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Artigo de método

Recuperação pós-operatória e estabilidade da gravação crônica intracranial de eletroencefalografia multieletrodo em ratos

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DOI:

10.3791/69937

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24 de abril de 2026

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1Core Facility Center, Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Intensive Care Unit, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 3Department of Neurosurgery, Anesthesiology, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 4First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 5Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 6Institute of Heart Lung and Blood Vessel Disease, Beijing Key Laboratory of Precision Medicine of Coronary Atherosclerotic Disease, Clinical center for coronary heart disease, Capital Medical University, 7Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University, 8Department of Physiology, Amsterdam University Medical Centre

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo descreve uma estrutura padronizada para avaliação pós-cirúrgica após implantação crônica de EEG multieletrodo em ratos, incluindo monitoramento sequencial da qualidade do sinal, recuperação comportamental e marcadores neuroinflamatórios para determinar o início adequado de registros estáveis de longo prazo.

Resumo

A implantação intracraniana de múltiplos eletrodos permite a aquisição simultânea de sinais neurais entre regiões cerebrais, mas introduz perturbações pós-cirúrgicas que podem afetar a qualidade dos dados e o tempo experimental. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho padronizado para implantação crônica de eletrodos intracranianos em múltiplos locais e avaliação estruturada pós-implantação em ratos de Sprague–Dawley. Eletrodos de fio de tungstênio são implantados estereotaticamente em três locais intracranianos predefinidos (córtex cingulado anterior, hipocampo CA1 e córtex entorrinal), utilizando uma estratégia cirúrgica projetada para minimizar a perturbação tecidual.

Após a implantação, o protocolo especifica avaliação longitudinal em cinco domínios: precisão da localização de eletrodos, integridade do potencial local de campo, comportamento relacionado à dor, comportamento alimentar e marcadores neuroinflamatórios. Avaliações eletrofisiológicas e comportamentais são realizadas em pontos pré-definidos do tempo pós-operatório (dias de base e pós-operatório 1, 4, 7, 10 e 13) para apoiar o monitoramento consistente dos efeitos pós-cirúrgicos iniciais (n = 3). Análises histológicas são usadas para caracterizar as respostas locais dos tecidos ao final do estudo (n = 3 por ponto temporal).

Critérios operacionais e intervalos de avaliação são fornecidos para orientar decisões sobre prontidão experimental e início de registros de longo prazo. Esse protocolo oferece uma abordagem estruturada para o monitoramento pós-implantação e informa o momento adequado dos experimentos neurofisiológicos posteriores.

Introdução

A eletroencefalografia intracraniana (EEG) permite a medição de alta resolução da atividade neural ao registrar sinais diretamente do tecido cerebral 1,2, oferecendo vantagens em especificidade espacial e fidelidade de sinais em relação às abordagens EEG do couro cabeludo3. Registros intracranianos em múltiplas regiões oferecem insights sobre interações em nível de rede, amplamente utilizadas para investigar a dinâmica neural subjacente à cognição e doença e são comumente implementadas em modelos de roedores para estudos mecanicistas elongitudinais 4,5.

Eletrodos de fio de tungstênio são comumente usados para gravações crônicas devido à sua estabilidade mecânica ebiocompatibilidade 6,7,8. No entanto, a implantação requer cirurgia invasiva que pode temporariamente perturbar a fisiologia neural, a integridade dos tecidos e o comportamentoanimal 9,10,11. Desafios como estresse cirúrgico agudo, inflamação local, respostas gliais e mudanças no comportamento alimentar ou nociceptivo podem influenciar a qualidade do sinal e a interpretação experimental durante o período pós-implantaçãoinicial 12,13,14. No entanto, esse período de recuperação permanece em grande parte empírico, com janelas relatadas de recuperação variando de 5 a 7dias 15,16. Atrasos prolongados, por outro lado, podem introduzir confusões adicionais relacionadas à remodelação do tecido ou ao deslocamentode eletrodos 17.

