Esse protocolo experimental oferece um método estável, econômico e eficiente que combina knockdown de lncRNA com ensaios formadores de colônias para quantificar o efeito do lncRNA na proliferação celular do osteossarcoma.
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Artigo de método
Ensaio de Formação de Colônias Detectando a Capacidade Proliferativa de Células de Osteossarcoma por Knockdown de RNAs LncRNA
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A expressão aberrante de RNAs longos não codificantes (lncRNAs) influencia profundamente a proliferação celular das células do osteossarcoma, sugerindo que eles podem servir como potenciais alvos terapêuticos. No entanto, estudos funcionais de lncRNAs permanecem em grande parte teóricos e limitados a algumas validações. Ensaios de formação de colônias, que refletem especificamente o destino final da proliferação de células individuais, são considerados o padrão ouro para avaliar o potencial proliferativo de longo prazo. Aqui, esse protocolo estabeleceu um protocolo experimental confiável usando ensaios de formação de colônias em células de knockdown de RNAs para avaliar o efeito do RNA na capacidade proliferativa das células osteossarcomas. Esse protocolo experimental fornece um ensaio estável, econômico e eficiente para avaliar os efeitos regulatórios do lncRNA na proliferação celular do osteossarcoma. Essa abordagem não é apenas adequada para pesquisas em células osteossarcoma, mas também serve como uma ferramenta viável para a capacidade proliferativa celular regulada por RNAs em outros tumores. Este estudo incluiu um protocolo detalhado de detecção de ensaios de knockdown de lncRNA e formação de colônias, com um exemplo do knockdown do gene 6 do RNA nucleolar hospedeiro (SNHG6) em células de osteossarcoma (143B). Os resultados experimentais confirmaram supressão eficiente da expressão de SNHG6, acompanhada de uma redução significativa tanto no número quanto no tamanho das colônias. Esses achados sugerem que o SNHG6 é essencial para sustentar o potencial proliferativo de longo prazo das células de osteosarcoma (143B).
Introdução
RNAs longos não codificantes (lncRNAs), definidos como transcritos com mais de 200 nucleotídeos sem potencial codificante de proteínas, emergiram como reguladores importantes de diversos processos biológicos nos últimosanos 1,2. Eles desempenham papéis críticos na iniciação e desenvolvimento de vários tipos de câncer, incluindo osteossarcoma, câncer de próstata e câncer depulmão 3,4,5. No osteossarcoma, evidências acumuladas sugerem que a expressão aberrante de RNA longo e não codificante (lncRNA) tem uma influência profunda na proliferação celular. Por exemplo, silenciar o lncRNA POU3F3 suprimiu significativamente a proliferação e promoveu a apoptose das células de osteossarcoma (MG63 e U2OS)6. De forma semelhante, a redução do lncRNA HOXA-AS3 reduziu a formação de colônias e inibiu o crescimento nas células U2OS e SW13537. Considerando que a proliferação descontrolada é uma marca da biologia do câncer e um determinante importante das estratégias terapêuticas, elucidar a proliferação celular regulada por lncRNA em tumores, especialmente no osteossarcoma, continua sendo de grande importância e necessidade.
Embora existam várias abordagens para avaliar a proliferação celular, cada uma carrega limitações inerentes. Ensaios colorimétricos ou metabólicos, como CCK-8 e MTT, são convenientes, rápidos e de alta produção. No entanto, eles fornecem principalmente leituras de curto prazo e são facilmente confundidos por flutuações metabólicas, além de apresentarem riscos adicionais de interferência óptica ou fotoquímica dos reagentesusados 8. Métodos baseados em síntese de DNA, incluindo a incorporação de BrdU e EdU, oferecem maior especificidade enquanto se limitam a análises instantâneas da entrada na fase S sem refletir resultados proliferativos de longoprazo 9,10. Da mesma forma, a imunocoloração para marcadores de proliferação, como o Ki-67, indica apenas atividade instantânea do ciclo celular e falha em prever a capacidadeclonogênica 10. Sistemas de monitoramento em tempo real, como o RTCA, permitem análise contínua da curva de crescimento com alta reprodutibilidade, porém seu alto custo e restrição à avaliação de curto ou médio prazo reduzem suapraticidade 11. Em contraste, o ensaio clonogênico captura de forma única a capacidade de uma única célula de sofrer proliferação ilimitada e formar colônias visíveis, refletindo diretamente seu destino final. Apesar de ser trabalhoso e demorado, o ensaio clonogênico continua sendo o padrão ouro para avaliar o potencial proliferativo de longo prazo, oferecendo insights que são inalcançáveis por ensaios de curto prazo ousubstitutos 12.
Aqui, este artigo inclui um protocolo detalhado de detecção para ensaios de knockdown de RNA e formação de colônias, com um exemplo de knockdown por SNHG6 em células osteossarcoma 143B. Essa abordagem não é aplicável apenas à pesquisa em osteossarcoma, mas também serve como uma ferramenta viável para investigar a proliferação mediada por lncRNA em outros tumores.
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Protocolo
Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Transfecção de plasmídeos
- Semente 5 × 105 células 143B por recipiente de cultura de 10 cm (total de dois pratos), cultive as células em meio completo (DMEM + FBS 10%) a 37 °C em uma incubadora deCO2 com 5%.
- Prepare reagentes de transfecção 24 horas depois, incluindo plasmídeos (shNC e shSNHG6), PEI e Opti-MEM.
NOTA: Controle o vórtice e certifique-se de que todos estejam equilibrados à temperatura ambiente antes do uso. - Retire quatro tubos microcentrífugas de 1,5 mL, rotule os plasmídeos (shNC e shSNHG6) e PEI (dois tubos) usando uma caneta marcadora.
