Hidrogéis de poliacrilamida ZrOH para amostragem espacialmente resolvida de carboxilatos exsudados de raízes crescendo no solo

Summary

Neste protocolo, detalhamos o uso de hidrogéis de hidróxido de zircônio de poliacrilamida (hidrogéis ZrOH) como um método não destrutivo e in situ para amostragem de carboxilatos exsudados por raízes de raízes intactas cultivadas no solo em diferentes estágios de desenvolvimento das culturas. Também descreve o mapeamento localizado e a quantificação subsequentes desses carboxilatos usando Cromatografia Iônica-Espectrometria de Massas (IC-MS).

Abstract

A amostragem e quantificação confiável dos exsudatos radicais de raízes de plantas cultivadas no solo não perturbado continuam sendo desafiadoras. Desenvolvemos ainda um método não destrutivo para amostragem, mapeamento 2D e quantificação de sete carboxilatos (aconato, citrato, fumarato, lactato, malato, oxalato, succinato) exalados de raízes cultivadas em rizobox. O método descrito aqui emprega hidrogéis de hidróxido de zircônio de poliacrilamida (hidrogéis ZrOH) que absorvem todos os carboxilatos testados e podem ser eluídos com eficiência variando de 95,3% ± 3,12% a 111% ± 1,99%. Os hidrogéis ZrOH têm alta capacidade de ligação para carboxilatos, de até 1,82 μmol ^cm-2, dependendo do pH da solução e das espécies de carboxilato, uma concentração maior do que a normalmente disponível na rizosfera. Além disso, os carboxilatos ligados aos hidrogéis ZrOH permanecem estáveis e podem ser armazenados por várias semanas a 4 °C antes da análise. Para a aplicação, as plantas são cultivadas em rizoboxes preenchidas com solo que permitem fácil acesso com mínima perturbação ao sistema radicular. Para amostrar carboxilatos liberados pelas raízes, hidrogéis ZrOH são cuidadosamente aplicados na região de interesse por 24 horas. Após a recuperação dos hidrogéis ZrOH, eles são cortados para fins de mapeamento, e as peças de gel são eluídas para análise posterior de carboxilatos (por exemplo, via Cromatografia Iônica-Espectrometria de Massas). Nossos achados indicam que hidrogéis ZrOH são eficazes para capturar e determinar concentrações de carboxilato na rizosfera. A novidade desse método está em sua capacidade de amostrar exsudados radicais de raízes de plantas cultivadas no solo intactas, bem como na possibilidade de amostragem resolvida no tempo, em comparação com métodos tradicionais (abordagem híbrida solo-hidropônica) que muitas vezes são destrutivos e permitem amostragem única. Mais importante ainda, ele possibilita a geração de imagens 2D quantitativas, de alta resolução e em escala milimétrica, facilitando a visualização da exudação de carboxilato ao longo do eixo radicular e sua distribuição espacial dentro da rizosfera. Além disso, esse método facilita a amostragem de exsudatos radiculares em vários estágios de crescimento durante o ciclo de crescimento.

Introduction

As raízes das plantas exalam vários compostos para a rizosfera, moldando suas propriedades físicas, químicas e^biológicas. Quando as plantas são expostas a condições de estresse abiótico e biótico, a exsudação radicular é particularmente desencadeada. Os exsudados radiculares podem, de fato, influenciar a disponibilidade e mobilização de nutrientes/metais, comunidades e atividade microbiana, estabilidade dos agregados do solo e as defesas das plantas contra patógenos direta ou^{indiretamente.} Entre os exsudatos radiculares mais importantes estão os carboxilatos devido ao seu papel na solubilização de nutrientes (incluindo fósforo (P), ferro (Fe), cobre () e zinco (Zn)), tolerância a metais pesados e aprimoramento de microrganismos benéficos na ^rizosfera 2,3,4,5.

Notavelmente, os carboxilatos exsudados incluem citrato, lactato, oxalato, malato, succinato e^{fumarato 6,7,8}. Por exemplo, o citrato desempenha um papel vital na aquisição de P ao mobilizar P ligado ao Fe ou aos óxidos de alumínio (Al) (hidr)^{óxidos 7,9}. No entanto, a amostragem e quantificação precisa dos exsudatos radiculares de plantas cultivadas no solo continua sendo um desafio experimental, principalmente devido à dificuldade de obter acesso físico a sistemas radiculares não perturbados no solo e de obter amostras de exsudato^{radicular 10,11}. Além disso, compostos exsudados passam rapidamente por degradação microbiana (em minutos a horas)¹² e adsorbem fortemente nas superfícies minerais do^solo1,10. Outro desafio nos estudos de exudação radicular é o monitoramento da exudação ao longo do tempo, já que a maioria dos métodos de coleta perturba raízes ou exige a colheita de plantas cultivadas no solo, dificultando avaliar novamente a mesma^{raiz 1,11}. Portanto, amostragem, quantificação e monitoramento precisos dos exsudados radiculares exigem uma técnica que capture variações espaciais e facilite amostragens repetidas durante o crescimento da^{planta 11}.

No estudo atual, apresentamos um método não destrutivo e in situ inicialmente desenvolvido para citrato por Tiziani et ^al.12, que agora foi refinado e aplicado para amostragem, localização espacial precisa e quantificação de seis carboxilatos adicionais (aconato, fumarato, lactato, malato, oxalato e succinato) exalados de raízes intactas cultivadas em solo em rizoboxes. O método utiliza hidrogéis de poliacrilamida à base de hidróxido de zircônio (hidrogéis ZrOH) para amostragem de exsudados^{radiculares 13}. Os hidrogéis ZrOH exibem uma forte capacidade de ligação para ânions (incluindo carboxilatos) que podem ser facilmente eluídos 12,13,14. Os hidrogéis ZrOH (1) permitem amostrar carboxilatos radiculares das raízes de plantas cultivadas no solo simplesmente colocando o hidrogel no sistema radicular com perturbação mínima, (2) oferecem proteção eficaz dos carboxilatos ligados contra mineralização microbiana por pelo menos 6 semanas, (3) a distribuição espacial dos carboxilatos na rizosfera é preservada ao se unir ao gel, e (4) permitem o mapeamento 2D em escala milimétrica dos carboxilatos^12.

Os métodos existentes para amostragem de exsudados radiculares são classificados como técnicas baseadas em solo de plantas cultivadas no solo (ou seja, lavagem de raízes ou híbrido solo-hidropônico, dispositivos coletores de exsudato solo-raiz (SOIL-REC), micro ventosas, papel filtrante/folhas de ágar, armadilhas de exudação e a técnica do teste RHIZO) ou métodos hidropônicos de amostragem de exsudato. A lavagem de raízes ou abordagem híbrida solo-hidropônica envolve a remoção cuidadosa de toda a planta do solo, lavagem do sistema radicular e depois imersão na solução de amostragem para coletar exsudados^{radiculares 15}. É o método mais utilizado para amostragem de exsudatos de plantas cultivadas no solo devido à sua simplicidade. No entanto, extrair as raízes do solo apresenta risco de perda de pelos radiculares e raízes mais finas. Além disso, é necessária uma limpeza minuciosa das raízes, o que pode danificá-las, comprometer a qualidade e quantidade dos exsudatos radiculares e impedir amostragens com resolução temporal ^8,11. O método SOIL-REC envolve o cultivo de plantas em um sistema de rizobox especialmente projetado, com raízes crescendo entre duas malhas porosas de náilon (≤ 30 μm) e coleta de exsudatos radiculares usando uma ferramenta de coleta de exsudatos^{radiculares 16,17}. Essa abordagem preserva o sistema radicular, minimiza a contaminação do solo e possibilita a coleta repetida de exsudatos radiculares. No entanto, possui uma configuração complicada (com poucas réplicas apenas), maior diluição de exsudatos de volumes maiores usados para amostragem, e ainda requer otimização, pois sua replicabilidade é desafiadora, e existem enormes variações entre as^{réplicas 8}.