Apesar do uso generalizado do EEG intracraniano crônico, não existe um quadro padronizado para monitoramento pós-implantação que integre avaliações eletrofisiológicas, comportamentais, inflamatórias e histológicas para informar o tempo experimental. Portanto, o protocolo atual aborda essa lacuna delineando uma abordagem estruturada para avaliar o status pós-implantação em um modelo crônico de implantação intracraniana multieletrodo em ratos Sprague–Dawley (SD) anestesiados (6 semanas de idade). Utilizando eletrodos de fio de tungstênio implantados no córtex cingulado anterior (Cg1), hipocampo CA1 e córtex entorhinal (CE), o protocolo especifica avaliação longitudinal da estabilidade dos eletrodos, características do sinal de EEG, indicadores comportamentais e marcadores inflamatórios ao longo de um período de duas semanas. Embora as avaliações sejam realizadas sob anestesia geral para conveniência prática, essa abordagem não afeta o objetivo principal de estabelecer uma estrutura para implantação e estabilidade de eletrodos. Esse protocolo visa orientar o monitoramento pós-cirúrgico e apoiar a determinação consistente de pontos de tempo apropriados para iniciar estudos neurofisiológicos posteriores.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais da Capital Medical University (ID de aprovação: AEEI-2024-391).

1. Preparação animal

  1. Obtenha ratos machos SD de 6 semanas (peso corporal 220–230 g). Aloje os animais em um ambiente específico livre de patógenos (24 ± 2 °C, 50 ± 10% de umidade, 12 horas de ciclo claro/escuro). Forneça alimento e água ad libitum. Aclimate os ratos por 7 dias antes da cirurgia.
  2. Após a implantação do eletrodo, os ratos domésticos individualmente sob as mesmas condições ambientais para evitar danos ao estágio superior.
    NOTA: O fluxograma do estudo e as medições correspondentes são apresentados na Figura 1A. Reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

2. Cirurgia de implante multieletrodo

  1. Anestesiar ratos com isoflurano (3–4% de indução, 2% de manutenção) administrado com oxigênio a 2 L/min.
  2. Coloque o rato em uma estrutura estereotáxica e mantenha a temperatura corporal em 37 °C usando uma almofada térmica controlada por termostato. Aplique pomada oftálmica de eritromicina para evitar o ressecamento da córnea.
  3. Raspe o couro cabeludo e desinfete com solução de iodóforo 0,5%.
  4. Realize uma incisão no couro cabeludo médio (1 × 2 cm) para expor o crânio e remova delicadamente o periósteo usando cotonetes estéreis.
  5. Preparação e perfuração do crânio
    1. Identifique bregma e lambda e nivele o crânio tanto nos planos anterior-posterior quanto medial-lateral.
    2. Perfure furos de rebarba (≤2 mm de diâmetro) nas coordenadas alvo usando uma furadeira dentária de baixa velocidade com irrigação intermitente por soro.
  6. Preparação e inserção de eletrodos
    1. Use eletrodos de fio de tungstênio isolados com poliimida (diâmetro da haste: 300 μm) com comprimento de ponta exposta de 4–8 mm (extremidade cortada ao ras). Meça a impedância do eletrodo (| Z|) a 1 kHz; valores aceitáveis variam de 7–10 kΩ com ângulo de fase variando de 1°–2°.
    2. Insira lentamente eletrodos nas seguintes regiões: Cg1 (córtex cingulado anterior): AP +1,2 mm, ML −0,2 mm, DV −2,4 mm; CA1 (hipocampo): AP −3,3 mm, ML −1,8 mm, DV −3,0 mm; EC (córtex entorrinal): AP −6,7 mm, ML −4,0 mm, DV −8,0 mm.
    3. Implante um parafuso de crânio de aço inoxidável sobre a região contralateral CA1 e use-o como eletrodo de terra.
  7. Fixação e fechamento de eletrodos
    1. Verificar a profundidade e direcionamento corretas dos eletrodos usando coordenadas estereotáxicas durante a implantação; confirmar a localização do eletrodo post hoc por meio da identificação histológica das trilhas dos eletrodos.
    2. Fixe eletrodos e parafusos usando resina dentária (cure de 30 a 60 s por camada).
    3. Conecte os eletrodos a um conector de headstage e suture a pele ao redor.
  8. Registre a atividade inicial do EEG por 30 minutos no momento correspondente (Figura 1A) mantendo a anestesia.

