Efeitos terapêuticos dos grânulos antiespasmódicos Gualou Guizhi sobre espasticidade e panoptose em um modelo de rato de lesão da medula espinhal

Resumo

Este estudo avalia os efeitos dos Grânulos Antiespasmódicos Gualou Guizhi (GLGZ) na espasticidade induzida por lesão medular (LME) utilizando métodos comportamentais, biomecânicos, de imagem e histológicos, e explora mecanismos relacionados à PANoptose.

Resumo

A espasticidade muscular após lesão medular (LME) impacta severamente a qualidade de vida, com tratamentos eficazes limitados. Os Grânulos Antiespasmódicos Gualou Guizhi (GLGZ), uma formulação de medicina tradicional chinesa (MTC) desenvolvida em hospitais, podem aliviar espasmos. Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia do GLGZ na espasticidade induzida por LME e sua associação com a PANoptose (uma nova morte celular programada envolvendo apoptose, necroptose e piroptose).

Foram usados ratos machos de Sprague-Dawley, pesando entre 180 e 200 g. A LME foi induzida pelo método Allen de queda de peso. Os ratos-modelo bem-sucedidos foram aleatoriamente designados para um grupo-modelo ou um dos grupos de dose GLGZ: alta, média ou baixa. Ratos simulados passaram por laminectomia sem lesão medular. As intervenções duraram 4 semanas. Após a intervenção, a função motora dos membros foi avaliada usando a escala de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB). A rigidez dos músculos femures foi avaliada por elastografia por onda de cisalhamento por ultrassom (SWE), enquanto a integridade da medula espinhal foi determinada por ressonância magnética (RM). Foram realizadas colorações rápidas de azul por hematoxilina, Nissl e Luxol para observar alterações histopatológicas. A coloração imunofluorescência multiplex foi usada para marcar a proteína semelhante a partículas associada à apoptose, contendo uma CARD (ASC, verde), Caspase-8 (laranja) e serina/treonina-proteína quinase 3 (RIPK3, amarela) interagindo com receptores, para avaliar a PANoptose.

O GLGZ melhorou os escores BBB dependendo da dose: sham (21,00 ± 0,00), modelo (5,8 ± 1,1), dose alta (10,6 ± 1,3), dose média (8,5 ± 1,2), baixa dose (7,1 ± 1,0). A SWE mostrou redução da rigidez muscular: modelo (6,68 ± 0,74 m/s), dose alta (2,19 ± 0,36 m/s, P < 0,001), dose média (3,04 ± 0,45 m/s, P = 0,002), dose baixa (4,08 ± 0,65 m/s, P = 0,031) em relação ao modelo. Em comparação com o grupo-modelo (3,65 ± 1,03 mm²), o GLGZ reduziu dependente da dose o tamanho da lesão da medula espinhal em todos os grupos de dosagem (todos P < 0,05), (1,33 ± 0,79 mm² em doses altas, 1,94 ± 0,67 mm² em dose média, 2,50 ± 0,79 mm² no grupo de baixa dose. A histologia revelou que o GLGZ preservava os neurônios e promovia a reparação da mielina. GLGZ reduziu a expressão ASC, Caspase-8 e RIPK3 de forma dependente da dose.

Introdução

O espasmo muscular é uma complicação comum da lesão medular (LME), impactando severamente a qualidade de vida dos pacientes. Seu processo patológico inclui lesão mecânica inicial, inflamação secundária, estresse oxidativo, apoptose e deterioração da regeneração nervosa, entre^{outros 1,2}. Os tratamentos atuais (descompressão cirúrgica, farmacoterapia, reabilitação) têm eficácia limitada, com medicamentos a longo prazo causando efeitos colaterais como resistência^{a medicamentos 3}. Portanto, explorar novos mecanismos e tratamentos é fundamental.

Estudos recentes identificaram a Panoptose, uma morte celular programada que integra apoptose (dependente de caspase), necroptose (dependente de RIPK3/MLKL) e piroptose (dependente de caspase-8/GSDMD)⁴ como um mecanismo patológico chave de lesão secundária na LME. A ativação anormal de (ASC, caspase-8 e RIPK3) induz perda de neurônios e formação de cicatrizes gliais, agravando a^{espasticidade 5}. O direcionamento para a PANoptose surgiu, portanto, como uma estratégia promissora para interromper a cascata de lesões secundárias^{da LME 4}.

