Method Article

Impacto de Diferentes Métodos de Extração nos Perfis de Bioatividade In Vitro de Terfezia Claveryi

DOI:

10.3791/69950

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Genetics and Bioengineering, Faculty of Engineering and Architecture, Kirsehir Ahi Evran University, 3Department of Physiology, Gulhane Faculty of Medicine, University of Health Sciences, 4Department of Medical Services and Techniques, Medical Laboratory Techniques Program, Vocational School of Health Services, Kirsehir Ahi Evran University, 5Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Kirsehir Ahi Evran University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A bioatividade in vitro dos extratos de Terfezia claveryi dependia do método biofísico de extração e da polaridade do solvente. O extrato de água da extração assistida por maceração (MAE) apresentou a maior atividade antioxidante, enquanto o extrato de extração Soxhlet (SE) induziu maior citotoxicidade nas células SH-SY5Y. Esses resultados demonstram diferenças claras dependentes do método na bioatividade in vitro dos extratos de Terfezia claveryi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terfezia claveryi é uma trufa comestível do deserto, tradicionalmente consumida em regiões áridas. Nos últimos anos, tem despertado crescente interesse científico devido às suas potenciais propriedades antioxidantes, antimicrobianas e terapêuticas, sugerindo possíveis aplicações em áreas relacionadas à alimentação e saúde. No entanto, apesar das crescentes evidências de seu potencial biológico, a influência de diferentes estratégias de extração na recuperação de compostos bioativos e o perfil de bioatividade in vitro resultante de Terfezia claveryi ainda não foi esclarecida na literatura. Neste estudo, foi avaliada a bioatividade in vitro dos extratos de Terfezia claveryi obtidos utilizando diferentes métodos de extração e solventes com polaridade variável. O rendimento da extração foi determinado, e os extratos obtidos foram avaliados quanto a atividades antioxidantes, antimicrobianas, antibiofilmadas e citotóxicas, utilizando sistemas de teste estabelecidos. A capacidade antioxidante foi medida usando testes de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH), 2,2′-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) (ABTS) e poder antioxidante redutor férrico (FRAP), enquanto efeitos citotóxicos foram investigados em células neuroblastoma SH-SY5Y. O rendimento da extração variou dependendo tanto do método quanto da polaridade do solvente, sendo o maior rendimento obtido do extrato aquoso preparado pelo método de extração assistida por ultrassom (EAU) (18,40%). Foi determinado que a atividade antioxidante apresentava diferenças significativas dependendo do método de extração, e extratos aquosos obtidos pelo método de extração assistida por maceração (MAE) apresentavam um perfil rico em compostos fenólicos, além da maior capacidade de captura de radicais. A análise LC-MS/MS deste extrato revelou a presença de nove compostos fenólicos; O ácido quínico e o ácido clorogênico foram identificados como os componentes dominantes. Em contraste, extratos derivados de Soxhlet induziram efeitos citotóxicos maiores em células SH-SY5Y. As respostas antimicrobianas e antibiofilmes apresentaram variação relativamente limitada entre os métodos de extração, indicando uma dependência menor da estratégia de extração para essas atividades. No geral, esses achados demonstram que o método biofísico de extração e a seleção do solvente são determinantes críticos do perfil de bioatividade in vitro dos extratos de Terfezia claveryi , com efeitos pronunciados observados para atividades antioxidantes e citotóxicas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O uso de várias espécies de cogumelos para melhorar a saúde e prevenir e tratar doenças remonta àantiguidade 1,2,3. Os macrofungos geralmente são classificados em dois grupos: epígeus (cogumelos) e hipogeos (trufas). Conhecida como trufa do deserto, Terfezia claveryi (T. claveryi) é uma espécie de trufa mundialmente renomada e comestível, pertencente ao gênero Terfezia5. T. claveryi é comumente distribuído em regiões áridas e semiáridas, onde as espécies de Helianthemum sãoprevalentes 6,7,8,9,10,11. Nos últimos anos, a carga global de doenças crônicas como câncer e distúrbios neurodegenerativos aumentou significativamente, destacando a necessidade urgente de novos agentes terapêuticos seguros e eficazes. De acordo com relatórios globais de saúde, o câncer continua sendo uma das principais causas de morte no mundo, enquanto as doenças neurodegenerativas continuam a aumentar junto com o envelhecimento da população. Diante desse crescente problema de saúde pública, a investigação de produtos naturais derivados de fungos e plantas medicinais como potenciais fontes de compostos bioativos tornou-se uma prioridade importantede pesquisa 12.