A aplicação de pequenos pedaços de resinas, folhas de gel de ágar ou papel filtro capazes de se equilibrar com a solução ao redor ou adsorver exsudados nos segmentos radiculares de interesse de raízes integras e acessíveis no solo (ou seja, usando rizoboxes ou janelas radiculares^)18,19. Esse método permite amostragem com resolução temporal e medição parcial da composição localizada do exsudato, embora com baixa resolução espacial. Por outro lado, é suscetível a artefatos de mineralização microbiana e difícil de manusear. De forma semelhante, armadilhas de exsudato são usadas para amostrar exsudatos de raízes de segmentos individuais, onde uma única raiz fica presa em câmaras laterais horizontais, com anéis de acrílico selados contendo a solução de amostragem, que estão posicionados^{localmente 8}. O método é aplicável tanto a raízes hidropônicas quanto a raízes cultivadas no solo e permite amostragem^{localizada 12}. No entanto, baixos volumes são coletados, a amostragem com resolução temporal é quase impossível, e isolar raízes individuais é suscetível a estresse mecânico, que pode afetar o metabolismo e a exudação^{radicular 8}. Micro ventosas são usadas para coletar solução de solo na rizosfera, permitindo amostragem in situ de raízes cultivadas^{no solo 20}. No entanto, pequenos volumes são coletados, a amostragem é parcialmente resolvida no tempo e os exsudados são propensos à adsorção e degradação^{microbiana 16}. A técnica do teste RHIZO envolve o crescimento hidropônico das raízes em pequenos cilindros com o fundo coberto por uma malha de nylon de 30 μm e então transferi-las para um disco de solo, permitindo a troca de solutos entre a raiz e o^{solo 8,21,22.} Os exsudados são coletados imergindo o tapete radicular em uma solução de amostragem. Esse método mantém contato com raízes e solo, mas emprega condições artificiais de crescimento. É limitado a experimentos de curto prazo e não possui amostragem com resolução temporal. Entre esses métodos, apenas resinas, folhas de gel de ágar, papel de filtro, armadilhas de exudação e microventosas podem ser empregados para determinar padrões de exudação espacial.

Os métodos de amostragem de exsudato hidropônico abrangem técnicas de hidroponia e semi-hidroponia. A hidroponia é um método frequentemente utilizado e direto para coletar exsudatos radiculares, no qual as plantas são cultivadas em uma solução nutritiva, que é então substituída por uma solução de amostragem (H₂O,_{CaSO 4},_{CaCl 2}, micropur) para obter amostras de exsudato^15,23. O método é simples e impõe estresse mecânico mínimo às raízes. É altamente reproduzível e estéril, se necessário, o que aumenta a qualidade dos exsudatos radiculares e permite amostragem com resolução temporal ^5,16. No entanto, é um sistema altamente artificial que pode alterar a fisiologia das plantas, a morfologia (por exemplo, desenvolvimento dos pelos radiculares) e os processos de exudação^{radicular 6,15}. Na semi-hidroponia, as plantas são cultivadas em contas de vidro, areia ou vermiculita com uma solução nutritiva em percolação contínua, e os exsudados são coletados na solução de^{percolação 8,18}. Essa abordagem é um pouco menos artificial em comparação à hidroponia e permite amostragem com resolução temporal. No entanto, o sistema é quase totalmente saturado de água e, portanto, requer plantas tolerantes a condições parcialmente anaeróbicas.

Comparado a abordagens alternativas, o método do hidrogel ZrOH oferece várias vantagens. Os hidrogéis ZrOH permitem amostrar exsudatos radiculares em cultivo de solo (próximos a condições naturais) com mínima perturbação do sistema radicular, amostragem resolvida no tempo durante o ciclo de vida da planta e a coleta de exsudatos radiculares por mais de 24 horas é possível devido à diminuição da degradação microbiana e à alta capacidade de ligação^{carboxilada 12}. Além disso, nenhum biocida (por exemplo, micropur,_{NaN 3}) é necessário para amostrar/preservar os hidrogéis, que podem afetar o instrumento analítico a longo prazo e interferem na análise química. Isso ocorre porque os carboxilatos estão quimicamente ligados ao hidrogel ZrOH. Além disso, as amostras podem ser armazenadas por várias semanas a meses antes da análise e, portanto, muitas amostras podem ser coletadas de um único conjunto experimental¹², o que pode ser atribuído às propriedades antimicrobianas do Zr no hidrogel^24,25. Além disso, os hidrogéis ZrOH permitem o mapeamento em resolução milimétrica 2D de compostos exsudados e outros ânions na rizosfera, com a possibilidade de amostrar todo o sistema^{radicular 12,14,26}. Os hidrogéis ZrOH ocupam menos espaço de armazenamento na geladeira (4 °C) em comparação com os grandes volumes exigidos pelos métodos clássicos, que normalmente são armazenados no freezer (-20 °C). A principal limitação é o hábito de produzir hidrogéis ZrOH de alta qualidade com pouca ou nenhuma bolha de ar, além do fato de que os rizoboxes permanecem sistemas de ambiente de cultivo artificial. Outra limitação é que o método foi desenvolvido apenas para sete carboxilatos (aconato, citrato, fumarato, lactato, malato, succinato e oxalato⁾¹², sulfonamidas (sulfadiazina, sulfametazina, sulfacloropiriazina e clindamicina⁾²⁷, e ânions inorgânicos (sulfetos e oxiânios de P, V-vanádio, As-arsênico, Se-selênio, Mo-molibdênio, Sb-antimônio^)14,26,28,29. O hidrogel ZrOH também tem sido usado em combinação com reagente particulado suspenso – ácido iminodiacético para amostragem in situ e mapeamento de cátions (Al, Fe, Ca-cálcio, Mg-magnésio, Mn-manganês, Ni-Níquel e Zn-Zinco) na rizosfera 28,29,30.

Aqui, fornecemos um método baseado em hidrogel ZrOH para permitir amostragem in situ resolvida por tempo e espaço de carboxilatos de sistemas radiculares cultivados no solo. Fornecemos uma descrição detalhada de como realizar um experimento de rizocaixa, incluindo amostragem e mapeamento 2D de exsudatos radiculares usando a técnica de hidrogel ZrOH. Ela abrange a preparação de hidrogel, o enchimento do rizocai, cultivo de plantas, aplicação, recuperação e corte de hidrogel, elução de carboxilato a partir do hidrogel e análise, e é seguida pela geração de imagens 2D. Além disso, fornece notas sobre etapas críticas, como análise de carboxilato usando cromatografia iônica e espectrometria de massa (IC-MS).

