Artigo de método

Avaliação do efeito da eletroacupuntura no fluxo sanguíneo cerebral em camundongos APP/PS1 utilizando a técnica do laser speckle

DOI:

10.3791/69915

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13 de fevereiro de 2026

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1School of Acupuncture, Moxibustion and Tuina, Beijing University of Chinese Medicine, 2Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo centrado em imagem de contraste de speckles a laser para quantificar o fluxo sanguíneo cerebral, combinado com o Labirinto de Água Morris, para avaliar os efeitos da eletroacupuntura em camundongos APP/PS1 (modelo DA), valioso para pesquisas cerebrovasculares sobre DA.

Resumo

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A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada por declínio cognitivo progressivo e disfunção cerebrovascular, incluindo redução do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) e comprometimento das unidades neurovasculares. A eletroacupuntura (EA) demonstrou potencial para melhorar funções neurológicas, seu mecanismo pode estar relacionado à regulação da CBF. A imagem a laser de speckles é um método de campo amplo para avaliação em tempo real da CBF e pode avaliar com precisão mudanças na perfusão cerebral sanguínea. Neste experimento, observamos os efeitos da eletroacupuntura sobre a CBF e a capacidade cognitiva em camundongos modelo de Alzheimer (camundongos transgênicos APP/PS1). A perfusão sanguínea da artéria cerebral média e seus vasos ramificados em camundongos foi observada por imagem a laser de speckles. A função cognitiva espacial dos camundongos foi avaliada usando o labirinto aquático Morris. Os resultados mostraram que a EA poderia melhorar a função cognitiva dos camundongos APP/PS1, e a latência de escape foi significativamente reduzida no teste do labirinto aquático Morris (P<0,05). Além disso, a imagem de contraste de manchas a laser (LSCI) confirmou hipoperfusão cerebral significativa em camundongos modelo de DA em comparação com controles selvagens (P < 0,05) e, importante, o tratamento com EA induziu um aumento estatisticamente significativo na CBF (P < 0,05), revertendo a hipoperfusão cerebral em camundongos com DA. A imagem a laser por speckle é uma técnica de visualização para avaliar melhorias cerebrovasculares induzidas pelo EA. Esses achados apoiam a EA como uma possível terapia complementar para a DA, direcionando-se à disfunção cerebrovascular.

Introdução

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A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo caracterizado pelo comprometimento cognitivo progressivo e declínio da memória. Ele processa as características patológicas da deposição de placas extracelulares de beta-amiloide (Aβ), emaranhados neurofibrilares intracelulares (NFTs) e perdaneuronal 1. Embora essas características clássicas tenham sido o foco principal da pesquisa terapêutica, evidências crescentes ressaltam o papel crítico da diminuição do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) na patogênese e progressão daDA2. A redução do CBF ocorre no estágio inicial do início da Alzheimer e está associada à gravidade da disfunçãocognitiva 3. Portanto, a estratégia de tratamento para melhorar o dano cerebrovascular é uma forma eficaz de aliviar os sintomas da Alzheimer e melhorar o curso da doença.

A eletroacupuntura (EA), uma técnica moderna que integra a acupuntura tradicional com estimulação elétrica, tem demonstrado potencial para melhorar a função cognitiva na DA. Estudos sugerem que a EA pode exercer seus efeitos benéficos por meio de múltiplos mecanismos, como reduzir a deposição de Aβ, atenuar a neuroinflamação e promover a plasticidadesináptica 4. Notavelmente, há especulações crescentes de que os efeitos neuroprotetores da EA podem estar intimamente ligados à sua capacidade de modular oCBF 5. No entanto, evidências diretas e em tempo real demonstrando o impacto da EA na hemodinâmica cerebral em modelos de EA permanecem limitadas. A falta dessas evidências dificulta uma compreensão abrangente de como a EAs melhora a função cerebral.

Avanços tecnológicos em imagem óptica forneceram ferramentas poderosas para investigar a hemodinâmica cerebral. Como uma técnica óptica rápida e de campo amplo, a LSCI oferece alta resolução espaço-temporal para visualizar mapas de fluxo sanguíneo integrado em volumede tecidos 6, permitindo o monitoramento em tempo real da dinâmica da perfusão induzida por eletroacupuntura. Embora a exposição ao crânio seja necessária para acesso óptico ideal, a LSCI evita a penetração invasiva do tecido. A LSCI foi introduzida na década de 1990 e tem sido amplamente aplicada em neurociência nas últimasdécadas 7. Como todas as técnicas de imagem, o LSCI possui limitações inerentes: sua profundidade de penetração óptica é limitada, favorecendo a vasculatura cortical superficial enquanto limita o acesso a regiões cerebrais profundas (por exemplo, hipocampo, gânglios da base), e quantifica o fluxo sanguíneo relativo (unidades de perfusão) em vez dos valores absolutos de CBF, com precisão sutilmente influenciada pela morfologia vascular e pelo espalhamento ópticodos tecidos 8,9. No entanto, essas limitações não diminuem a utilidade do LSCI, mas definem sua aplicação especializada na avaliação em tempo real do fluxo sanguíneo cortical superficial. Para nosso estudo focado nas alterações de perfusão cortical induzidas pelo EA, o LSCI fornece dados confiáveis e acionáveis. Especificamente, estabelecemos um protocolo LSCI padronizado com delimitação direcionada do ROI e parâmetros otimizados para quantificar o CBF em camundongos APP/PS1, complementado pelos testes Morris Water Maze para vincular melhorias cerebrovasculares aos desfechos cognitivos.