Paralelamente, o rápido surgimento da resistência antimicrobiana representa outra grande ameaça à saúde global. A resistência a medicamentos reduziu significativamente a eficácia dos antibióticos tradicionais, criando uma necessidade urgente de estratégias antimicrobianas alternativas13. Metabólitos secundários derivados de fontes naturais, particularmente compostos fenólicos e polifenólicos, estão atraindo interesse crescente devido aos seus diversos mecanismos antimicrobianos e baixa tendência a desenvolver resistência14. O estresse oxidativo é um fator mecanicista fundamental subjacente a muitas doenças crônicas, incluindo câncer, distúrbios neurodegenerativos e síndromes metabólicas. A produção excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) pode, em última análise, prejudicar a homeostase celular ao causar danos ao DNA, peroxidação lipídica e oxidação de proteínas. Nesse contexto, antioxidantes naturais capazes de absorver radicais livres e regular o equilíbrio redox são considerados agentes promissores para mitigar danos oxidativos e progressãoda doença 15.

As trufas são ricas em ácidos graxos insaturados, proteínas, minerais, vitaminas, aminoácidos, fenólicos e polifenóis, componentes que têm sido associados a propriedades antimicrobianas, antioxidantes eanticancerígenas 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Sua capacidade antioxidante tem sido associada à sua eficácia na captura de radicais livres 25,26,27. Entre as espécies de trufas, T. claveryi é particularmente notável devido à sua estrutura comestível, valor econômico regional e riqueza relatada em compostosfenólicos 23. Apesar das evidências emergentes sobre seu consumo tradicional e atividade biológica, estudos abrangentes que investigam como as estratégias de extração afetam sua composição química e seus efeitos biológicos permanecem limitados.

A recuperação de compostos biologicamente ativos a partir de trufas é fortemente influenciada pelos parâmetros de extração, incluindo a técnica de extração aplicada e a polaridade do solvente. Métodos biofísicos de extração como extração assistida por ultrassom (EAU), extração assistida por maceração (MAE) e extração Soxhlet (SE) apresentam diferenças significativas em termos de entrada de energia, eficiência de extração e seletividade para compostospolares 28. No entanto, a maioria das pesquisas tem se baseado em um único método de extração ou em sistemas solventes limitados, e estudos que abordam comparativamente os efeitos desses métodos no perfil de atividade biológica in vitro de T. claveryi são limitados. Portanto, este estudo compara sistematicamente múltiplos métodos de extração biofísica usando solventes de polaridades variadas para avaliar as atividades biológicas in vitro dos extratos de T. claveryi . Foi hipotetizado que o método de extração e a polaridade do solvente levariam a diferenças dependentes do método nas atividades biológicas. Assim, os objetivos do estudo são: (i) comparar os rendimentos de extração entre diferentes métodos e solventes, (ii) avaliar a variação dependente do método nas atividades antioxidantes e citotóxicas, e (iii) examinar as respostas antimicrobianas e antibiofilmes, considerando sua sensibilidade à estratégia de extração.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: O fluxo de trabalho experimental geral para a preparação e análise dos extratos de T. claveryi está resumido esquematicamente na Figura 1. Todos os materiais utilizados no estudo são descritos na Tabela de Materiais.