Protocol

1. Preparação de hidrogel ZrOH

NOTA: Um ambiente e materiais limpos são necessários para a preparação do gel para evitar contaminação. Use apenas água de grau de laboratório (≤18 MΩ·cm) ao preparar as soluções, enxágue em gel e hidratação para garantia de qualidade. Certifique-se de que os recipientes de resíduos tóxicos (líquidos e sólidos) já estejam colocados na exaustão antes de iniciar a preparação do hidrogel. Pré-aqueça o forno a cerca de 42─45 °C por 1 hora antes de começar a preparar os géis. Detalhes sobre os materiais e produtos químicos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação para montagem de vidro
   1. Prepare um banho ácido de 10% (p/v) de HNO₃ adicionando 153,8 mL de 65% de HNO₃ a 846,2 mL de água de laboratório grau I em uma exaustão de fumaça.
   2. Deixe de molho as placas de vidro (6,1 x 17 cm), pinças, espaçadores em forma de Teflon em forma de U (0,25 mm ou 0,4 mm) e clipes plásticos no banho de ácido por pelo menos 4 horas.
   3. Remova as placas de vidro, pinças, clipes plásticos e espaçadores de Teflon do banho de ácido e lave pelo menos três vezes com água de laboratório de grau I. Depois, deixe secar ao ar livre em um banco laminar ou bancada limpa.
      NOTA: As placas de vidro devem ser preparadas no mesmo dia da preparação do gel e evitar secá-las com papel para minimizar a contaminação.
   4. Coloque o espaçador em formato de "U" na placa de vidro seco, adicione a segunda e prenda-os com clipes. Desloque as placas de vidro em cerca de ~1 mm para facilitar a pipetagem (veja a Figura 1A).
   5. Coloque a placa de vidro sobre uma folha plástica limpa sob o capuz do filme antes de fundir a solução em gel.
2. Preparação em gel de^{poliacrilamida 31}
   1. Solução em gel: prepare uma solução de gel de 100 mL misturando 15 mL de gel de reticulação de 15 mL de Gradientes Difusivos em Filmes Finos (DGT) com 47,5 mL de água de laboratório grau I em um frasco plástico limpo, e depois adicione 37,5 mL de solução de acrilamida (40%). Mexa a mistura cuidadosamente ao adicionar cada solução. A solução em gel pode ser armazenada na geladeira (4 °C) por pelo menos três meses.
      NOTA: Certifique-se de pipetar/pesar as quantidades corretas de cada solução e use apenas solução de acrilamida sem bis-acrilamida, pois isso produz gels moles quando colocado em um tampão de ácido 2-(N-morfolino)-etanolsulfônico (MES).
   2. Prepare uma solução de persulfato de amônio (APS) de 10% (p/v) dissolvendo 0,1 g de APS em 1 g de_H2O. Prepare a solução fresca todos os dias e certifique-se de que esteja completamente dissolvida antes do uso.
   3. Prepare um coquetel em gel misturando 4 mL de solução de gel com 28 μL de APS a 10%, e depois adicione 10 μL de 99% N,N,N'N'-Tetrametilendiamina (TEMED) em frascos plásticos limpos. Misture após adicionar cada solução. A solução pode ser preparada para até 3 géis, pois a mistura polimeriza rapidamente. O volume de um coquetel pode ser ajustado dependendo do tamanho das placas e espaçadores a serem usados.
      NOTA: Evite bolhas e espuma ao misturar os vários reagentes.
   4. Pipete lentamente a mistura de gel entre o conjunto da placa de vidro pelo centro, como mostrado nas Figuras 1B, C²⁶. Caso haja bolhas de ar, remova-as inclinando suavemente o conjunto de vidro ou batendo nas placas de vidro com uma caneta.
      NOTA: Para obter géis sem bolhas, evite usar placas de vidro riscadas e armazene-as em banho ácido após o uso, lavando-as apenas antes do próximo uso, em vez de guardá-las em sacos de polietileno. Use uma pipeta de 1 mL ou 5 mL com uma ponta pequena para lançar o gel e adicione o coquetel de gel lentamente a partir do centro para que ele se espalhe uniformemente enquanto inclina as placas em um ângulo de 45°.
   5. Coloque o conjunto no forno pré-aquecido e mantenha a temperatura em 42─46 °C por pelo menos 1 hora para garantir que o gel endureça completamente (sem pingar líquido).
   6. Faça levemente alavanca no conjunto com a ajuda de uma lâmina de barbear limpa e sem ferrugem nos cantos e lave os géis das placas de vidro usando água de grau de laboratório em um frasco de lavagem (Figuras 1D–F). Para facilitar a remoção do gel, deixe-o de molho com água por alguns minutos e depois lave em um béquer de 1-L contendo água de laboratório grau I.
      NOTA: Evite puxar o gel com uma pinça caso ele grude na placa, pois isso pode levar à deformação do gel. Após a polimerização, quaisquer bolhas aparentes geralmente ficam localizadas entre o gel e a placa de vidro, em vez de dentro do gel em si, o que fica claro quando a placa é removida.
   7. Troque a água pelo menos 3–4 vezes dentro de 24 horas após a hidratação (preferencialmente em intervalos de 2 horas após a preparação) para lavar os produtos químicos de polimerização restantes. Ao substituir repetidamente a água durante a hidratação, impurezas como reagentes não reagidos são difundidas, e o pH é reduzido, prevenindo o acúmulo de carga dentro do gel.
   8. Armazene os géis em água de laboratório grau I (por um curto período de aproximadamente 24 horas) ou 0,01 mol de NaCl ^L-1 ou_{NaNO 3} na geladeira (4 °C) caso as folhas de gel não sejam imediatamente usadas para a precipitação de ZrOH. Esses géis podem ser armazenados em NaCl por até 1 mês antes da precipitação.
      NOTA: Recomendamos precipitar os géis imediatamente após a polimerização para minimizar a contaminação que pode ser introduzida durante a lavagem.
3. Precipitação de géis^{ZrOH 14}
   1. Dissolva 3,22 g de octahidratado de óxido de dicloreto de zircônio (ZrOCl_{2,8H 2}O) em 40 mL de água de laboratório grau I em um béquer plástico de 250 mL.
   2. Coloque até 4 folhas de gel e encha até 100 mL. Alternativamente, dissolva 1,66 g de ZrOCl_{2,8H 2}O em 20 mL de água de laboratório grau I, coloque 2 géis e encha até 50 mL.
   3. Deixe as folhas de gel de molho por pelo menos 2 horas para garantir uma distribuição uniforme do Zr nos géis.
   4. Transfira cada gel para 100 mL de 0,05 mol de ácido ^L-1 2-(N-morfolino)-etanossulfônico (MES) tamponado a pH 6,7 (pH ajustado com 1 mol ^L-1 NaOH) para precipitação. Mexa o gel suavemente com uma pinça durante os primeiros 30-60 segundos para obter precipitação homogênea.
   5. Agite suavemente em um agitador de placas a ≤100 rpm por 40 minutos para obter total precipitação de Zr(OH)₄ no gel.
      NOTA: A velocidade de agitação mais lenta é preferida para evitar que os géis grudem uns nos outros.
   6. Coloque os géis em água de laboratório grau I em um béquer de 1─2 L por 24 horas para remover íons Cl^- e troque a água pelo menos 3 vezes em intervalos de^{2 horas e 32}. A remoção completa dos íons Cl^- pode ser verificada medindo a condutividade da solução de enxágue ou realizando um teste de cloreto.
   7. Armazene o gel em 0,03 mol ^L-1 _{NaNO 3} ou NaCl, mas o NaCl é preferido para experimentos no solo, pois o nitrato rapidamente aumenta a atividade microbiana do solo e também é um nutriente importante para^{plantas 13,32}.
   8. Os hidrogéis ZrOH foram testados por até 60 semanas (armazenados em geladeira a 4 °C) e mostraram manter suas características e bom desempenho (±10% dos valores-alvo⁾³².
4. Corte em gel
   1. Limpe a placa de acrílico sem riscos, a pinça e uma lâmina afiada e sem ferrugem. Na ausência de uma placa de acrílico, qualquer placa de vidro grossa e resistente pode ser utilizada.
   2. Umedecida a placa de acrílico com água de laboratório grau I para ajudar a espalhar as folhas de hidrogel ZrOH.
   3. Espalhe a folha de hidrogel ZrOH sobre a placa de acrílico usando uma pinça, garantindo que ela fique plana e sem bolhas. Identifique as regiões com furos nas folhas; essas áreas devem ser evitadas ao cortar.
   4. Corte com precisão as folhas de hidrogel ZrOH com uma lâmina afiada no tamanho desejado. Remover a água da placa após o corte ajuda a ver claramente as partes recortadas.
      NOTA: Para facilitar a identificação dos lados para mapeamento 2D, recomendamos cortar peças de hidrogel ZrOH em um trapézio em ângulo reto, com o lado mais longo localizado no canto superior esquerdo.
   5. Armazene os hidrogéis ZrOH em água de laboratório grau I (para armazenamento de curto prazo e logo antes da aplicação do gel) ou 0,03 mol ^L-1 _{NaNO 3}/NaCl para armazenamento a longo prazo (>24 horas).