A medicina tradicional chinesa (MTC) ganhou atenção para doenças neurológicas devido aos efeitos multi-alvo (por exemplo, anti-inflamatório, estresse antioxidante⁾⁶. Grânulos antiespasmódicos Gualou Guizhi (GLGZ) são derivados da Sinopse da Câmara Dourada de Zhang Zhongjing e otimizados como preparação^{hospitalar 7}. Seus componentes incluem Trichosanthes kirilowii (Tianhuafen), Cinnamomum cassia (Guizhi), Paeonia lactiflora (Baishao), Glycyrrhiza uralensis (Gancao), jujuba e^{gengibre 8}. Estudos preliminares mostraram que o GLGZ alivia espasmos após lesão do sistema nervoso central ao regular neurotransmissores e inibir a^{inflamação 9}. No entanto, seus efeitos sobre a espasticidade induzida por LME e a possível associação com a PANoptose permanecem não esclarecidos.

Diferente dos medicamentos convencionais de alvo único, a natureza multicomponente do GLGZ está alinhada com a complexa rede patológica da LME — abordando simultaneamente inflamação, perda neuronal, danos à mielina e, potencialmente, panoptose. Este estudo hipotetiza que o GLGZ ameniza a espasticidade muscular em ratos LME ao promover a reparação patológica da medula espinhal (reduzindo inflamação, preservando neurônios, reparando mielina) e inibindo a PANoptose. Ao verificar essa hipótese, buscamos fornecer evidências experimentais para o GLGZ como uma terapia promissora que integra alívio dos sintomas e reparo patológico central da LME.

Protocolo

Modelagem animal
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Fujian (Aprovação nº FJPSPH-IAEC2024114) e conduzidas em conformidade com as diretrizes de bem-estar animal. Ratos machos de Sprague-Dawley pesando entre 180 e 200 g foram alojados sob condições controladas a 22-26°C e umidade de 40-70%. A LME foi induzida pelo método Allen de queda^{de peso 10}: anestesia por inalação de isoflurano 3-4%, incisão na linha média em T10, exposição dos segmentos T9-T11, laminectomia (dura-máter intacta) e impacto (ponta de 2 mm, velocidade de 0,5 m/s, profundidade de 1,3 mm, duração de 1 s). Ratos falsos passaram por laminectomia sem impacto. Critérios de inclusão: Pontuação BBB < 8 às 24 horas após a cirurgia; Critérios de exclusão: infecção, transeção da medula espinhal. Cuidados pós-operatórios: analgesia (buprenorfina, 0,1 mg/kg de c., a cada 12h por 3 dias), expressão da bexiga (a cada 6h por 1 semana) e cuidados estériles da ferida. Os ratos-modelo bem-sucedidos foram aleatoriamente designados para um grupo-modelo, e grupos de GLGZ de alto (2,32 g/kg, n = 10), médio (1,16 g/kg, n = 10), de baixa dose (0,58 g/kg, n = 10).

Análise da função motora
A pontuação de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB) foi feita às cegas. Os ratos foram observados em campo aberto por 5 minutos, avaliando o movimento das articulações dos membros posteriores, sustentação de peso, marcha e coordenação.

Elastografia por onda de cisalhamento para medir rigidez do reto femoral
Foi utilizado um sistema de ultrassom Doppler com uma sonda de matriz linear (18L6). Ratos eram colocados em reclinação lateral (músculo relaxado). A SWE foi realizada com a sonda posicionada em um ângulo de 90° em relação ao músculo, a uma profundidade de 1-2 cm. A região de interesse (ROI) foi definida para 0,5 × 0,5 cm, e dez quadros foram adquiridos por medição. O valor final de rigidez representou a média de três medições válidas. a velocidade de onda de cisalhamento (SWV) foi registrada; O controle de qualidade verde indicou imagens^{válidas 11}.

Exame de ressonância magnética
A ressonância magnética foi realizada usando um scanner 7.0T com sequência de gordura supressa ponderada T2 e uma bobina animalespecífica para animais. Os parâmetros de aquisição foram os seguintes: tempo de repetição (TR) 3.800 ms, tempo de eco (TE) 72 ms, espessura do corte 1 mm, tamanho do voxel 0,1 × 0,1 × 1 mm, matriz 256 × 256, campo de visão (FOV) 25,6 × 25,6 mm, médias de quatro sinais e controle respiratório. A área da lesão foi medida com software de processamento de imagem.

Coloração histológica
A coloração com HE foi realizada por meio de deparafinização sequencial, reidratação, coloração por hematoxilina por 5 minutos, enxágue em água corrente, diferenciação em ácido clorídrico-etanol a 1% por 30 segundos, coloração com eosina por 2 minutos, desidratação, limpeza e montagem. Como ponto de verificação visual, seções coloridas mostraram núcleos azuis e citoplasma vermelho.

A coloração com Nissl foi realizada por desparafinização, reidratação, incubação em azul de toluidina a 0,1% a 50-60 °C por 30 minutos, seguida de enxaguamento com água destilada, diferenciação de etanol, desidratação, limpeza e montagem. Como ponto de verificação visual, corpos de Nissl azul-escuro foram claramente observados no grupo simulado.