1. Autenticação e preparação de materiais fúngicos

  1. Coleta e processamento de materiais
    NOTA: Trufas T. claveryi frescas foram coletadas em maio de 2023 em estepes e terras arenosas, não cultivadas (não agrícolas) na Província de Kırsehir, Anatólia Central, Turquia. A amostragem foi realizada em três locais distintos: Vila Dedeli (38°54′15,8" N, 34°06′40,3" E; ~1050 m acima do nível do mar), Vila Buyukkayapa (38°53′45,1" N, 34°19′37,5" E; ~1020 m acima do nível do mar) e Vila Akcaagıl (39°01′39,9" N, 34°12′39,8" E; ~1100 m acima do nível do mar). Os locais de coleta são caracterizados por um clima continental semiárido, com invernos frios, verões quentes e secos, e uma precipitação anual média de aproximadamente 380–420 mm. Todas as amostras foram colhidas durante a temporada natural de frutificação em áreas sem atividade agrícola recente para minimizar a possível contaminação antropogênica.
    1. Selecione trufas limpas e intactas, descasque e lave três vezes com água destilada.
    2. Fatie as amostras em pedaços pequenos e seque à sombra até atingir um peso constante (aproximadamente 20 dias).
    3. Pulverize o material seco usando um moedor mecânico e passe por uma peneira de 328 micrômetros (50 malhas).
    4. Armazene as amostras processadas em sacos zip-lock em um ambiente fresco, seco e escuro, em temperatura ambiente, até análises adicionais.
  2. Identificação molecular de T. claveryi
    1. Isolar DNA genômico de amostras secas de T. claveryi para identificação molecular.
    2. Avalie a quantidade e pureza do DNA espectrofotometricamente.
    3. Realize a reação em cadeia da polimerase (PCR) de identificação de espécies amplificando a região do espaçador interno transcrito (ITS) usando os primers universais ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).
    4. Resolver os produtos de amplificação por PCR por eletroforese em um gel de agarose a 1,5% preparado em 1x tampão TAE e visualizado sob iluminação UV após coloração com brometo de etídio.
    5. Purifique produtos de PCR de banda simples conforme as instruções dofabricante 29. Sujeitem amplicões purificados ao sequenciamento Sanger.
    6. Monte as leituras de sequências diretas e reversas em sequências de consenso usando o algoritmo contig assembly programme (CAP).
    7. A identidade da espécie foi confirmada pela comparação da sequência consensual de ITS com as sequências de referência disponíveis em bancos de dados públicos.
      NOTA: Uma amostra voucher de T. claveryi foi mantida na coleção laboratorial para referência futura. A identificação da espécie foi confirmada por análise molecular baseada em ITS (Arquivo Suplementar 1).

2. Preparação e extração de materiais fúngicos

  1. Preparação dos extratos de T. claveryi
    1. Pesa aproximadamente 30 g de pó seco de T. claveryi .
    2. Adicione 150 mL de solvente (metanol, acetona, n-hexano, acetato de etil ou água destilada) para manter uma proporção sólido–líquido constante em todos os métodos de extração.
    3. Use solventes de grau analítico para todos os procedimentos de extração.
    4. Filtre cada extrato sob pressão reduzida usando papel filtrante qualitativo.
    5. Concentre os filtrados sob pressão reduzida a 30–45 °C usando um evaporador rotativo.
    6. Liofilizar (liofilizar) os extratos concentrados até que a remoção completa do solvente seja alcançada.
    7. Armazene os extratos secos de crude a −20 °C até análise adicional.
      NOTA: Aplique etapas idênticas de processamento pós-extração a todas as amostras para garantir consistência metodológica e comparabilidade.
  2. Métodos de extração biofísica
    1. Extração assistida por maceração (MAE)
      1. Coloque a amostra em pó de T. claveryi em um recipiente de extração fechado.
      2. Adicione o solvente selecionado mantendo uma proporção solvente-sólido constante.
      3. Incube a mistura em temperatura ambiente sob condições escuras por 72 horas.
      4. Mantenha os recipientes fechados para evitar a evaporação do solvente.
      5. Não aplique agitação externa durante o período de maceração.
      6. Deixe a mistura se depositar ao final do período de extração.
      7. Filtre o extrato antes do processamento adicional.
    2. Extração Soxhlet (SE)
      NOTA: Garanta a circulação adequada da água no condensador e evite aquecimento seco durante o refluxo.
      1. Coloque a amostra em pó em um dedal de extração de celulose.
      2. Posicione o dedal dentro da câmara de extração Soxhlet conectada a um frasco de fundo arredondado.
      3. Adicione o solvente selecionado ao frasco mantendo uma proporção constante solvente-sólido.
      4. Aqueça o solvente para refluxo usando um manto de aquecimento controlado termostaticamente.
      5. Mantenha a extração contínua por 24 horas.
      6. Mantenha a temperatura de extração no ponto de ebulição de cada solvente (n-hexano: 68,7 °C; acetato de etil: 77,1 °C; metanol: 64,7 °C; acetona: 56 °C; água destilada: 100 °C).
    3. Extração assistida por ultrassom (EAU)
      NOTA: Monitore a temperatura continuamente para evitar superaquecimento durante a sonicação.
      1. Coloque a amostra em pó de T. claveryi no recipiente de extração.
      2. Adicione o solvente selecionado mantendo uma proporção solvente-sólido constante.
      3. Sonice a mistura em uma frequência fixa de 35 kHz e uma potência de saída de 520 W por 25 minutos.
      4. Mantenha a temperatura de extração em aproximadamente 30 °C.
      5. Adicione gelo em intervalos de 5 minutos para manter a temperatura entre 25 e 28 °C durante a sonicação.
  3. Eficiência de extração
    1. Pese o material fúngico seco (Wp) antes da extração.
    2. Pese o extrato bruto seco (Wext) após a remoção completa do solvente.
    3. Calcule a eficiência de extração usando a Equação (1).
      figure-protocol-1(1)
    4. Dissolver novamente cada extrato bruto seco em seu respectivo solvente para preparar uma solução de estoque em uma concentração padronizada de 10 mg/mL.
    5. Prepare soluções de estoque frescas antes de cada experimento de bioatividade in vitro .
      NOTA: Padronize todas as concentrações dos extratos para garantir dosagem comparável entre ensaios de bioatividade subsequentes.