3. Cuidados pós-operatórios e manuseio

  1. Deixe os ratos se recuperarem em uma almofada térmica até estarem totalmente andando.
  2. Ratos domésticos sob temperatura e umidade controladas, com cama macia e acesso improvisado a comida e água para mitigar o estresse.
  3. Inspecione diariamente os locais das incisões, a estabilidade dos eletrodos e a integridade da cabeça do estádio.
  4. Animais domésticos individualmente, fornecer cuidados diários de feridas (solução de iodóforo 0,5%) e monitorar o bem-estar sem agentes farmacológicos para evitar efeitos de confusão, em linha com estudosanteriores 6,18.

4. Registro longitudinal de EEG

  1. Realize gravações de EEG nos dias 1, 4, 7, 10 e 13 após a implantação.
  2. Anestesiar ratos com isoflurano (3–4% de indução, 1,5% de manutenção).
  3. Estabilize os cabos de gravação para minimizar artefatos de movimento e ruído eletromagnético.
  4. Registre o EEG por 30 minutos a partir das 9h para controlar a variabilidade circadiana.
  5. Use os seguintes parâmetros de aquisição: taxa de amostragem: 1.000 Hz; filtro passa-banda de hardware: 0,5–40 Hz; ganho: 8–10. Realize filtragem adicional e rejeição de artefatos offline.
  6. Sinais de EEG aceitáveis apresentam linhas de base estáveis, ruído ou deriva mínimos e conteúdo fisiologicamente plausível em amplitude e frequência; excluam gravações que não atendem a esses critérios.

5. Análise de sinais de EEG

  1. Analise sinais de EEG usando o software referenciado.
  2. Inspecione visualmente os sinais e remova segmentos com movimento ou artefatos elétricos.
  3. Calcule a densidade espectral de potência (PSD) usando FFT (função pwelch).
  4. Quantifique a atividade oscilatória calculando a área sob a curva PSD (AUCpsd) para faixas de frequência predefinidas.
  5. Calcule a relação sinal-ruído (SNR) como a razão de potência na banda de sinal alvo (0,5–40 Hz) para a banda de ruído de fundo (40–80 Hz).
    NOTA: Sinais estáveis exibem perfis PSD consistentes ao longo de dias consecutivos de gravação.

6. Avaliação da dor

  1. Avalie a dor usando a Escala de Careta de Rato19,20 um dia antes da cirurgia (linha de base) e em todos os dias de registro.
  2. Use uma câmara de observação (25 cm × 15 cm × 15 cm) e posicione a câmera no canto superior esquerdo em um ângulo de 45°.
  3. Capture imagens faciais, randomize a ordem das imagens e marque o aperto orbital, achatamento do nariz/bochecha, mudanças de bigode e posição da orelha (escala 0–2).
  4. Soma as pontuações para gerar uma pontuação total de dor por animal por ponto de tempo.

7. Comportamento alimentar e peso corporal

  1. Pese ratos e meça a ingestão diária. Calcule a ingestão subtraindo o restante da comida pré-pesada após 24 horas.
  2. Grave o comportamento do rato continuamente por 24 horas usando um sistema de gravação de vídeo. Analise o comportamento alimentar offline por experimentadores cegos para as condições experimentais.
  3. Monitore a alimentação continuamente. Defina um episódio de alimentação como ≥1 evento que dura de 5 s–15min 21.
  4. Calcular a ingestão ajustada pelo peso corporal (g × 100/g de peso corporal); média de ingestão por refeição (g/número de eventos de refeição); e a taxa de ingestão (g/duração total da alimentação em mínimo).

