.
2. Deixe o tubo descansar por 2 minutos até a solução ficar clara e as esferas ficarem presas na parede do tubo.
3. Aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante sem mexer nas contas.
4. Mantenha o tubo em um suporte magnético e adicione 150 μL de Wash Buffer (WB).
5. Remova o tubo do suporte magnético e incline-o de cabeça para baixo suavemente para resuspender completamente as contas.
6. Volte o tubo ao suporte magnético. Espere 1-2 minutos até a solução desaparecer, depois descarte o sobrenadante.
7. Repita a etapa de lavagem três vezes.
8. Lave as esferas novamente com 150 μL de Tampão de Digestão de Proteínas (PDB) usando o mesmo método.
Liberação e recuperação de RNA enriquecido
1. Prepare a Solução de Digestão de Proteínas misturando a Proteinase K e a PDB em uma proporção de 1:9. (Para cada reação, prepare 20 μL: 2 μL de Proteinase K + 18 μL de PDB).
2. Remova o tubo do suporte magnético após a lavagem final.
3. Adicione 20 μL de Solução Trabalhante de Digestão de Proteínas recém-preparada ao pellet de contas e misture suavemente.
4. Coloque o tubo de PCR em um termificador e incube a 55 °C por 15 minutos.
5. Coloque o tubo de PCR de volta no suporte magnético. Espere até a solução desaparecer (cerca de 2 minutos).
6. Transfira cuidadosamente todo o sobrenadante (cerca de 20 μL) para um novo tubo de PCR de 0,2 mL.
  NOTA: O RNA agora está no sobrenadante. Descarte as contas.
Purificação de RNA
1. Adicione 20 μL de Solução de Purificação de RNA (RPS) a cada tubo de amostra, tubo de controle negativo e tubo de entrada.
2. Adicione 160 μL de 100% etanol.
3. Esferas de ligação de RNA de vórtice para resuspendê-las.
4. Adicione 2 μL de esferas de ligação de RNA ressuspensas a cada tubo.
5. Misture bem para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.
6. Incube em temperatura ambiente por 5 minutos para permitir a ligação do RNA.
7. Coloque o tubo no suporte magnético. Espere até a solução desaparecer (cerca de 2 minutos).
8. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem mexer nas contas.
9. Mantenha o tubo em um suporte magnético e adicione 150 μL de etanol 90% fresco preparado. Incube por 30 segundos.
10. Descarte o etanol 90%. Repita a lavagem com etanol a 90% mais uma vez (duas lavagens no total).
11. Remova o tubo do suporte magnético.
12. Adicione 13 μL de Elution Buffer às contas secas.
13. Incube em temperatura ambiente por 5 minutos para eluir RNA.
14. Coloque o tubo de volta no suporte magnético. Espere até a solução desaparecer (cerca de 2 minutos).
15. Transfira cuidadosamente todo o sobrenadante (cerca de 13 μL) para um novo tubo de PCR livre de RNase.
16. Use imediatamente ou armazene RNA a -20 °C.