3. Determinação da atividade antioxidante

  1. Realize análise de atividade antioxidante usando ensaios DPPH, ABTS e FRAP.
  2. Prepare cinco concentrações diferentes de extrato, variando de 0,25 a 1,0 mg/mL a partir de soluções de estoque recém-preparadas.
  3. Realize todas as medições em triplicado para garantir a reprodutibilidade.
  4. Registre os valores de absorção espectrofotometricamente usando um leitor de microplacas.
    NOTA: Realize todos os ensaios de acordo com protocolos estabelecidos na literatura com pequenas modificações.
  5. Atividade de saqueação radical DPPH
    NOTA: A atividade de captura radical DPPH dos extratos de T. claveryi foi avaliada de acordo com o método descrito na literatura, com pequenasmodificações 30. Proteja a solução DPPH e as misturas de reação da exposição à luz.
    1. Prepare uma solução DPPH em metanol a 70%.
    2. Ajuste a solução DPPH para uma absorção de 1,00 ± 0,02 em 517 nm.
    3. Pipete 50 μL de extrato em diferentes concentrações em um poço de microplaca.
    4. Adicione 250 μL de solução DPPH a cada poço.
    5. Incube a mistura de reação no escuro, em temperatura ambiente, por 30 minutos.
    6. Meça a absorvância em 517 nm usando um espectrofotômetro de microplaca.
    7. Use metanol como controle negativo e ácido ascórbico como controle positivo.
    8. Construa curvas dose-resposta e calcule valores IC₅₀ para quantificar a atividade de captura de radicais.
  6. Atividade de saqueação radical catiônica ABTS
    NOTA: Realize o ensaio de eliminação radical ABTS de acordo com o método descrito na literatura, com pequenasmodificações 31. Prepare a solução radical ABTS⁺ pelo menos 16 horas antes do uso e proteja-a da luz.
    1. Gerar a solução radical ABTS incubando a mistura de reação no escuro em temperatura ambiente por 16 horas.
    2. Diluir 1 mL de solução de ABTS com 80 mL de etanol antes da análise.
    3. Ajuste a absorção da solução diluída de ABTS para 0,80 ± 0,02 a 734 nm.
    4. Pipete 50 μL de extrato em diferentes concentrações em um poço de microplaca.
    5. Adicione 250 μL de solução ABTS a cada poço.
    6. Incube a mistura em temperatura ambiente por 10 minutos.
    7. Meça a absorvância a 734 nm usando um espectrofotômetro de microplaca.
    8. Construa curvas dose-resposta e calcule os valores de IC₅₀.
  7. Ensaio de poder antioxidante redutor férrico (FRAP)
    NOTA: Realize o ensaio FRAP de acordo com o método proposto na literatura, com pequenasmodificações 32. Prepare o reagente FRAP de forma fresca antes do uso e proteja a mistura de reação da luz.
    1. Prepare o reagente FRAP de acordo com o protocolo referenciado.
    2. Pipete 20 μL de extrato em diferentes concentrações em um poço de microplaca.
    3. Adicione 280 μL de reagente FRAP recém-preparado.
    4. Incube a mistura de reação em temperatura ambiente, no escuro, por 45 minutos.
    5. Meça a absorção a 593 nm usando um espectrofotômetro de microplaca.
    6. Gerar uma curva de calibração usando Trolox como padrão.
    7. Expresse a capacidade antioxidante em mg de equivalentes Trolox (TE) por grama de extrato.