A coloração rápida de Luxol azul com violeta cresil foi realizada por desparafinização, reidratação, incubação em azul rápido Luxol a 60 °C por 2 horas, enxaguamento com etanol 95%, diferenciação em carbonato de lítio por 30 segundos, seguida por diferenciação de etanol com 70%, contracoloração com violeta cresil por 10 minutos, desidratação, limpeza e montagem. A concentração ativa de violeta cresil foi de 0,1%. Como ponto de verificação visual, foi observada mielina azul-escura no grupo simulado.

A coloração multiplex por imunofluorescência foi realizada começando com desparafinização, reidratação e coleta de antígenos usando tampão de citrato (pH 6,0) a 95 °C por 20 minutos. As seções foram tratadas com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos, seguidas de bloqueio com 5% de BSA a 37 °C por 1 hora. Os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 °C (ASC: 1:500; Caspase-8: 1:400; RIPK3: 1:500). Após lavagem com PBS-T (0,1% pré-adolescente-20, 3 x 5 min), as seções foram incubadas com anticorpos secundários marcados com HRP (1:1000) a 37 °C por 1 hora. A marcação com fluorocromo foi então aplicada: YTR520 Plus para ASC, TYR570 Plus para Caspase8 e TYR690 Plus para RIPK3 (30 min), seguida por coloração nuclear DAPI por 5 min. As lâminas foram montadas e a imagem foi realizada usando um microscópio de fluorescência com exposição de 500 ms, ganho 1,0, ampliação ×200, com conjuntos de filtros correspondentes aos fluorocromos.

Para xileno e etanol, todas as operações eram realizadas em uma exaustão de fumaça, e luvas e óculos eram usados durante o uso. Para reagentes de coloração, o contato direto com a pele era estritamente evitado. Todos os reagentes de resíduos foram descartados em recipientes designados para resíduos perigosos. Para materiais de risco biológico, uma esterilização completa por autoclave foi realizada antes do descarte final para evitar possível contaminação biológica.

Análise estatística
ANOVA unidirecional com teste pós-hoc de LSD foi usada para comparações de grupos. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Placar BBB
A pontuação BBB do grupo falso foi 21,00 ± 0,00, significativamente maior que a do modelo (5,8 ± 1,1, P < 0,001). Escores BBB aumentados dependente da dose do GLGZ: dose alta (10,6 ± 1,3, P < 0,001), dose média (8,5 ± 1,2, P = 0,003), dose baixa (7,1 ± 1,0, P = 0,028) vs modelo (Figura 1).

Análise de elastografia por onda de cisalhamento da rigidez do reto femoral
A elastografia p...

Discussão

Este estudo avaliou sistematicamente os efeitos atenuativos do GLGZ na espasticidade muscular em ratos com LME e explorou sua relação com neuroproteção e PANoptose. Os resultados indicaram que o GLGZ poderia melhorar as pontuações BBB e reduzir a rigidez muscular em ratos com LM de forma dependente da dose. O estudo também constatou que o mecanismo de ação do GLGZ pode estar relacionado à neuroproteção, reparo da mielina e inibição da panoptose. Atualmente, tratamentos farmacológicos clí...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Etanol anidro	240403A1		Desidratação
Etanol anidro	241101A1		Coloração
Agente de revestimento atenuado por antifluorescência (contendo DAPI) e nbsp;	MA0221		Coloração por Imunofluorescência
Anticorpo ASC	Bs-6741R		Análise de PANoptose (1:300)
Anticorpo Caspase-8	13423-1-AP		Análise de PANoptose (1:400)
Microscópio de fluorescência	NIKON		ECLIPSECi-L
Scanner digital de lâminas de vidro totalmente automático	GCell-60		Scanner de slides
kit de hematoxilina-eosina	R23718		Coloração por Hematoxilina-Eosina (HE)
Software de Análise de Imagens	NIH		ImageJ 1,53k
Luxol Fast Blue	R23193		Coloração Blu-Violeta Rápida Luxol
Scanner de ressonância magnética	Bruker		7.0T
Kit de Coloração por Fluorescência Múltipla	240522		Coloração por Imunofluorescência
Kit de coloração mieloide	G3245		Coloração mieloide
Neutro  balsam	MB9899		Montagem após a coloração
Kit de coloração Nissl	R23093		Coloração Nissl
Anticorpo RIPK3	Bs-3551R		Análise de PANoptose (1:400)
SPSS 22.0			Software de Análise Estatística 
Ratos Sprague-Dawley	Empresa de Biotecnologia Hangyi em Fuzhou
Ácido tártarico, tripolifosfato de sódio	10019418		Coloração
Sistema de Ultrassom	SIEMENS Acuson		Sonda de matriz linear (18L6)
xileno	240904A2		Coloração