Artigo de método

Método Padronizado para Detectar Nanotubos de Tunelamento em Células de Pele Humana para Aplicações de Engenharia de Tecidos

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DOI:

10.3791/69883

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13 de janeiro de 2026

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1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

Neste artigo

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo padronizado para visualizar nanotubos de tunelamento entre queratinócitos epidérmicos humanos e fibroblastos dérmicos usando marcação por membrana e F-actina com imagem confocal z-stack, com co-coloração opcional α-tubulina, permitindo detecção reprodutível e caracterização do citoesqueleto para aplicações de engenharia de tecidos.

Resumo

Nanotubos tunelantes (TNTs) são condutos intercelulares finos à base de actina que permitem a transferência de organelos e cargas sinalizadoras a longo alcance. Embora amplamente relatadas em múltiplos tipos celulares, sua presença em células da pele humana não foi bem descrita. Este artigo descreve um protocolo padronizado para detectar e caracterizar TNTs in vitro entre queratinócitos epidérmicos humanos e fibroblastos dérmicos. O método envolve preparação de uma co-cultura de células primárias, fixação suave para preservar TNTs frágeis, marcação por membrana com aglutinina germinativa de trigo, coloração com F-actina com falloidina e imagem sistemática de pilha z por microscopia confocal invertida para distinguir TNTs suspensos acima do substrato dos filópódios aderentes. A imunocoloração opcional para α-tubulina permite a avaliação da incorporação de microtúbulos. Os TNTs são definidos por três características: protrusões finas e retas conectando duas ou mais células, presença de F-actina e continuidade entre pares celulares em seções ópticas seriais. Resultados representativos demonstram TNTs ligando pares dermal-dérmicos, epidérmico-epidérmicos e dérmico-epidérmicos, com composição do citoesqueleto variável (F-actina sozinha ou F-actina mais α-tubulina). Passos críticos incluem fixação suave, uso de reagentes frescos e aquisição de planos z suficientes para evitar classificação errada, enquanto artefatos comuns incluem quebra de TNT e coloração incompleta. Juntos, esses passos otimizados possibilitam a detecção reprodutível de TNT em sistemas de células da pele e oferecem uma base metodológica para futuras investigações da comunicação mediada por TNT na biologia e regeneração da pele.

Introdução

Nanotubos tunelantes (TNTs) são canais em escala nanométrica, à base de actina, que permitem a transferência intercelular direta de organelas e moléculas sinalizadoras. Normalmente medem de 6 a 100 μm de comprimento e 50 a 500 nm de diâmetro, com alguns chegando a até 700 nm deespessura 1. Ao contrário das protuberâncias de membrana vazia, os TNTs contêm filamentos do citoesqueleto, mais comumente F-actina, que proporciona rigidez estrutural e suporta o transporte mitocondrial 2,3,4. Em culturas bidimensionais, os TNTs são definidos por três características: saliências finas (20-700 nm), suspensas acima do substrato que conectam duas ou mais células; a presença de filamentos de F-actina; e a capacidade de transferir carga.

Desde sua primeira identificação em células PC-12 por Rustom et al.5, os TNTs têm sido estudados em múltiplos sistemas, incluindo o cardiovascular6, imune7 erespiratório 8, epitélio corneano9, tumores10 e sistemanervoso 11,12. Eles contribuem para processos fisiológicos e patológicos como sinalização imune, apoptose, transporte de material e angiogênese 13,14,15. Os TNTs podem mediar a transferência de longa distância de cargas diversas, incluindo mitocôndrias, retículo endoplasmático, ácidos nucleicos, íons e até vírus 5,16,17.

A pele é um órgão estruturalmente complexo, com a epiderme e a derme dependentes de comunicação constante para homeostase, cicatrização de feridas e regeneração dos apêndices 18,19,20. Embora TNTs tenham sido descritos em muitos tecidos, incluindo o sistema imunológico, o sistema neuronal e o epitéliocorneano 7,9,12, sua presença em células da pele humana não foi relatada na literatura publicada. Com base no arcabouço metodológico descrito por Sáenz-de-Santa-María et al.21, apresentamos um protocolo padronizado e otimizado para detectar TNTs entre queratinócitos epidérmicos e fibroblastosdérmicos 22, utilizando coloração por imunofluorescência combinada com microscopia confocal invertida.