4. Análise do conteúdo fenólico total (TPC)

NOTA: Determine o teor fenólico total (TPC) dos extratos de T. claveryi usando o método de Folin–Ciocalteu conforme descrito na literatura, com pequenasmodificações 33. Proteja as misturas de reação da luz durante a incubação. Prepare a solução de carbonato de sódio de forma fresca antes do uso.

  1. Prepare soluções extraídas a uma concentração de 1 mg/mL a partir de soluções de estoque recém-preparadas.
  2. Pipete 25 μL de extrato em um poço de microplaca, adicione 75 μL de água destilada e depois adicione 25 μL do reagente Folin–Ciocalteu.
  3. Incube a mistura em temperatura ambiente por 6 minutos.
  4. Adicione 100 μL de solução de carbonato de sódio a 7% (p/v) em cada poço.
  5. Incube a mistura de reação em temperatura ambiente no escuro por 90 minutos.
  6. Meça a absorção a 665 nm usando um espectrofotômetro de microplaca.
  7. Prepare uma curva de calibração usando ácido gálico como padrão e calcule o conteúdo fenólico total, expressando os resultados como mg de equivalentes de ácido gálico (GAE) por mL de extrato.

5. Análise fitoquímica usando LC-MS/MS

NOTA: Realize a análise LC-MS/MS de acordo com métodos cromatográficos previamente publicados com pequenasmodificações 34. Filtre todas as amostras e fases móveis através de filtros de membrana de 0,22 μm e desgasifice as fases móveis antes da análise.

  1. Selecione o extrato que apresentar o maior teor total de fenólico para o perfil fitoquímico quantitativo.
  2. Realize a separação cromatográfica usando uma coluna de C18 em fase reversa mantida a 30°C.
  3. Prepare a fase móvel composta por (A) 0,1% de ácido fórmico em água desionizada e (B) 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila, ajuste a vazão para 0,4 mL/min, ajuste o volume de injeção para 5 μL e ajuste o tempo total de funcionamento para 17 min.
  4. Realizar detecção por espectrometria de massa sob condições de ionização por eletrospray (ESI) usando nitrogênio como gás de secagem, revestimento e nebulização.
  5. Ajuste a temperatura do gás de secagem para 350 °C com vazão de 12 L/min, ajuste a temperatura do gás da camada para 250 °C com vazão de 5 L/min e ajuste a pressão do nebulizador para 55 psi.
  6. Prepare curvas de calibração externas para cada padrão fenólico e quantifique os analitos usando as curvas de calibração correspondentes.

6. Teste de atividade antimicrobiana

NOTA: Avalie a atividade antibacteriana usando o método de difusão do poço de ágar de acordo com protocolos microbiológicos estabelecidos. Realize todos os procedimentos microbiológicos sob condições assépticas em um gabinete de biossegurança. Esterilize todos os materiais antes e depois do uso.

  1. Selecione as seguintes cepas para testes antimicrobianos: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, e Enterobacter aerogenes ATCC 13048.
  2. Inocule cada cepa bacteriana em caldo de soja de triptona (TSB) e incube na temperatura ideal de crescimento até atingir uma densidade óptica de OD₆₀₀ = 0,7.
  3. Espalhe as culturas bacterianas uniformemente sobre placas de ágar de soja com triptona (TSA) usando um swab estéril.
  4. Faça poços assépticos no ágar usando uma broca-de-cortiça estéril.
  5. Adicione 100 μL de cada extrato (100 μg/mL) nos poços correspondentes.
  6. Incube as placas a 37 °C por 18 horas.
  7. Meça os diâmetros das zonas de inibição ao redor de cada poço para avaliar a atividade antimicrobiana.
  8. Realize todos os experimentos em triplicado e expresse os resultados como valores médios.

7. Inibição do biofilme

NOTA: Avalie a atividade anti-biofilme usando um ensaio de coloração violeta cristalina contra cepas bacterianas de referência. Realize todos os procedimentos sob condições assépticas e evite perturbar os biofilmes aderidos durante as etapas de lavagem.