2. Configuração do experimento Rhizobox

NOTA: As plantas são cultivadas em rizoboxes preenchidas com solo, que variam em design. Recomendamos o uso de rizocaixas equipadas com um ou mais um ou mais um buraco no fundo ou atrás para facilitar a rega e garantir uma distribuição uniforme da água (veja a Figura Suplementar 1). Detalhes sobre os materiais e produtos químicos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Determinação do enchimento da caixa de rizos e capacidade de^{retenção de água 26}
   1. Peneirar o solo seco ao ar usando uma peneira de 2 mm e homogeneizar o solo. Recomendamos o uso de solo de textura média, mas também pode ser usado solo arenoso ou argiloso, desde que técnicas específicas de manuseio sejam empregadas (por exemplo, tipo rizobox, preenchimento, abertura e rega).
   2. Pese todos os componentes da caixa de rizos (vazia) junto com as grampos e o papel alumínio plástico e registre o peso (veja a Figura Suplementar 2C). Adicione 2–3 caixas de rizoboxes extras ao número necessário para determinar a capacidade de retenção de água (WHC).
   3. Estime a massa de solo seco necessária para preencher o rizobox. Geralmente, o rizobox é preenchido até 2 cm abaixo do topo. A densidade volumétrica recomendada é aproximadamente 1,0–1,4 g ^cm-3.
   4. Dependendo do tipo de rizocaixa e da conveniência do manuseio, preencha cuidadosamente a rizocaixa com o solo seco. Durante e após o enchimento, o solo pode ser nivelado usando uma placa plana sem compactá-lo. Solo levemente úmido também pode ser usado para preencher o rizocaixo, mantendo a estrutura do solo, especialmente para solos de textura fina ou argilosa pesada (veja Wagner et ^al.26 para uma descrição detalhada).
   5. Alternativamente, se a caixa de rizobox estiver preenchida por cima, fixe a folha de alumínio plástica na caixa, cubra-a com a placa frontal e então prenda (veja a Figura Suplementar 2A–D).
   6. Para conveniência, instale uma membrana nucleporal durante o processo de preenchimento e certifique-se de que ela fique plana na superfície. Uma membrana nucleporal é necessária ao amostrar exsudados radiculares.
   7. Registre o peso das rizocaixas preenchidas com terra junto com as pinças. Calcule a massa de solo seco (m_{solo seco}) para cada rizocaixa subtraindo o peso das rizocaixas vazias das preenchidas com terra e registre o peso.
   8. A capacidade de retenção de água é determinada primeiro saturando as rizocaixas com água deionizada e depois permitindo que drenem por ~8 horas. Pese as rizocaixas e calcule a massa de água (_{m w}) subtraindo o peso das rizocaixas preenchidas com solo registrado no passo 2.1.7 do peso atual. Depois, determine o WHC (g ^g-1) dividindo m_w por_{m solo seco}, o resultado é uma razão.
      NOTA: Não use rizoboxes usadas para a determinação do WHC para mapeamento real, pois a saturação da água pode levar à anaerobia e, portanto, à formação de artefatos redox.
   9. O teor ótimo de água para a maioria das plantas durante o crescimento deve ser mantido em 50%─60% WHC (ou seja, fator WHC, f_WHC = 0,5─0,6), dependendo do tipo de solo e da espécie da planta. Estime a quantidade de água a ser adicionada (m_{w add}) a cada rhizobox da seguinte forma: m_{w add} = WHC x f_{WHC x m solo seco}.
   10. Regue o rizobox antes de plantar com o_amonto. Se a rega for feita pelos buracos, adicione de 5 a 10 mL de água na superfície.
   11. Registre a massa das rizocaixas regadas, que são necessárias para regar as plantas durante o crescimento.
2. Cultivo e manejo de plantas^12,26
   1. Esterilize as sementes antes da germinação ou plantio. Uma prática comum é colocá-las em etanol a 70% por 3 minutos e depois em NaClO a 1% por 15 minutos para evitar o crescimento fúngico. Depois, enxágue as sementes com água desionizada (aproximadamente 6─7 vezes).
   2. Pré-germine as sementes entre papéis filtrantes ou rolos de germinação umedecidos com água ou 0,05 mmol L⁻¹ _{CaSO 4} até que a radícula surja.
   3. Transfira uma muda para cada rizocaixa, coloque-as perto da placa frontal, cubra com um pouco de terra e depois adicione um pouco de água.
   4. Envolva as rizocaixas em papel alumínio de alumínio para evitar a redução fotoquímica na rizosfera, evitar o crescimento de algas e outros microrganismos fotossintéticos, além de evitar sobrecarregar as raízes quando expostas à luz. Alternativamente, placas frontais pretas que não permitem a passagem da luz estão disponíveis e podem ser usadas no lugar do alumínio de alumínio.
   5. Coloque as caixas de rizos em uma grade para incliná-las na câmara de crescimento ou estufa com temperatura, umidade relativa e intensidade de luz controladas. Recomendamos uma inclinação de 25°─35°.
   6. Rege as rizocaixas gravimetricamente pelo menos 2─3 vezes por semana, dependendo das necessidades das plantas. Isso é feito pesando as rizocaixas, adicionando água para compensar a diferença em relação ao peso registrado no passo 1.2.11. No entanto, quando a biomassa da planta é significativa e a demanda de água aumenta, a biomassa deve ser considerada e o volume de rega deve ser ajustado de acordo.
   7. Práticas específicas de manejo das culturas (por exemplo, fertilização) são realizadas de acordo com o ambiente experimental, características do solo, espécies de plantas cultivadas e necessidades predominantes de controle de doenças e pragas durante o crescimento das plantas.
   8. O período de crescimento e a amostragem dos exsudatos radiculares dependem em grande parte do tamanho dos rizoboxes, das espécies de plantas e dos objetivos do estudo.