- Adicione 500 μL de Opti-MEM a cada tubo.
- Adicione 10 μg de plasmídeos ao tubo plasmídico (shNC ou shSNHG6) e adicione 30 μL de PEI (1 μg/μL) a cada tubo PEI.
- Misture suavemente para cima e para baixo, incube em temperatura ambiente por 5 minutos.
- Combine o tubo plasmídico e o tubo PEI, misture suavemente e incube a mistura em temperatura ambiente por 20 minutos.
- Retire 143 células B da incubadora e aspire o meio de cultivo suavemente. Adicione 7 mL de meio sem sérum em cada prato. Rotule as antenas para indicar os plasmídeos a serem adicionados (143B shNC ou 143B shSNHG6).
- Adicione a mistura de transfecção pré-preparada em gota no recipiente correspondente ao recipiente de cultura.
NOTA: Adicione a mistura lentamente, usando uma pipeta em movimento circular, e distribua uniformemente da borda externa em direção ao centro do recipiente. Incubar a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2. - Descarte o sobrenadante 8-12 horas depois e adicione 10 mL de meio DMEM completo a cada prato de cultura de 10 cm. Incube as células a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 .
- Observe sob microscópio de fluorescência às 72 horas após o sobrenadante ser descartado e substituído por meio DMEM completo.
2. Ensaio de formação de colônias
- Retire o meio do recipiente de cultura de 10 cm (shNC e shSNHG6), adicione 1,5 mL de tripsina-EDTA para digerir as células, faça uma pipete suave para destacá-las e depois adicione 5 mL de meio completo para terminar a digestão.
- Transfira a suspensão da célula para um tubo microcentrífuga de 15 mL.
- Retire 20 μL de suspensão celular e conte os números das células.
NOTA: A contagem de células deve ser realizada várias vezes para garantir que os números das células no grupo shNC e no grupo shSNHG6 sejam consistentes. Aqui, coletamos 3 × 10células 5 para verificação RT-PCR da eficiência de derrubamento do SNHG6. - Semeie 2 ×10 3 células por poço em uma placa de 6 poços. Adicione meio DMEM completo a um volume final de 2 mL e cultive as células a 37 °C em uma incubadora de 5% de CO2 .
NOTA: Substitua o meio por um meio DMEM completo novo a cada dois dias. - Monitore a formação da colônia diariamente.
NOTA: Encerre a cultura quando a maioria das colônias no grupo controle (shNC) contiver ≥50 células, ou após 10-14 dias de incubação, o que ocorrer primeiro. - Retire células da incubadora e descarte o sobrenadante.
- Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS por poço e descarte o PBS após cada lavagem.
- Fixe as células com 1 mL de solução de formol a 10% por 15 minutos, depois descarte a solução de formol a 10%.
- Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS por poço e descarte o PBS após cada lavagem.
- Tinga as células com 1 mL de solução colorante de violeta cristalina 0,5% por 10-30 min, depois descarte a solução de coloração.
- Lave as células delicadamente com água da torneira que corre lentamente.
- Secar as células ao ar em temperatura ambiente.
- Capture imagens usando uma câmera.
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Resultados
Para avaliar o efeito do RNAn SNHG6 sobre a capacidade proliferativa das células osteossarcoma, estabelecemos com sucesso um sistema de knockdown mediado por plasmídeos e realizamos ensaios de formação de colônias. O fluxo de trabalho experimental incluiu transfecção plasmídica de células 143B e ensaio de formação de colônias (Figura 1).
A eficiência de transfecção de células 143B foi confirmada por microscopia de fluorescência 72...
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Discussão
Direcionar terapeuticamente os lncRNAs associados ao câncer, além de aproveitar sua utilidade diagnóstica como biomarcadores, representa uma abordagem emergente no manejo do câncer. Definir os papéis dos lncRNAs na patogênese do osteossarcoma é crucial para avançar em seu diagnóstico, terapia e prognóstico.
Passos críticos devem ser seguidos para garantir o sucesso deste ensaio. Primeiro, estabelecer uma suspensão de célula única é um pré-requisito absoluto pa...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esse trabalho foi apoiado por bolsas da National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 e 82205145).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL MICROTUBOS | Merck | AXYMCT150C | |
| Formalina tamponada 10% neutra | VICTREX | 5205000 | |
| 100 - 1000 & mu; L Pontas Graduadas Azuis Estendidas | Shanghai BioScience Co., Ltd | BS10401ML | |
| Laboratório de Pratos de Cultura Celular de 100mm | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 704001 | |
| 143B | ATCC | ATCC CRL-8303TM | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Shanghai BioScience Co., Ltd | BL2002150 | |
| Placa de Cultura Celular de 6 Poços | Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd | 703001 | |
| Incubadora CO2 | Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd. | 300583057 | |
| Violeta Cristalina | TCI Xangai | C0428 | |
| Meio DMEM | WISENT CORPORATION | 319-005-CL | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000233 | |
| FBS - Qualidade superior | WISENT CORPORATION | 086-150 | |
| Caneta de marca | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| PASTEUR PIPETTE | Labgic | BS-XG-O3L | |
| Buffer PBS (pó seco) | Labgic | BL601A | |
| PEI | Policiências | 24765 | |
| Pontas de pipeta | Merck | AXYT200Y | |
| Enzima TrypLE Express | Gibco | 12604021 | |
| Tripsina/EDTA | Gibco | R001100 |
Referências
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Reimpressões e permissões