8. Avaliação de neuroinflamação

  1. Eutanasia ratos usando uma overdose de isoflurano seguida de decapitação.
  2. Colete tecido cerebral de hemisférios implantados no início e pós-operatório nos dias 1, 4, 7, 10 e 13 (n = 3 por ponto de tempo).
  3. Western blot
    1. Extraia proteína total do tecido cerebral e quantifique a concentração de proteína usando um ensaio de ácido bicincônico (BCA). Ajuste todas as amostras para uma concentração final de 2 μg/μL e desnaturalize a 100 °C por 5 minutos.
    2. Separe as proteínas por 10% de SDS-PAGE a 120 V por 90 min, carregando 20 μg de proteína por pista.
    3. Transfira proteínas para uma membrana PVDF a 300 mA por 1 hora.
    4. Bloqueie as membranas e incube durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e a interleucina-6 (IL-6) (1:1.000).
    5. Incubar com anticorpo secundário conjugado com HRP (1:20.000, 2 h, temperatura ambiente).
    6. Visualize as bandas usando ECL e imagem com um sistema de imagem quimioluminescência usando o modo de exposição automática.
    7. Realize densitometria usando o ImageJ.

9. Segurança e descarte de resíduos

  1. Manuseie o isoflurano usando um sistema ativo de saqueio.
  2. Descarte objetos cortantes e tecidos biológicos em recipientes designados para riscos biológicos.
  3. Descarte reagentes químicos conforme as normas institucionais de segurança.

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Resultados

Todos os 21 ratos SD toleraram a implantação intracraniana de eletrodo e completaram o protocolo do estudo. Medidas longitudinais (EEG, peso corporal, comportamento alimentar e escores de dor) foram coletadas dos mesmos animais em vários momentos (n = 3), enquanto as avaliações neuroinflamatórias foram medidas terminais em cada momento (n = 3 ratos por dia: linha inicial, 1, 4, 7, 10, 13). Os dados foram avaliados quanto à normalidade usando testes de Shapiro-Wilk. Os dados normalmente d...

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Discussão

A implantação crônica de eletrodos intracranianos para monitoramento de EEG em roedores permanece uma técnica fundamental para investigar dinâmicas neurais em alta resolução temporal. Estabelecer uma janela adequada de monitoramento pós-operatório e recuperação é fundamental para garantir tanto a confiabilidade do sinal quanto o bem-estar animal. Este estudo fornece uma estrutura estruturada para avaliar a estabilidade eletrofisiológica, os resultados comportamentais e as respostas infla...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pelo Projeto de Jovens Talentos Excelentes da Capital Medical University (A2308).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema ativo de recaptação isofluoranaRDWR510-31-6
AnimaisRio Charles
Kit de ensaio BCASolarbioPC0020
Sistema de Imagem ChemiDocBio-Rad17001401
Resina dentáriaVérticeXG473P03
Reagente de detecção ECLSolarbioPE0010
Pomada ocular com eritromicinaRenhe1.00E+11
Anticorpo secundário anti-coelho de bodeProteintechSA00001-2
GraphPad Prism 9.0GraphPad SoftwareSoftware de análise estatística
Amplificador de headstageBIOPAC Systems IncEEG100C
Bolsa térmicaTecnologia YuYanS-100
ImageJInstitutos Nacionais de SaúdeSoftware de análise de imagens
Anticorpo policlonal IL-6Proteintech21865-1-AP
IodóforoCleanboom430-DFXDY100
IsofluranoRWDR510– 31
Dispositivo de gravação neuro com NeuroExplorer (v 5.012)PlexãoOPX-A1600-128-16CSoftware de análise de dados eletrofisiológicos
Membrana PVDFCytivaRPN303F
Sistema SDS-PAGEBio-Rad1658004
Aparelho estereotáxicoTecnologia científica ZhongShiZS-PDC
TNF-&alfa; Anticorpo policlonalProteintech17590-1-AP
Aparelho de TransferênciaBio-Rad1703937
Fio de tungstênioSistemas A-M785500
Sistema de gravação de vídeoBasleracA1920
Anticorpo monoclonal β-actinaProteintech2D4H5

Referências

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