3. Amostragem de exsudato de raiz^12,26

NOTA: Aqui fornecemos detalhes sobre amostragem não destrutiva de exsudatos radiculares. Certifique-se de que todos os materiais necessários estejam preparados antes da amostragem e que os blanks experimentais sejam incluídos durante a amostragem. Os detalhes sobre os materiais e os produtos químicos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Leve lentamente o teor de água das caixas de rizos para 90%─95% de WHC (80% para culturas altamente sensíveis ao estresse de oxigênio) um dia ou pelo menos 2 horas antes da amostragem. Isso pode ser alcançado com precisão primeiro calculando a quantidade de água a ser adicionada (m_{w add}) no passo 2.1.9 usando 90%─95% de WHC, depois recalculando o peso total da caixa de rizo, do solo úmido e uma estimativa do peso da planta. Usando uma balança, adicione água desionizada até que a caixa de rizos atinja o peso recalculado.
2. Desembrulhe a folha de alumínio da caixa de rizo, identifique e desenhe a região de interesse na placa frontal. Essa etapa só é necessária se apenas os segmentos das raízes ou plantas jovens forem amostrados.
3. Corte uma folha plástica e hidrogel ZrOH (veja o passo 1.3) nas dimensões especificadas de acordo com a região de interesse e o tamanho da caixa de rizo. Se a membrana nucleóvora não foi instalada durante o processo de preenchimento, corte-a nas dimensões desejadas, um pouco maior que o hidrogel ZrOH.
4. Coloque as caixas de rizos em um suporte plano com a placa frontal removível voltada para cima e abra-as cuidadosamente (veja a Figura 2A). Retire lentamente o papel alumínio plástico enquanto garante que as raízes e o solo não sejam perturbados.
5. Posicione uma régua na área de interesse e capture fotos de alta resolução, que serão necessárias para o processamento subsequente dos dados. Uma régua serve como referência para a determinação precisa do tamanho diretamente da imagem durante o processamento, especialmente se muitas rizoboxes precisarem ser amostradas.
6. Adicione uma pequena quantidade de água à área radicular alvo até que apareça uma fina película de água na superfície (veja a Figura 2B). Um teor de umidade mais alto (preferencialmente 90%–95% WHC ou 80% para culturas altamente sensíveis ao estresse de oxigênio) do solo facilita um bom contato solo-gel durante a amostragem. Um teor de umidade mais alto é necessário para manter um fluxo constante de moléculas sobre o hidrogel.
7. Coloque a membrana nucleporal pré-cortada diretamente sobre a superfície do solo/região radicular de interesse e certifique-se de que ela fique plana na interface solo-raiz (veja a Figura 2C).
8. Coloque o hidrogel ZrOH diretamente e o mais plano possível sobre a membrana do nucleporo na região de interesse e tire uma foto junto com a régua colocada no lado esquerdo do hidrogel ZrOH (veja a Figura 2D). A régua pode ajudar a determinar o tamanho do hidrogel ZrOH e, em caso de alterações nas propriedades durante a amostragem, a área amostrada, além de identificar os lados durante armazenamento prolongado (>1 ano).
9. Proteja o hidrogel ZrOH da placa frontal colocando uma folha plástica sobre o hidrogel ZrOH (veja a Figura 2D).
10. Feche suavemente a caixa de rizos para reduzir o movimento do hidrogel ZrOH. Movimento mínimo do hidrogel ZrOH ao fechar a caixa de rizos também pode ser alcançado fixando o sanduíche de gel (membrana do nucleporo + hidrogel de ZrOH + folha plástica) a uma placa frontal limpa da caixa de rizos com fita isolante de vinil, conforme descrito por Wagner et^{al 26}.
11. Embrulhe novamente a rizocaixa em papel alumínio e coloque-a de volta na câmara de crescimento/estufa por 24 horas. Os exsudatos radiculares podem ser coletados por períodos mais longos ou curtos, desde que o gel não seque, e dependendo do ambiente experimental e dos objetivos do estudo.
12. Após o período de aplicação, abra delicadamente a caixa de rizo, remova cuidadosamente a fita e a membrana, e retire o hidrogel. Coloque o hidrogel em um saco estéril hermético, adicione algumas gotas de água antes de fechar e depois armazene na geladeira (4 °C) até a análise. Armazene os géis em branco de forma semelhante ao controle. Para fins de mapeamento 2D, levante o hidrogel ZrOH junto com uma folha plástica e marque o topo.
13. Remova as raízes e determine os parâmetros morfológicos da raiz, o peso fresco e o peso seco para normalização dos dados de exsudado caso não sejam realizados experimentos de resolução temporal.
14. Feche a caixa de rizos e coloque-a de volta na câmara climática ou estufa caso estudos com resolução temporal sejam realizados.

4. Elução e Medição dos^{Carboxilatos 12}

NOTA: Água fresca de laboratório grau I e padrões analíticos de alta pureza são necessários para preparar as cápsulas e padrões. Como garantia de qualidade, devem ser usados padrões certificados de controle de qualidade. Certifique-se de que as soluções (amostras e padrões) estejam livres de partículas, filtrando as amostras por filtros de nylon de 0,2 μm ou 0,45 μm antes da análise para evitar entupimentos de tubos. Detalhes sobre os materiais e produtos químicos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Retire os hidrogéis ZrOH carregados e em branco da geladeira, meça as dimensões usando uma régua e então calcule o volume de cada um usando uma espessura de 0,4 mm para espaçador de 0,25 mm e 0,64 para um espaçador de 0,4 mm. Para mapeamento 2D, corte os hidrogéis ZrOH no tamanho desejado usando uma lâmina de barbear limpa. Lembre-se de que o limite inferior é cerca de 2 x 2 mm devido às dificuldades em cortar pedaços menores e manusear os volumes de elução adequados.
   NOTA: Em vez de uma régua, use papel milimetrado (papel milimétrico) em um dos lados da placa de plexiglass usada para corte, facilitando o corte dos hidrogéis ZrOH em pedaços quase perfeitos. A espessura dos hidrogéis ZrOH confirmada usando um calibre vernier.
2. Coloque os hidrogéis ZrOH ou pedaços de hidrogel ZrOH em frascos plásticos, eluda-os adicionando 0,5 mol ^L-1 NaOH seguindo a proporção de 1 mL eluente por 0,196 cm 3 hidrogel ZrOH e agite em um agitador de placas por 24 horas a 150 rpm.
3. Caso o volume de elução seja baixo, no caso de uma peça muito pequena (por exemplo, 2 x 2 mm) de hidrogel ZrOH, adicione água de grau I laboratorial em peso para chegar a 45-60 μL, dependendo do volume mínimo necessário para o método analítico usado para quantificar carboxilatos (por exemplo, o IC-MS precisa de pelo menos 45 μL de amostra para o autoamostrador, dependendo do instrumento). Registre a quantidade exata de água adicionada para elevar o volume para 45-60 μL, pois isso será necessário para o cálculo do fator de diluição e da concentração real.
4. Filtre as amostras (filtros de nylon 0,2 μm ou 0,45 μm) e transfira-as para frascos. Recomendamos o uso de frascos plásticos de 1,5 mL para IC, pois podem ser congelados sem quebrar. Frascos de 330 μL também podem ser usados para volumes menores, mas é preciso ter cuidado para garantir que não haja bolhas de ar.
5. Quantifique os carboxilatos na solução de elução pelo método analítico preferido (por exemplo, IC-MS, HPLC). Recomendamos sua separação usando CI acoplado à detecção de MS. Alternativamente, cromatografia líquida de alto ou ultra desempenho (HPLC ou UHPLC) pode ser empregada em combinação com vários detectores, incluindo MS avançados (por exemplo, tempo de voo ou Orbitrap) ou detectores espectrofotométricos.
6. Ao final da medição, as amostras, junto com os padrões, podem ser armazenadas no freezer. Recomendamos armazenar todas as soluções contendo carboxilatos a -20 °C por um período máximo de 1 ano. Para períodos de armazenamento superiores a 1 ano, novos padrões podem ser preparados e medidos como verificação de qualidade.
7. Calcule a quantidade total de cada carboxilato no volume total de eluato (ou seja, volume de NaOH + volume de hidrogel + água adicionada) e normalize pelo peso radicular ou área radicular e multiplique pelos fatores de eficiência da elução: 0,94 para aconato, 1,00 para citrato, 0,90 para fumarato, 1,02 para lactato, 1,05 para malato, 0,91 para oxalato e 1,00 para succinato (veja Tabela Suplementar 1). Certifique-se de que os fatores de diluição sejam levados em consideração, caso algum tenha sido feito durante a elução e a medição.