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Protocolo

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Esse protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim (BUCM20250708-005), e estava de acordo com todas as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da China.

1. Preparação

  1. Doze camundongos machos APP/PS1 de 6 meses e seis camundongos machos C57bl/6 de 6 meses foram usados neste experimento.
  2. Todos os camundongos eram alojados no Centro de Experimentos Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim, com três camundongos por gaiola. Eles tinham acesso livre a água potável estéril e dieta padrão de pellets.
  3. O ambiente habitacional era mantido em um ciclo de 12 horas claro/escuro, com a temperatura ambiente controlada em 23 ± 2 °C.

2. Agrupamento e intervenções de animais

  1. Alocar aleatoriamente doze camundongos machos APP/PS1 de 6 meses (peso 27,88 g ± 0,48 g) em dois grupos experimentais (grupo n = 6/): o grupo modelo da doença de Alzheimer (DA) e o grupo de tratamento com eletroacupuntura (EA).
  2. Use seis camundongos machos C57BL/6 de 6 meses (peso 29,90 g ± 0,81 g) como grupo do tipo selvagem (WT).
  3. Para os grupos de controle WT e modelo de AD, segure suavemente os camundongos nos restritores bem ventilados e não administre intervenções experimentais.
  4. Para o grupo de tratamento EA, segure suavemente os camundongos no mesmo restritor de camundongos usado nos grupos de controle WT e modelo AD, limitando o movimento excessivo e garantindo respiração desobstruída. Sob essa condição padronizada de contenção, insira as agulhas descartáveis estéreis de acupuntura (0,25 mm × 13 mm) nos pontos de acupuntura Baihui (GV20) e Yintang (GV29) (Figura 1A) na cabeça, direcionados para a região nasal, com profundidade constante de 2-3 mm. Conecte os terminais positivo e negativo do dispositivo EA a esses dois pontos de acupuntura, respectivamente, e entregue estimulação por 15 minutos (Figura 1B). Configure os parâmetros de estimulação como um padrão de ondas densas em dispersão, com intensidade de 0,1 mA e frequência de 2 Hz.
  5. Administre as intervenções a cada grupo a cada 48 horas, com duração de 15 minutos para cada sessão, totalizando 30 dias.
    NOTA: Realize procedimentos de seleção, localização e agulhamento de pontos de acupuntura de acordo com T/CAAM 0002-2020: Nomes e Localizações de Pontos de Acupuntura Comumente Usados para Animais de Laboratório Parte 3:Camundongos 10, um padrão emitido pela Associação Chinesa de Acupuntura e Moxibusção em 15 de maio de 2020.

3. Teste MWM

NOTA: 24 horas após o período de intervenção de 30 dias, todos os camundongos dos três grupos experimentais foram submetidos ao teste Morris Water Maze (MWM), que incluiu tanto o teste de plataforma oculta (localização de navegação) quanto o teste desonda 11,12. Implemente um período de aclimatação de 1 dia antes dos testes formais para minimizar o estresse, permitindo que os camundongos se habituem à sala experimental, ao aparelho MWM e aos procedimentos de manuseio.

  1. Procedimentos preparatórios
    1. Posicione o aparelho MWM e seu sistema associado de aquisição/processamento de sinais em uma sala experimental atenuada pelo som. Mantenha a temperatura ambiente do ambiente de teste em aproximadamente 25 °C e padronize as condições de iluminação da seguinte forma: instale quatro tubos de LED de 60 W acima dos quatro quadrantes do labirinto em altura suficiente para evitar a captura pela câmera do teto. Cortinas opacas cercavam toda a área de teste para bloquear interferências ambientais externas e evitar que sinais espaciais não intencionais afetassem a navegação dos camundongos.
    2. Coloque um tanque branco circular (90 cm de diâmetro × 50 cm de altura) no centro do sistema MWM. Conecte uma câmera de vídeo montada no teto a um sistema automatizado de rastreamento e gravador para captura contínua de dados durante os testes.
    3. Divida o tanque em quatro regiões iguais, marcadas como norte (N), sul (S), leste (E) e oeste (W), e segmente ainda em quatro quadrantes congruentes, incluindo nordeste (NE), noroeste (NO), sudoeste (SW) e sudeste (SE).
    4. Fixe formas visuais de forma distinta (quadrado, triângulo e círculo) na parede externa de cada quadrante, posicionadas dentro da linha de visão dos camundongos para servir como pontos de referência espaciais.
    5. Encher o tanque com 30 cm de água mantida a 24 ± 1 °C com aquecedor elétrico; Adicione pigmento branco comestível para deixar a água opaca.
  2. Teste de plataforma oculta
    1. Fixe uma plataforma submersa no quadrante sudeste durante o período deste teste.
    2. Solte aleatoriamente cada mouse na piscina a partir de três quadrantes alternativos (NE, NW, SW), com a orientação inicial voltada para a parede do tanque para maior consistência.
    3. Permita que cada mouse tenha no máximo 60 segundos para localizar a plataforma oculta de forma independente.
    4. Registre a latência de escape (o tempo desde o lançamento até a ascensão da plataforma) para cada ensaio para avaliar o aprendizado espacial.
      NOTA: Cada mouse completou três testes por dia durante cinco dias consecutivos. Se um camundongo não encontrasse a plataforma em até 60 s, ele era gentilmente guiado até ela e deixado permanecer lá por 10 s para reforçar a memória espacial antes de concluir o teste.
  3. Julgamento da Sonda
    1. Remova a plataforma.
    2. Solte cada camundongo uma vez na piscina voltada para a parede do aquário e permita 60 segundos de natação sem restrições.
    3. Registre as principais medidas de resultado: velocidade média de natação e número de travessias sobre a antiga localização da plataforma.
  4. Cuidados pós-exames
    1. Após cada sessão de MWM, seque bem os camundongos com toalhas macias e aqueça-os suavemente usando um aquecedor elétrico para evitar hipotermia.