Comparado a abordagens alternativas de detecção de TNT, esse protocolo oferece um equilíbrio prático entre sensibilidade e acessibilidade. A imagem de células vivas pode capturar a dinâmica do TNT, mas é limitada pela fototoxicidade e pela natureza de curta duração dosTNTs 1,23. A microscopia eletrônica fornece detalhes ultraestruturais, mas frequentemente não preserva longos intervalos de TNT e não é prática para análise rotineira de células primárias da pele24,25. Sistemas de nanotubos baseados em repórteres permitem rastreamento em tempo real, mas exigem manipulação genética, que normalmente é ineficiente em queratinócitos primários efibroblastos 24,26. Em contraste, o protocolo atual utiliza imunofluorescência padrão e microscopia confocal, permitindo a detecção reprodutível de TNT em culturas celulares de pele preparadas independentemente, mantendo a compatibilidade com células primárias frágeis.

Esse método é particularmente adequado para análise de amostras fixas, onde a composição citoesquelética e a prevalência de TNT são de interesse. Como os TNTs são altamente frágeis, as etapas de fixação e manuseio continuam sendo limitações chave, e a abordagem não pode capturar dinâmicas de TNT em tempo real. No entanto, para laboratórios que trabalham com células primárias da pele humana, esse fluxo de trabalho padronizado oferece uma forma acessível e consistente de visualizar TNTs e apoia estudos posteriores de suas funções potenciais em engenharia e regeneração de tecidos.

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Protocolo

Todas as células da pele usadas neste estudo eram células primárias previamente congeladas, isoladas de tecidos humanos obtidas como amostras descartadas do prepúcio em procedimentos de circuncisão, e foram totalmentedesidentificadas 22. A aquisição de amostras de pele humana foi realizada no Departamento de Urologia do Hospital Popular Afiliado à Universidade de Ningbo, e o protocolo do estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional (Protocolo nº 2024104; data de aprovação: 30 de outubro de 2024).