5. Mapeamento 2D

NOTA: Não existe um software específico para criar imagens 2D dos dados de exudação. O mapeamento pode ser feito com Microsoft Excel e Python.

1. Insira os dados obtidos no passo 4.7 de cada pedaço de gel em sua célula correspondente dentro da grade 2D (linhas x colunas). A grade é gerada sobre as fotos tiradas das raízes durante a amostragem (veja passo 4.1).
2. Defina o tamanho das grades e verifique se os dados correspondem.
3. Selecione a escala de cores e especifique códigos de cores representando os valores mais baixos e mais altos.
4. Especifique o intervalo numérico de dados para a legenda para garantir que ela corresponda com precisão à escala selecionada.
5. Crie um mapa de calor e certifique-se de que ele não tenha rótulos ou linhas de grade. O mapa de calor pode ser facilmente criado em R Software usando o Script R de exemplo fornecido no Arquivo Suplementar 1.
6. Processe a imagem e posicione-a adjacente à fotografia das raízes obtida durante a amostragem para poder interpretar a distribuição espacial dos carboxilatos.
   NOTA: Hoje, o mapeamento também pode ser realizado usando ferramentas de inteligência artificial. O procedimento é simples: basta copiar e colar a grade numérica do Excel no chat, depois solicitar um mapa de calor com as dimensões e a escala de cores desejadas para a legenda. Lembre-se de que o resultado pode nem sempre ser perfeito na primeira tentativa, mas repetir o processo geralmente gera resultados precisos. Essa abordagem oferece a vantagem de ser consideravelmente mais rápida do que os métodos manuais.

Results

O método do hidrogel ZrOH foi inicialmente desenvolvido para amostragem de citrato de raízes de plantas cultivadas no solo e foi usado com sucesso para resolver a distribuição espacial da exudação¹¹. Antes de adotar esse método para outros carboxilatos, caracterizamos hidrogéis ZrOH para garantir que fossem adequados para uso com outros carboxilatos também (veja a Tabela Suplementar 1). Além disso, eluímos e analisamos hidrogéis ZrOH carregados armazenados de um experimento de rhizobox realizado em 2019. Os hidrogéis ZrOH podem ocupar 100% da quantidade carregada em 5 h (~0,2 μmol, 10 mL) para aconato, citrato, fumarato, lactato, malato, oxalato e succinato usando os mesmos parâmetros de elução estabelecidos por Tiziani et ^al.12 (1 mL, 0,5 mol ^L-1 NaOH). Os hidrogéis ZrOH podem se ligar a até 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol ^cm-2 de carboxilatos (ver Tabela Suplementar 1), muito maiores do que as concentrações (frequentemente na faixa de nmol) geralmente encontradas na rizosfera. Além disso, os hidrogéis ZrOH carregados em carboxilato permanecem estáveis e podem ser armazenados por várias semanas antes da análise, minimizando assim a degradação microbiana durante e após a amostragem.

Os resultados na Figura 3 exibem uma visualização 2D da distribuição espacial da exudação de citrato ao longo de uma raiz em grupo de uma planta Lupinus albus L (lupino) cultivada no solo em um solo deficiente em P. O mapa compreende 48 medições individuais realizadas em 5 pedaços de gel de 5 x 2 mm, nos quais o gel ZrOH foi seccionado em agosto de 2025 após amostragem de citrato em agosto de 2019. Claramente, os hidrogéis ZrOH absorveram efetivamente citrato exudado, com resultados quantificáveis mesmo em um gel pequeno (0,10^cm2), sem a necessidade de pré-concentração do eluato. As maiores taxas de exudação de citrato foram encontradas nas regiões radiculares do grupo (até 2,8 nmol ^cm-2 gel ^h-1), traduzindo-se em 67,2 nmol ^cm-2 gel no ^primeiro dia, enquanto as menores taxas foram observadas apenas nos pedaços de gel em contato com o solo. As raízes do grupo variaram em comprimento de 0,2 mm a 15,6 mm, com um comprimento total de 250 mm. Esses resultados confirmam a adequação dos hidrogéis para amostragem de carboxilato liberados pelas raízes por 24 horas. Os hidrogéis ZrOH também foram capazes de se ligar a outros carboxilatos, como lactato, fumarato, malato e oxalato, além do citrato (Tabela 1). A detecção da maioria dos carboxilatos provenientes dos hidrogéis ZrOH, que foram armazenados a 4 °C por 6 anos, sugere uma degradação mínima dos carboxilatos. No entanto, experimentos estão em andamento para reunir informações significativamente mais sobre os sete carboxilatos testados de diferentes espécies de plantas.

