Um modelo de camundongo de ablação linfática cardíaca por doador via eletrocauterização para pesquisa de transplante

Resumo

Desenvolvemos um modelo inovador de camundongo de ablação linfática cardíaca por doador em transplante cardíaco. Esse modelo demonstra que a perturbação dos linfáticos doadores atenua a rejeição aguda, reduz a lesão do miocárdio e prolonga a sobrevivência do enxerto, fornecendo novos insights sobre a função linfática cardíaca na imunidade ao transplante.

Resumo

Embora os vasos linfáticos cardíacos tenham recebido cada vez mais atenção nos últimos anos, a relação entre o sistema linfático cardíaco doador e a rejeição aguda em transplantes cardíacos ainda precisa ser esclarecida.

A atividade eletrofisiológica cardíaca foi avaliada por eletrocardiografia (ECG) em camundongos normais antes e depois da ablação linfática cardíaca. Os principais vasos linfáticos dos corações doadores foram visualizados por injeção de Evans Blue e posteriormente ablados por eletrocauterismo . Um modelo de transplante cardíaco com disfunção linfática cardíaca por doador foi estabelecido usando corações submetidos à ablação linfática. A função do enxerto cardíaco foi avaliada por meio de ecocardiografia, western blotting e ELISA. O impacto da ablação linfática doadora na rejeição aguda foi avaliado por meio de coloração por hematoxilina-eosina (HE) e monitoramento do tempo de sobrevivência do enxerto.

Os resultados do ECG não indicaram mudanças significativas na eletrofisiologia cardíaca antes e depois da ablação linfática, confirmando que os principais vasos cardíacos permaneceram intactos. Evans Blue foi injetado no ápice cardíaco para marcar os vasos linfáticos. Os principais linfáticos foram então ablados usando eletrocauterização. Após a conclusão do procedimento de ablação, os camundongos foram heparinizados e seus corações foram posteriormente colhidos. A aorta e a artéria pulmonar foram seccionadas, e a veia cava superior/inferior, juntamente com as veias pulmonares, foram ligadas. Os corações doadores preparados (ablados) eram então transplantados. Os níveis de cTnI e fração de ejeção demonstraram que a ablação linfática não agravou a lesão cardíaca. A coloração com HE revelou que a ablação de linfáticos cardíacos doadores aliviava a rejeição aguda, reduzia a lesão miocárdica e prolongava a sobrevivência do enxerto.

Estabelecemos com sucesso um modelo de transplante cardíaco murino com disfunção linfática cardíaca doadora e demonstramos que a ablação de linfáticos cardíacos doadores pode mitigar a rejeição aguda, atenuar danos miocárdicos e prolongar a sobrevivência do enxerto. Essas descobertas fornecem novos insights e uma base para entender o papel do sistema linfático cardíaco no transplante cardíaco.

Introdução

A rejeição de aloenxerto cardíaco continua sendo uma das complicações mais comuns e graves após o transplante cardíaco, classificada principalmente como rejeição celular aguda e rejeição mediada por anticorpos. Embora as terapias imunossupressoras modernas tenham melhorado significativamente as taxas de sobrevivência dos enxertos, a rejeição continua sendo um dos principais determinantes dos resultados do transplante. Segundo a literatura, aproximadamente 12% dos pacientes apresentam pelo menos um episódio de rejeição aguda moderada ou severa no primeiro ano após o^transplante.

O sistema linfático cardíaco tem recebido cada vez mais atenção por seu possível papel na rejeição de transplantes. Além de suas funções bem estabelecidas no equilíbrio de fluidos e na vigilância imunológica, o sistema linfático desempenha um papel importante na modulação das respostas imunes. Os vasos linfáticos servem como os principais canais para que as células imunológicas entrem e saiam dos tecidos ^2,3. No coração, a rede linfática fornece a infraestrutura fundamental para o transporte e recirculação das células imunes, incluindo linfócitos. Por essa via, os linfócitos migram da corrente sanguínea para o espaço intersticial, onde realizam vigilância imune. Subsequentemente, eles são drenados para os linfonodos e, por fim, retornam à circulação^{sistêmica 2,4}. Além disso, estudos indicam que as células T e seus subconjuntos desempenham um papel central nas respostas agudas de rejeição, e a ativação e migração dessas células podem ser influenciadas pelo sistema^{linfático 5}.

Embora se saiba que vasos linfáticos existem no coração e formam redes análogas a vasos sanguíneos, sua importância não recebeu atenção comparável ao longo dos anos. Estudos demonstraram que a ausência de vasos linfáticos funcionais leva a hipertrofia cardíaca marcada e edema, indicando um papel crucial dos linfáticos na manutenção da homeostase do tecido^{cardíaco 6}. Além disso, drenagem linfática comprometida ou ausente pode reduzir a eficiência da eliminação das células inflamatórias, agravando assim as respostas inflamatórias locais e influenciando o processo de remodelação cardíaca⁷.