1. Identificação de TNTs em queratinócitos epidérmicos e fibroblastos dérmicos primários da pele humana

  1. Preparação da solução
    1. Prepare a solução fixativa 1 (200 μL) adicionando 4% de PFA (100 μL), glutaraldeído 2,5% (4 μL), 1 M HEPES (40 μL) e 1x PBS (56 μL). Prepare fresco e pré-aqueça a 37 °C antes do uso.
    2. Prepare a solução fixativa 2 (200 μL) adicionando 8% de PFA (100 μL), 1 M HEPES (0,4 μL), 1x PBS (99,6 μL). Prepare fresco e pré-aqueça a 37 °C antes do uso.
    3. Prepare a solução fixativa 3 (200 μL) adicionando 8% de PFA (100 μL), 2,5% de glutaraldeído (4 μL) e 1x PBS (96 μL). Prepare fresco e pré-aqueça a 37 °C antes do uso.
  2. Cultura celular
    1. Descongelar e cultivar queratinócitos epidérmicos humanos e fibroblastos dérmicos em recipientes de 60 mm usando o meio de crescimento apropriado. Suplemente culturas de queratinócitos com Y-27632 em concentração final de 5 μM durante a ressuscitação. Mantenha as culturas a 37 °C em uma incubadora umidificada até que as células atinjam ~80% de confluência.
    2. Remova o meio e lave brevemente as células com 1 mL de PBS 1x (usado para manter o pH fisiológico e a osmolaridade durante a lavagem). Aspire o PBS.
    3. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA 0,05%, distribua uniformemente e incube a 37 °C por 1,5 a 2,5 minutos.
    4. Resuspenda suavemente as células pipetando. Adicione 2 mL de meio de crescimento, transfira para um tubo de 15 mL e centrifuge a 200 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
    5. Descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet em 1-2 mL de médio. Conte as células usando um contador automático.
    6. Seme 12.000 fibroblastos dérmicos ou 20.000 queratinócitos em cada poço de uma lâmina de câmara de 8 poços em um volume final de 400 μL. Após a semeadura, agite bem a câmara para distribuir as células de forma uniforme. Incubar por ~24 horas a 37 °C.
    7. Após aproximadamente 24 horas de incubação, observe a confluência celular sob um microscópio. Se chegar a ~80%, prossiga para as etapas seguintes de fixação.
  3. Fixação
    1. Quando as culturas atingirem ~80% de confluência, adicione suavemente várias gotas da Solução Fixativa 1 diretamente ao poço da câmara para pré-fixar as células. Incube por 4 minutos em temperatura ambiente. Garanta que o fixador se espalhe uniformemente, sem perturbar as células.
      ATENÇÃO: Manuseie com cuidado para evitar a interrupção dos TNTs. Como as soluções fixadoras contêm componentes tóxicos como PFA e glutaraldeído, sempre use luvas de proteção, roupas de proteção e máscara, e manusee-as em uma exaustora exaustiva. Certifique-se de lavar as mãos cuidadosamente depois. Colete resíduos fixadores de PFA e glutaraldeído separadamente em recipientes rotulados para descarte de produtos químicos perigosos.
    2. Aspire o pré-fixador e substitua-o por 140 μL de Solução Fixativa 1 fresca, garantindo que todo o poço esteja coberto. Incube por 15 minutos a 37 °C.
    3. Remova a Solução Fixativa 1 e adicione 140 μL da Solução Fixativa 2. Incube por 15 minutos a 37 °C. Certifique-se de que a solução cubra totalmente as células para manter a fixação uniforme.
    4. Remova o fixador e depois adicione 140 μL de 100 mM de NH₄Cl para temperar os aldeídos residuais. Incube por 10-30 minutos em temperatura ambiente.
    5. Enxágue as amostras 3 vezes com 1x PBS por 30 s cada em temperatura ambiente, pipetando suavemente ao longo da parede da câmara para evitar lavar as células ou quebrar TNTs.
  4. Coloração de membrana e citoesqueleto
    1. Incube células com 140 μL de conjugado WGA (Aglutinina de Germe de Trigo)-Alexa Fluor, que marca glicoproteínas de membrana plasmática para visualização de TNTs derivados da membrana, em 1x PBS por 20 minutos no escuro em temperatura ambiente.
      NOTA: Os passos seguintes precisam ser realizados em um ambiente escuro.
    2. Lave 3x com 1x PBS (30 s cada). Incube com 140 μL de conjugado de faloidina diluído 1:250 (v/v) em 1% de BSA por 30 minutos no escuro em temperatura ambiente.
    3. Lave 3x com 1x PBS (30 s cada). Incube com 140 μL de solução DAPI por 5 minutos em temperatura ambiente, no escuro.
    4. Lave 3x com 1× PBS. Adicione 2-3 gotas de substrato de montagem, incube por 20 minutos em temperatura ambiente e armazene pelo menos 20 minutos a 4 °C no escuro até a imagem.
  5. Imagem
    1. Adquira imagens usando um microscópio confocal invertido com objetiva 40x. Selecione campos aleatórios e colete Z-stacks (10-20 camadas) do início para o final das células. Os parâmetros específicos do microscópio usados para aquisição de imagens estão listados abaixo:
      Microscópio de varredura a laser confocal: ZEISS LSM 900
      Linhas laser: Trilha 1 (561 nm, 4,0%), Trilha 2 (488 nm, 16,0%), Trilha 3 (405 nm, 60,0%)
      Ganho do detector: 525 V
      Tamanho do passo Z: 20 seções ópticas (profundidade total: 5,32 μm)

2. Co-cultura de células epidérmicas e dérmicas

  1. Prepare queratinócitos e fibroblastos conforme nos passos 1.2.1-1.2.5.
  2. Seme 10.000 queratinócitos e 6.000 fibroblastos por poço de câmara em 400 μL de meio. Após a semeadura, agite bem a câmara para distribuir as células de forma uniforme. Incube por 24 horas a 37 °C.
  3. Após aproximadamente 24 horas de incubação, observe a confluência celular sob um microscópio. Se chegar a ~80%, prossiga para as etapas seguintes de fixação.
  4. Fixe e tinga as membranas conforme descrito nos passos 1.3-1.4.
  5. Permeabilize as células com 0,1% de Triton X-100, para permitir o acesso de anticorpos a alvos intracelulares, por 3 minutos em temperatura ambiente, depois lave 3 vezes com 1x PBS.
    NOTA: O Triton X-100 0,1% deve ser preparado fresco antes do uso.
    ATENÇÃO: O Triton X-100, prejudicial à vida aquática, também deve ser descartado como lixo químico e nunca despejado pelo ralo.
  6. Bloqueie com 140 μL de 2% de BSA em PBS para reduzir a ligação de anticorpos inespecíficos por 20 minutos em temperatura ambiente.
    NOTA: 2% de BSA deve ser preparado fresco antes do uso.
  7. Incube durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-citoqueratina 5 diluído 1:200 (v/v) em 2% de BSA.
  8. Lave 3 vezes com 1 PBS e depois incube com anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 594 por 1-2 horas em temperatura ambiente no escuro.
  9. Lave 3x com 1× PBS. Colorar núcleos com DAPI e imagem como nos passos 1.4.5-1.5.2.