Figura 1: Etapas críticas da preparação do gel de poliacrilamida. (A) Alinhamento da placa de vidro com deslocamento de ~1 mm. (B) Fundição em gel e (C) espalhamento uniforme da solução de gel na placa a partir do centro da placa. (D) Alavanca na placa de vidro usando uma lâmina de barbear no canto. (E) Deixar os géis de molho para ajudar a se separar da placa de vidro. (F) Lavar o gel para formar um béquer. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Amostragem de exsudato radicular de um segmento do sistema radicular vegetal cultivado em rhizobox usando hidrogéis ZrOH. (A) Abra o rizo-caixa após remover a placa frontal e o plástico. (B) Umedição adequada da interface solo-raiz usando água desionizada em um frasco de lavagem. (C) Membrana de gravação de núcleo fixada a uma interface úmida solo-raiz. (D) Rizocaixa com um hidrogel ZrOH aplicado na região de interesse, coberto com folha plástica para proteção em gel contra a placa frontal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Amostragem de exsudato radicular usando hidrogel ZrOH e imagem 2D em escala milimétrica da exudação de citrato. (A) Foto do hidrogel ZrOH sobreposto à região radicular de interesse durante a amostragem para gerar grades usadas para mapeamento. (B) Imagem 2D em escala milimétrica mostrando a distribuição da taxa de exudação de citrato (nmol ^cm–2 gel h^–1) uma raiz branca de Lupinus albus L. (lupino) em cluster crescida em solo pobre em fósforo. Cada grade representa uma peça de gel de 5 x 2 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Planta	Tratamento	Aconitate	Citrato	Fumarato	Lactato	Malate	Oxalato	Succinado
	solo mg P kg-1	NMOL CM-2 H-1
Lupin	50		0.02	0.21	0.15		0.06
Lupin	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
Lupin	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
Lupin	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
Arroz (Nerica4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

Tabela 1: Taxas de exudação de aconato, citrato, fumarato, lactato, malato, oxalato e succinato de plantas cultivadas em solo Lupinus albus L. (lupino) e Oryza sativa L. (arroz) submetidas a solo de 0, 50 e 250 mg de P ^kg-1 . LOQ é o limite de quantificação

Tabela Suplementar 1: Parâmetros de elução do NaOH (1 mL, 0,5 mol ^L-1) (eficiência da elução e fator de correção) e capacidade do hidrogel ZrOH para sete carboxilatos. Os dados são médias ± desvios padrão da média (n = 4 para eficiência de elução e capacidade de carboxilatos individuais e n = 40 para mistura de carboxilatos). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 1: Representação esquemática da rhizobox recomendada para facilitar a rega. A rhizobox consiste em uma estrutura de rhizobox equipada com poços de água espaçados uniformemente na parte inferior e traseira para facilitar a distribuição uniforme da água durante a irrigação, e uma placa frontal transparente removível para monitorar o crescimento das raízes durante o experimento. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Montagem da caixa de rizos e processo de enchimento do solo. (A) Cubra os furos na parte de trás da moldura da caixa de rizobox com fita adesiva. (B) Anexe uma membrana de nucleóporos, depois folha plástica na frente ou lado aberto da estrutura da caixa de rizos (certifique-se de que esteja apertada e plana). (C) Coloque a placa frontal e prenda a caixa de rizos. (D) Preencha a caixa de rizobox inclinando-a para a frente para que as partículas mais finas caiam sobre a superfície removível para obter uma superfície lisa, como na foto. (E) Alternativamente, preencha a estrutura coberta da caixa de rizos (A) pelo lado aberto, nivele-a com a placa removível e depois cubra-a com membrana nucleófora, papel plástico e a placa frontal. (F) Configuração final da caixa de rizos, regada e plantada. Um procedimento alternativo de preenchimento é mostrado em Wagner et al. (2020). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: O arquivo inclui detalhes sobre o script R usado para gerar um mapa de calor. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O método de amostragem carboxilados descrito aqui utiliza hidrogéis ZrOH, para os quais a preparação e manuseio adequados do gel são críticos. Para manusear hidrogéis ZrOH, recomendamos mantê-los úmidos com algumas gotas de água de grau laboratorial. Durante a preparação, é importante moldar o gel rapidamente após preparar a mistura em gel (passo 1.1.3) e garantir que não formem bolhas entre as placas de vidro. Bolhas localizadas no centro do hidrogel ZrOH são particularmente críticas, pois podem interferir na amostragem. Em contraste, bolhas nas bordas podem ser removidas aparando o gel antes da aplicação. Além disso, carboxilatos liberados pela raiz se ligam ao ZrOH precipitado nos hidrogéis, tornando essencial uma distribuição uniforme de Zr durante a precipitação. Distribuição desigual de Zr dentro do gel pode levar à difusão lateral dos carboxilatos, o que distorce sua distribuição espacial e compromete a confiabilidade da localização^{2D 26}. Uma distribuição uniforme do Zr pode ser alcançada imergindo os géis de poliacrilamida em uma solução ZrOCl₂·8H_2Opor mais de 2 h em um béquer mais largo e colocando menos géis¹² (passo 1.2.3). Além disso, a distribuição do Zr pode ser verificada usando microscopia eletrônica de varredura (SEM, S-3400N II, Hitachi, Japão), conforme recomendado por Guan et ^al.14, que desenvolveram os hidrogéis ZrOH. No entanto, o SEM não é viável como procedimento padrão para amostras enormes.

Outro passo crítico diz respeito ao preenchimento do rhizobox, aplicação da membrana do nucleporo e rega antes da aplicação do gel para amostragem de carboxilato. Cuidado especial deve ser tomado ao preencher e manusear solos arenosos ou argilosos pesados para garantir uma superfície uniformemente lisa, essencial para o contato adequado do gel, mantendo condições bem drenadas. Uma superfície lisa também é essencial para a fixação adequada da membrana do nucleporo. É crucial estabelecer um bom contato entre a raiz e o hidrogel ZrOH, garantindo que a membrana do nucleporo adera corretamente à superfície do solo com o mínimo de bolhas de ar. Antes da aplicação do gel ZrOH, também é crucial saturar o solo corretamente para que o hidrogel ZrOH possa ser firmemente fixado, plano e mantido úmido para preservar sua integridade durante a amostragem. Ao cortar o gel para mapeamento carboxilado 2D, obter cortes com precisão milimétrica pode ser desafiador; portanto, recomendamos não ir abaixo de uma resolução de 2 x 2 mm. Além disso, como os géis encolhem ao secar, é essencial mantê-los úmidos após a amostragem para preservar sua integridade (passo 3.12). O método atual foi adaptado de Tiziani et ^al.12 , que recomendaram o uso de_{NaN 3} como inibidor microbiano para prevenir a degradação dos carboxilatos. Neste protocolo, não utilizamos inibidores microbianos, que são comumente usados para amostragem de exsudatos radiculares (_{NaN 3} ou micropur, um material à base de_{AgCl 3})²³, devido à sua interferência nos métodos analíticos e aos potenciais efeitos no sistema IC-MS.

Até o momento, o método foi validado apenas para sete carboxilatos (aconato, citrato, fumarato, lactato, malato, oxalato, succinato), enquanto o exúdomo radicular compreende uma mistura complexa de compostos (por exemplo, fenólicos, aminoácidos, carboidratos e carboxilatos). Esses outros compostos importantes atualmente não estão contabilizados no método, nem os hidrogéis ZrOH foram caracterizados para amostragem. A presença de outros oxiônions no solo (como fosfato, nitrato) pode afetar a absorção, capacidade e elução de carboxilato, bem como a quantificação de carboxilato em IC ou HPLC. Além disso, amostrar sistemas radiculares inteiros muito grandes de plantas maiores (por exemplo, árvores ou arbustos) pode ser muito desafiador devido às dificuldades na produção de hidrogéis ZrOH muito grandes (>30 cm). Isso, no entanto, é um problema em todas as técnicas atuais de amostragem^{de exsudatos.} Outra limitação é o uso de rizoboxes. Embora o crescimento das plantas em rizoboxes seja muito mais realista do que em sistemas^{hidropônicos 8}, permanece um sistema artificial, com espaço tridimensional limitado para o desenvolvimento das^{raízes 33}. Além disso, a amostragem ocorre em uma superfície 2D, o que teoricamente poderia resultar na perda de carboxilatos exalados em outras direções não em contato com os géis. No entanto, essa limitação poderia ser mitigada por difusão, maior capacidade de ligação dos hidrogéis ZrOH para os carboxilatos e alto teor de água do solo da rizosfera durante a aplicação. No entanto, validações adicionais são necessárias para determinar esses aspectos.