  1. Selecione Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 como cepas de referência e cultive-as em TSB a 37 °C até atingir a fase de crescimento logarítmico.
  2. Ajuste as suspensões bacterianas para uma densidade óptica de OD₆₀₀ = 0,132.
  3. Pipete 100 μL de soluções de extrato (0,625–10 mg/mL) em placas estéreis de microtítulo de poliestireno de 96 poços, adicione 100 μL de suspensão bacteriana a cada poço e misture delicadamente.
  4. Incube as placas a 37 °C por 24 horas. Use poços contendo TSB apenas como blanks e poços contendo suspensão bacteriana sem extrato como controles.
  5. Remova cuidadosamente as células não aderentes, lave os poços duas vezes com água destilada e deixe as placas secarem ao ar.
  6. Adicione 200 μL de solução de violeta cristalina a 0,4% (p/v) em cada poço e incube por 30 minutos.
  7. Remova o excesso de mancha, enxágue os poços duas vezes com água destilada e deixe as placas secarem completamente.
  8. Adicione etanol para solubilizar o corante ligado e meça a absorção a 595 nm usando um leitor de microplacas.
  9. Calcule a atividade do antibiofilme usando a Equação (2).
    figure-protocol-2(2)

8. Análise de cultura celular e atividade citotóxica (ensaio MTT)

NOTA: Avalie os efeitos citotóxicos usando o ensaio MTT de acordo com protocolos padrão de viabilidade celular. Realize todos os procedimentos em condições estéreis em um armário de biossegurança e pré-aqueça o meio e reagentes a 37 °C antes do uso.

  1. Obtenha a linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y de um repositório celular credenciado e cultive as células no meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementadas com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de L-glutamina em25 cm de 25 cm de frascos de cultura.
  2. Mantenha as culturas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e aumente as células até aproximadamente 80% de confluência.
  3. Destacam as células por tripsinização, semeiam-nas em placas de 96 poços com densidade de 2 × 104 células por poço e incubam por 24 horas para permitir a fixação.
  4. Trate as células com extratos de T. claveryi em concentrações de 150, 300, 600, 1200 e 2000 μg/mL e incube por 24 horas.
  5. Remova o meio de cultura, adicione 100 μL de meio fresco contendo 10 μL de solução MTT em cada poço e incube por 4 horas a 37 °C.
  6. Aspire o meio, dissolva os cristais de formazan adicionando 100 μL de dimetil sulfóxido (DMSO) a cada poço e meça a absorção a 570 nm usando um espectrofotômetro de microplaca.
  7. Realize todos os experimentos em triplicado.

figure-protocol-3
Figura 1: Visão geral esquemática do fluxo de trabalho experimental. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

9. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas usando pacotes de software estatístico apropriados e compare grupos de controle e tratamento usando o teste t de Student ou análise bidirecional de variância (ANOVA), conforme apropriado.
  2. Expresse todos os dados como média ± erro padrão da média (SEM).
  3. Defina significância estatística em p < 0,05.
  4. Indique significância estatística em números usando asteriscos da seguinte forma: **** para p < 0,0001, *** para p < 0,001, ** para p < 0,01 e * para p < 0,05, e use "ns" para denotar não significância.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificação molecular de T. claveryi
A amplificação por PCR da região ITS foi realizada usando os primers universais ITS1 e ITS4 para identificação molecular de T. claveryi. As sequências resultantes foram analisadas e comparadas com sequências de referência no banco de dados NCBI usando o algoritmo BLAST, permitindo a identificação definitiva de espécies (Arquivo suplementar 1).