4. Imagem de contraste de speckle a laser

  1. Selecione aleatoriamente três camundongos de cada grupo e monitore seu CBF em tempo real e em campo completo usando o sistema LSCI.
  2. Preparação animal: Realize todas as operações animais sob anestesia. Anestesiar camundongos com injeção de 1,25% de tribromoetanol (0,02 mL/g) intraperitonealmente para garantir respiração espontânea contínua e colocá-los em uma placa de operação horizontal. Coloque camundongos anestesiados em uma almofada térmica controlada termostaticamente mantida a 37 °C para estabilizar a temperatura corporal central. Raspe o couro cabeludo e dissece cuidadosamente os músculos/meninges subjacentes para expor o crânio; Mantenha a superfície craniana exposta úmida com 0,9% de soro fisiológico estéril durante todo o procedimento para evitar a dessecação.
  3. Configuração de imagem: Posicione a cabeça de varredura do sistema perpendicular à janela craniana exposta a uma distância fixa de 20 cm. Ativem as funções de autofoco e autoganho para otimizar a clareza e o contraste da imagem, mantendo automaticamente os valores de ganho dentro de uma faixa de 140-160 em todos os experimentos. Configure parâmetros de imagem padronizados adicionais da seguinte forma: tempo de exposição = 20 ms, constante de tempo = 1,0 s, modo operacional = Temporal, filtro = 250 quadros, intervalo de amostragem = 5000 ms e resolução da imagem = 1032 × 772.
  4. Aquisição de dados: Adquira imagens speckle contínuas a uma taxa de amostragem de 25 Hz e sincronize a coleta com os parâmetros temporais e de filtro pré-configurados.
  5. Análise de ROI: Use o software de análise para definir regiões de interesse (ROIs) sobre o córtex pré-frontal, especificamente direcionando os territórios das artérias cerebrais anterior e média dentro dessa área cortical. Delinee os ROIs nessas regiões vasculares e extraia valores médios de fluxo (expressos em unidades de perfusão) de cada ROI para comparação estatística subsequente.

5. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas usando o SPSS 27.0.
  2. Analisar as diferenças entre grupos na plataforma oculta, os resultados dos ensaios de sondagem e o CBF foram analisados usando o teste t do Student. Defina significância estatística como P < 0,05 e defina alta significância estatística em P < 0,01.

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Resultados

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Efeitos da EA na aprendizagem espacial e memória em camundongos modelo de EA

Os resultados do teste do labirinto aquático de Morris estão mostrados na Figura 2. A Figura 2A mostra a latência de escape durante o teste da plataforma oculta ao longo de cinco dias. A latência de escape do grupo AD mostrou uma tendência flutuante, enquanto os grupos WT e EA diminuíram de forma constante. A...

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Discussão

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O presente estudo demonstra que a intervenção de EA de longo prazo nos pontos de acucidade Baihui (GV20) e Yintang (GV29) melhora significativamente os déficits de aprendizado espacial em camundongos transgênicos APP/PS1, como refletido pela latência de escape reduzida no teste da plataforma oculta do Labirinto de Água Morris. Essa constatação é consistente com relatos anteriores de que a EA melhora a função cognitiva em vários modelos de DA por meio de mecanismos como redução da deposiç...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Essa pesquisa foi apoiada pelo Projeto de Cultivo de Pesquisa Científica da Escola de Acupuntura-Moxibusção e Tuina, Universidade de Medicina Chinesa de Pequim.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha de acupuntura(Beijing Zhongyan Taihe Medicine Company, Ltd., China0,25 mm &tempos; 13 mmAgulha de acupuntura
Sistema de imagem de contraste de speckle a laserGene& Eu sou científico. Ltd.MoorFLPI-2
Restrinzador de camundongosCentro de Equipamentos do Laboratório HengtaiHT-A2
TribromoetanolNanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd. M2910Anestesia

Referências

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