3. Identificação dos componentes do citoesqueleto dos TNTs

  1. Cultura celular
    1. Cultive e fixe as células conforme nos passos 1.2-1.3. Permeabilize com 0,1% de Triton X-100 por 3 minutos em temperatura ambiente, depois lave com 1x PBS.
    2. Bloqueio com 2% de BSA por 20 minutos em temperatura ambiente. Incube durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-α-tubulina.
    3. Lave 3 vezes com 1 PBS e incube com anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor por 1-2 horas em temperatura ambiente, no escuro.
      NOTA: Os passos seguintes precisam ser realizados em um ambiente escuro.
    4. Lave 3x com 1x PBS. Rotule F-actina com faloidina e imagem como nos passos 1.4.3-1.5
  2. Co-cultivo de células
    1. Prepare co-culturas como nos passos 2.1-2.2. Corriga com solução fixadora 3 por 15 minutos em temperatura ambiente.
    2. Substitua por 140 μL de 100 mM de NH4Cl e incube por 10-30 minutos em temperatura ambiente. Lave 3x com 1x PBS.
    3. Primeiro, identifique as células epidérmicas realizando permeabilização, bloqueio e imunocoloração CK5 exatamente conforme descrito nos passos 2.4-2.8.
    4. Em seguida, realize a imunocoloração α-tubulina seguindo os passos 3.1.2-3.1.4.
    5. Por fim, tinga F-actina com faloidina e prossiga com a imagem conforme descrito nos passos 1.4.2-1.5.2.

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Resultados

Usando esse protocolo padronizado, nanotubos de tunelamento (TNTs) foram identificados com sucesso em células da pele humana sob condições de cultura única e co-cultura. Para validar a especificidade de anticorpos, tanto a coloração de controle positivo quanto negativo foram realizadas para todos os anticorpos antes das análises experimentais, conforme mostrado na Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 2, Figura Suplementar 3 e Figura Suplementar 4. Im...

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Discussão

Uma etapa crítica nesse protocolo é a preservação dos TNTs durante a fixação e coloração, pois essas estruturas são extremamente frágeis e facilmente perturbáveis. Manuseio suave durante a fixação, o momento adequado e o uso de fixadores frescos são essenciais para manter a integridade do TNT. O uso da imagem confocal Z-stack é igualmente importante para distinguir TNTs suspensos acima do substrato de filópódios ou outras protuberâncias aderentes, o que pode levar a interpretações equivo...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a declarar.