Eficiência de ex...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente estudo estabelece uma plataforma comparativa e padronizada de extração–bioatividade para T. claveryi, demonstrando que a estratégia de extração é um determinante decisivo tanto da composição química quanto da funcionalidade biológica. A principal força metodológica deste protocolo está no controle rigoroso dos parâmetros de extração, particularmente a razão sólida–líquido fixa, volume padronizado de solvente, processamento pós-extração idêntico e preparação uniforme d...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses concorrentes. Todos os dados que apoiam os resultados deste estudo estão disponíveis no manuscrito principal e nos arquivos de informações suplementares. Os conjuntos de dados gerados e analisados durante o estudo atual estão disponíveis pelo autor correspondente mediante solicitação razoável.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declararam que este estudo não recebeu apoio financeiro.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placas de microtitulação de poliestireno de 96 poçosNest Scientific701001Cultura celular / placas de ensaio
ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico))Sigma-AldrichA3219Ensaio de captura radical catiônico
Acetona (grau analítico)Sigma-Aldrich179124Solvente de extração
Acetonitrila (grau LC-MS)Sigma-Aldrich34851Fase móvel orgânica
Acinetobacter baumanniiATCCManassas, VA, EUAATCC 17978
Triple Quad LC-MS/MS com sistema UPLC 1290 InfinityTecnologias Agilent6460Análise quantitativa
Coluna analítica (C18, 4,6 e vezes 100 mm, 3,5 e mu; m)Tecnologias Agilent (Zorbax)959990-902Coluna de fase reversa
Padrões antioxidantes (Ácido ascórbico / Trolox)Sigma-AldrichA7506 / 238813Controles positivos
Analisadores de DNA Applied Biosystems 3730xlBiossistemas Aplicados Analisadores de DNA 3730xlSistema de Sequenciamento de DNA
Biossistemas Aplicados e comércio; BigDye & trade; Kit de Sequenciamento de Ciclos Terminator v3.1Biossistemas Aplicados 4337455Kit de Sequenciamento Sanger
Bacillus cereusATCCManassas, VA, EUAATCC 14579
Análise de Bioinformática, software BioEdit, Algoritmo utilizado: montagem contig CAPIbis BiosciencesNASoftware de Montagem de Sequências
Dedal de extração de celuloseFisherbrand e comércio;  11724043Usado para extração de Soxhlet
Dimetilsulfóxido (DMSO)Merck102952Solvente
Kit de isolamento de DNA (Plant & Plant & Kit de isolamento de DNA de fungos (Polônia)EurX GeneMATRIXE3595Isolamento de DNA 
DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)Sigma-AldrichD9132Ensaio radical de saqueação
Eagle Médio Modificado de DulbeccoCapricórnio,  DMEM-HA
Enterobacter aerogenesATCCManassas, VA, EUAATCC 13048
Enterococcus faecalisATCCManassas, VA, EUAATCC 29212
Escherichia coliATCCManassas, VA, EUAATCC 25922
EtanolMerck100983Solvente
Acetato de etilaMerck109623Solvente de extração
Soro Bovino Fetal (FBS)Capricorn ScientificFBS-16A
Kit de Sequenciamento de Ciclos BigDyeTerminator v3.1ThermoFisher4337455Kit de Sequenciamento
Reagente Folin-CiocalteuSigma-Aldrich 47641Conteúdo fenólico total
Ácido fórmicoSigma-Aldrich 33015Aditivo de fase móvel
Ácido gaulêsCarlo Erba406335Curva de calibração
Planta MATRIZ GENÉTICA & Kit de isolamento de DNA de fungosEurX E3595Kit de isolamento de DNA
GraphPad Prism (v9)Visualização de dados e análise estatísticaN/AAnálise estatística
Manto de aquecimentoEletrotérmico & nbsp;EME30500Usado para manter o refluxo de solventes
HighPrep e comércio; Sistema de Limpeza de PCRMAGBIOAC-60005
GeloNível laboratorial—Controle de temperatura durante os Emirados Árabes Unidos
Klebsiella pneumoniaeATCCManassas, VA, EUAATCC 13883
L-glutaminaCapricorn ScientificAlemanha
Listeria monocytogenesATCCManassas, VA, EUAATCC 19115
LiofilizadorScientzN/ALiofilização de extratos
Conta magnética e traço; sistema de limpeza baseado em PCRMAGBIOAC-60005PCR
MetanolMerck106009Solvente de extração
n-HexanoMerck103701Solvente de extração
Penicilina/EstreptomicinaCapricorn ScientificAlemanha
Pseudomonas aeruginosaATCCManassas, VA, EUAATCC 27853
Papel de filtro (nº 541)Cytiva1541-125 VNo processo de filtração por extrato
Evaporador rotativoBuchi R10011100V101Remoção de solvente
Shigella dysenteriaeATCCManassas, VA, EUAATCC 13313
Carbonato de sódioMerck106392Análise fenólica total
Leitor de Microplacas Nano SPECTROstar  BMG LabtechMedições de absorvância
Staphylococcus aureusATCCManassas, VA, EUAATCC 25923
Staphylococcus epidermidisATCCManassas, VA, EUAATCC 12228
Software de análise estatística (SPSS, v23)Análise de dadosNA
Thermo Scientific Nanodrop 2000 Thermo Fisher ScientificND-2000
Ágar de Soja de Triptona (TSA)MerckAlemanha—
Caldo de Soja de Triptona (TSB)MerckAlemanha—
Homogeneizador ultrassônicoScientzSCIENTZ-650LExtração assistida por ultrassom

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