3. RT-qPCR

Transcreve reversamente o RNA enriquecido com m⁶em cDNA
1. Use RNA purificado^{do grupo m}6 A-IP, Input ou IgG para transcrição reversa.
2. Configure a reação de transcrição reversa (RT).
  NOTA: Garanta entrada igual de RNA em todos os grupos para permitir uma comparação confiável na análise qPCR a jusante.
Amplificação qPCR
1. Prepare reações qPCR usando a química verde SYBR. Adicione 10 μL de SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 μL de primer direto (10 μM), 0,5 μL de primer reverso (10 μM), 7 μL de_{ddH 2}O e 2 μL de cDNA em cada tubo, misture bem e centrifuge brevemente antes de carregar no instrumento qPCR.
  NOTA: Estabeleça três poços replicados para cada amostra de cDNA (Input, IgG, m⁶A-IP). Consulte a Tabela 2 para a lista de primers.
2. Execute o programa qPCR.
  1. Realize as reações qPCR em um ciclador térmico em tempo real usando o seguinte programa: ajuste a desnaturação inicial a 95 °C por 30 s; execute 40 ciclos consistindo em desnaturação a 95 °C por 15 s, recozimento a 58 °C por 10 s e extensão a 72 °C por 30 s.
  2. Após a amplificação, realiza-se uma análise da curva de fusão ajustando a desnaturação a 95 °C por 15 s, resfriando a 60 °C por 1 minuto e, em seguida, aumentando gradualmente a temperatura até 95 °C a uma taxa de rampa de 0,5 °C/s com aquisição contínua de fluorescência para confirmar a especificidade dos produtos amplificados.
Análise de dados
1. Analise os valores de Ct dos grupos-alvo e controle.
2. Calcule o enriquecimento usando um dos seguintes métodos:
  1. Métodos 1: % Método de entrada
    %Entrada = 2^{[Ct(Entrada)−Ct(IP)]}× DF × 100%
    NOTA: Ct (Entrada) e Ct (IP) representam os valores de limiar do ciclo das amostras de Entrada e IP, respectivamente, e o fator de diluição (DF) é o recíproco da fração de entrada usada para qPCR (por exemplo, se 10% do RNA total foi usado como Entrada, então DF = 10).
  2. Métodos 2: Método Comparativo de Ct (método 2^^-ΔΔCt )
    _Amostra ΔCt =_{Ct IP} −Ct_IgG
    Ct=ΔCt_tratado−_{ΔCt controle}, Fold=2^−ΔΔCt.
    NOTA: Mantenha as quantidades de entrada de RNA, a configuração da reação e a eficiência do primer consistentes em todas as amostras.

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Resultados

Aqui fornecemos um resultado representativo da análise MeRIP-qPCR, o^{nível de}modificação m 6A de c-Myc nas células hFOB1.19 e 143B. Como mostrado na Figura 2, o enriquecimento c-Myc com anticorpo anti-m⁶A foi significativamente maior em comparação ao controle de IgG, que mostrou apenas níveis de fundo, sugerindo que o anticorpo anti-m⁶A é tanto eficaz quanto específico. Também observamos que o nível de modificação de^m6A

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Discussão

O MeRIP-qPCR surgiu como uma ferramenta valiosa para estudar modificações de RNA m^6Acom amplas aplicações. É particularmente útil para validar resultados de sequenciamento de alta produtividade e localizar locais de modificação precisamente dentro de regiões específicas dos genes-alvo durante estudos mecanicísticos. Além disso, esse método pode ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios de biologia molecular devido ao seu custo relativamente baixo e simplicidade o...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado por bolsas da National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 e 82205145).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
100% etanol	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd., América	1158566
143B	ATCC, América	ATCC CRL-8303TM
2 vezes; SYBR Mistura verde qPCR	Beijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., China	FS-Q1002
Denovix DS-11	Denovix	DS-11	Espectrofotômetro
Meio DMEM	WISENT CORPORATION, China	319-005-CL
DMEM/F-12 médio	Gibco, América	11320033
EpiQuik CUT& Kit de Enriquecimento de RNA RUN m6A (MeRIP)	Epigentek, América	P-9018-24
Soro Fetal Bovino	WISENT CORPORATION, China	086-150
hFOB1.19	Banco de Células da Academia Chinesa de Ciências, China	GNHu14
Kit de Ensaio de Metilação de RNA m⁶A	Abcam, Inglaterra	ab185912
Kit de Transcrição Reversa de MicroRNA	EZBioscience-EZB, América	A0010CGQ
Sistema em Tempo Real	BIO-RAD, América	CFX96
Kit Total de Extração de RNA	EZBioscience-EZB, América	B0004DP
Enzima TrypLE Express	Gibco, América	12604021

Referências

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