Agradecimentos

Este projeto foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Bolsa nº 82273554). Os autores reconhecem o Laboratório de Engenharia de Biomateriais e Regeneração de Tecidos do Hospital de Estomatologia de Ningbo pelo apoio contínuo e agradecem tanto aos membros atuais quanto antigos da equipe por suas valiosas discussões. Os autores também agradecem ao Professor Feng Li, do Centro de Pesquisa e Experimentos da Faculdade de Medicina de Hangzhou, pela generosa assistência e forte apoio na facilitação do acesso ao microscópio confocal.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de 15 mLKIRGENKG2611Livre de RNase/Dnase e estéril, RNase/Dnase
37 & deg; Incubadora CTermo Científica51032877A incubadora de CO2 de 37 graus proporciona um ambiente ideal in vitro.
Rastreador de Actina-Vermelho-RodaminaBeyotimeC2207sA sonda Red-Rhodamine Actin-Tracker é uma faloidina marcada com o corante fluorescente Rodamina, com comprimento de onda máximo de excitação de 540nm e comprimento de onda máximo de emissão de 565nm.
Alexa Conjugado Fluor da aglutinina germinativa do trigo (WGA)Sondas MolecularesW11261  Alexa Fluor 488 Conjugado
Anticorpo anti-alfa tubulinaAbcamab7291Anticorpo anti-alfa Tubulina - Controle de Carga (ab7291) é um anticorpo monoclonal de camundongos que detecta a alfa Tubulina. Adequado para Humano, Rato, Rato.
Anticorpo anti-citoceratina 5  Abcamab52635Anticorpo Anti-Citoqueratina 5 - Marcador do Citoesqueleto (ab52635) é um anticorpo monoclonal de coelho que detecta a Citoqueratina 5. Adequado para Humano, Rato, Rato.
Aqua-Poly/MountPoliciências18606Meio de montagem solúvel em água, não fluorescente, formulado para montar seções a partir de soluções aquosas. Útil para técnicas imunofluorescentes, pois realça e mantém manchas fluorescentes.
Contador automático de célulasCountstarIC1000Contador automático de células para contagem rápida e precisa de células
Centrífuga de bancadaBIORIDGETD5Centrífuga de bancada para separação rápida e eficiente das amostras em ambientes laboratoriais
Gabinete de segurança biológicaTermo Científica1379O Armário de Segurança Biológica é um dispositivo de contenção estéril que protege operadores, amostras e ambientes contra riscos biológicos, filtrando patógenos transportados pelo ar e prevenindo contaminação cruzada durante trabalhos microbiológicos.
Albumina sérica bovina (BSA)YOBIBIOU5010-10gA BSA é uma globulina no soro bovino contendo 583 resíduos de aminoácidos com peso molecular de 66,430 kDa e ponto isoelétrico de 4,7
Prato de Cultura Celular (60X15 mm)eppendorf30701119Tratamento com cultura de tecidos Estéril, livre de pirogens detectáveis, RNase e DNase, DNA.
Câmara Cellvis Slide-8CellvisC8-1.5H-NProjetado para imagens de alta resolução, como microscopia confocal.
Solução de coloração DAPIBeyotimeC1006-10 mLA Solução de Coloração DAPI é adequada para coloração nuclear de todas as células e tecidos comuns.
IgG H e IgG Anti-Rato de Cabra L (Alexa Fluor 405) Abcamab175660IgG H e IgG Anti-Rato de Cabra L (Alexa Fluor 405) é um anticorpo secundário com comprimento de onda máximo de absorção de 401nm e comprimento de onda máximo de emissão de 421nm.
IgG Anti-Coelho de Cabras e IG L conjugado à Alexa Fluor 405Abcamab175652IgG Anti-Coelho de Cabras e IG L (Alexa Fluor 405) é um anticorpo secundário com comprimento de onda máximo de absorção de 401nm e comprimento de onda máximo de emissão de 421nm.
IgG Anti-Coelho de Cabras e IG L conjugado à Alexa Fluor 594AbcamAB150080IgG H e IgG anti-coelho de cabras L (Alexa Fluor 594) é um anticorpo secundário com comprimento de onda máximo de absorção de 590nm e comprimento de onda máximo de emissão de 617nm.
Microscópio de fluorescência confocal invertidaLeicaTCS SP8 XO microscópio confocal de varredura a laser Leica SP8 X oferece imagens de alta resolução incomparáveis com avançadas capacidades de detecção de fluorescência e análise de células vivas.
Microscópio de fluorescência confocal invertidaAndorBC43O Andor BC43 é um microscópio confocal compacto e de alta velocidade que oferece imagens 10 vezes mais rápidas do que sistemas tradicionais, com capacidade de imagem 2D/3D em um clique
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 Cloreto de amônio como composto polar para regular o pH.
Conjugados de Faloidinas Oregon GreenTM488Tecnologias de VidaO7466Cor: Verde. Faixa de comprimento de onda de excitação: 496/520.
Soro Tamponado com Fosfato (PBS)Viva Cell BiosciencesC3582-0500Sua função é manter o pH do meio dentro da faixa fisiológica e preservar o equilíbrio de pressão osmótica dentro e fora da célula.
Triton-X 100SolarbioT8200-100mlÉ um surfactante não iônico versátil usado para restaurar componentes de membrana sob condições leves de desnaturalização.
Solução de Tripsina-EDTAGIBCO25300054Devido à sua força digestiva, a tripsina é amplamente utilizada para dissociação celular, passagem rotineira de culturas celulares e dissociação primária de tecidos.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 é um inibidor atp-competitivo de ROCK-I e ROCK-II ativamente por via oral

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