O método de hidrogel ZrOH de amostragem de carboxilatos liberados por raízes oferece várias vantagens em relação aos métodos comumente usados (ou seja, abordagens híbridas solo-hidropônica e hidropônicas). Essa abordagem inovadora permite amostragem in situ de carboxilatos de sistemas radiculares não perturbados no solo, amostragem com resolução temporal (Santner, Mühlbacher et al., dados não publicados) e mapeamento 2D em escala mm. Além disso, hidrogéis ZrOH podem ser empregados nas raízes por pelo menos 24 h¹². Além disso, a amostragem repetida do mesmo segmento radicular por períodos mais longos com resolução temporal deve ser possível. Este método é muito melhor desenvolvido e caracterizado do que métodos similares, como a aplicação de papel filtro⁸. A amostragem por um longo período é possível com os hidrogéis ZrOH devido à alta capacidade de gel para carboxilatos, por exemplo, a menor de 0,44 μmol ^cm-2 ± 0,04 μmol cm⁻² para o malato até a máxima de 1,66 μmol ^cm-2 ± 0,10 μmol cm⁻² para succinato a pH 4,00, com um total de 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol cm⁻² quando os carboxilatos são misturados (veja a Tabela Suplementar 1). Omitir a etapa de lavagem de raízes (que normalmente leva 20–30 minutos por planta) no método híbrido solo-hidropônica reduz significativamente o dano ao sistema radicular e o viés associado, resultando em dados mais realistas e representativos.

Notavelmente, os hidrogéis ZrOH carregados não requerem condições especiais de armazenamento, apenas refrigeração, e não encontramos pré-concentração necessária após a elusão em nossas aplicações até agora. Hidrogéis ZrOH também se ligam a outros ânions, que são eluídos nas mesmas condições e podem ser analisados por IC^14,34. Isso permite ligar a exudação carboxilada à distribuição espacial de nutrientes na^{rizosfera 29}.

Em conclusão, essa abordagem inovadora de amostragem de carboxilatos liberados pelas raízes é um passo fundamental para a pesquisa da rizosfera. Como os carboxilatos desempenham um papel crucial na mobilização e aquisição de nutrientes das plantas (por exemplo, P, Fe)^35,36, bem como no recrutamento de microrganismos benéficos, esse método pode ser usado para selecionar variedades quanto a características radiculares e melhoramento de plantas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanol	Sigma-Aldrich		70%
Ácido oxálico	Sigma-Aldrich	194131-250G	98%
ácido trans-aconítico	Sigma-Aldrich	122750-25G	98%
Octahidratado de óxido de dicloreto de zircônio (ZrOCl2 & times 8H2O, 98%)	Termo Científica	A12342.22	98%
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich	C83155-500G	99%
Nitrato de sódio	VWR Chemicals	Lote nº: 19H224150	100%
Ácido nítrico (HNO3)	Sigma-Aldrich	CAS-No: 7697-37-2	>65% para análise EMSURE® Reag. Ph Eur,ISO
Ácido fúmarico	Sigma-Aldrich	240745-100G	>99%
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	S8045-500G	≥ 98%
Persulfato de acômio (APS_(NH4)2S2O8)	Termo Científica	201531000	≥ 98,0%, extra puro, para eletroforese
Ácido succínico	Sigma-Aldrich	S3674-100G	≥ 99%
Tamponador de ácido 2-(N-morfolino)-etanolsulfônico (MES)	Sigma-Aldrich	M8250-250G	≥ 99.5%
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	71376-1KG	≥ 99.5%
Reticulador	DGT Research Ltd (Lancaster, Reino Unido)	NA	2%, derivada de agarose
Shaker de placa ou horizontal			Any
Cromatografia iônica ou IC-MS	Thermo Fischer Scientific	NA	Qualquer cromatografia líquida de alto ou ultra desempenho (HPLC ou UHPLC) pode ser empregada em combinação com vários detectores, incluindo detectores avançados de MS (por exemplo, tempo de voo ou Orbitrap) ou detectores espectrofotométricos
Medidor de pH			Qualquer eletrodo de pH de laboratório pode ser usado
Forno	Fichário	NA	Qualquer forno pequeno que mantenha uma temperatura específica pode ser usado, de preferência um menor.
Nylon filters_13 mm 0,45 & micro; M	Tecnologia de Filtro GVS	Lote nº: 7135431	Filtros de nylon maiores também podem ser usados, mas menores são preferidos, pois o volume de eluado é pequeno.
Diidrato de sulfato de cálcio	Sigma-Aldrich	C3771-1KG /CAS-No: 10101-41-4	CaSO4 também pode ser utilizado.
Solução de acrilamida, 40%	G-Biosciences	786-508	Não use solução de acrilamida misturada com  Bi-acrilamida. Composto tóxico que deve ser manuseado com cuidado em uma capela de fumo.
Rhizoboxes	https://www.rhizosphere.com/	NA	Nossas rhizoboxes são feitas sob medida com base no design do Rhizosphere.com
Kit de frascos de polipropileno, 1,5 mL	Termo Científica	79812	Frascos plásticos de IC são preferidos, pois podem ser congelados sem quebrar. 330 & micro; L também pode ser usado, mas é preciso ter cuidado para garantir que não haja bolhas de ar
ácido cis-acônico	Termo Científica	A16010.06	Tech. 85%
N,N,N',N'- tetrametiletilediamina (TEMED)	Sigma-Aldrich	Número de Lote: BCBN1173V	Composto tóxico que deve ser manuseado com cuidado
Frascos PP de 250 mL	Sarstedt	Lote nº: 2406082
Papel alumínio	Supermercado local	NA
Beakers_1 L/ 2 L
Grampos	Armazém local	NA
Placa de vidro (6,1 x 17 x 0,4 cm)	Armazém local	NA
L-(-)-Ácido málico	Sigma-Aldrich	M6413-25G
Padrão de lactato para CI	Sigma-Aldrich	07096-100ML
Banco de fluxo laminar
Ácido L-lático anidro	Termo Científica	L13242.14
Gravação de Núcleoporo Membrane_0.2 & micro; m	Cytiva	Lote nº: A29983896
Papel alumínio/sacos plásticos	Armazém local	NA
Pinça de plástico	Semadeni	602
Placa de plexiglass	Armazém local	NA
Frascos PP de 30 mL	Spa Aptaca	Lote nº: 250552
PTFE spacer_0,25/0,4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
Lâminas de barbear	Armazém local	NA
Governante	Livraria local	NA
Hipoclorito de sódio (NaClO)	Reagentes CARLO ERBA	CAS-No: 7681-52-9
Syringes_1 mL	HENKE SASS WOLF (HENKE-JET)	Lote nº: 22A17C8
Fita isolante de vinil	Armazém local	NA