Em doenças cardíacas, existem diversas intervenções que visam vasos linfáticos. Em modelos camundongos, a deficiência linfática cardíaca pode ser induzida gerando camundongos Vegfc+/-⁸. Clinicamente, a embolização linfática intervencionista^{mediastinal 9} e a cirurgia pericárdica minimamente^{invasiva na janela 10} podem ser empregadas para tratar derrame pericárdico quílido. Para pacientes com fisiologia circulatória de Fontan, a descompressão linfática pode ser realizada^{cirurgicamente 11}, por meio da descompressão percutânea do ducto^{torácico 12}, ou pelo estabelecimento de anastomose linfovenosa¹³. As técnicas de oclusão incluem embolização do ducto^{torácico 14}, embolização seletiva do ducto^{linfático 15} e ligadura do ducto^{torácico 16}. No entanto, intervenções diretas direcionadas aos próprios vasos linfáticos cardíacos continuam limitadas.

Dado o papel crítico dos vasos linfáticos cardíacos, estabelecemos um modelo inovador de transplante cardíaco murino ao ablar os principais vasos linfáticos em corações doadores por meio de eletrocauterização. Esse modelo foi utilizado para investigar o impacto da disfunção linfática do enxerto doador na rejeição aguda após o transplante.

Protocolo

Machos C57BL/6J e BALB/c (machos, 6-8 semanas de idade, 25-28 g de peso corporal) foram mantidos sob condições específicas livres de patógenos. Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital de Fuwai (Nº de Aprovação: 0108-7-800-ZX(X)-019).

Visualização e ablação de vasos linfáticos cardíacos em camundongos
Para simular disfunção linfática cardíaca, os principais vasos linfáticos cardíacos foram ablados por eletrocauterismo .

Todos os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 1,25% de tribromoetanol na dosagem de 0,2 mL por 10 g de peso corporal e ventilados mecanicamente durante todo o procedimento. Após anestesia com tribromoetanol, camundongos BALB/c passaram por intubação endotraqueal usando cateter calibre 22 e foram conectados a eletrocardiogramas (ECG) (Figura 1A, Figura Suplementar S1). Nos parâmetros do ventilador, a razão respiratória foi definida em 1:1 ou 1:2, com volume de maré de 0,3 mL e frequência respiratória de 100 respirações/min. Após conectar o cateter ao ventilador, a condição do camundongo era monitorada de perto; A intubação foi considerada bem-sucedida se a frequência respiratória do rato correspondesse à do ventilador, enquanto taxas inconsistentes ou distensão abdominal indicavam falha que exigiu reintubação. Uma toracotomia foi então realizada no espaço intercostal esquerdo 3-4, com comprimento de incisão de aproximadamente 1 cm, e um retrator foi usado para expor todo o coração (Figura 1B). Posteriormente, 5 μL de corante azul de Evans foram injetados intramuscularmente no ápice cardíaco para visualizar os vasos linfáticos, com um período de espera de 1 minuto após a injeção para permitir a opacificação completa (Figuras 1C, E; Figura suplementar S2A-B), observando que o azul de Evans deve ser injetado muito lentamente. Após a visualização, a localização dos principais vasos linfáticos cardíacos foi confirmada comparando com dados anatômicos previamente^{relatados 17,18}, e a ablação foi realizada usando uma caneta eletrocautérica ajustada a 10 W em modo contínuo, com tempo de coagulação de aproximadamente 3-7 segundos (Figura 1D,F). A eletrocardiografia (ECG) foi monitorada antes e depois da ablação para garantir a ausência de lesão vascular (Figura 1G,H). Por fim, após uma grande ablação linfática, os camundongos foram heparinizados em preparação para a colheita posterior do coração doado. Uma representação esquemática do procedimento cirúrgico é apresentada na Figura 2.

Transplante cardíaco heterópico abdominal
O transplante cardíaco heterotópico na cavidade abdominal de camundongos foi realizado conforme descrito^{anteriormente 19}. Um breve protocolo é resumido abaixo:

Procedimento com doador
Uma laparotomia foi realizada ao longo da linha alba em camundongos BALB/c, e 1 mL de soro fisiológico de heparina 50 U/mL a 4 °C foi injetado na veia cava inferior, enquanto a aorta abdominal foi cortada para induzir heparinização sistêmica. Após isso, o coração ficou exposto, e 8-0 Foram usadas suturas para ligar a veia cava superior esquerda e direita, que então foram transectadas na extremidade distal das suturas (Figuras 3A,B). Posteriormente, a aorta foi isolada do tecido adiposo ao redor e cortada próxima ao arco aórtico (Figura 3C), e um procedimento semelhante foi realizado para isolar e transectar a artéria pulmonar (Figura 3D). A veia cava inferior do segmento torácico foi ligada com 8-0 suturas e transectos na extremidade distal (Figura 3E), após o que as veias pulmonares foram ligadas e seccionadas usando suturas trançadas de seda 7-0 (Figura 3F). Por fim, o coração doador excisado foi preservado em soro fisiológico a 4 °C para transplante subsequente, com todos os corações preservados pelo mesmo período de aproximadamente 30 minutos para garantir consistência experimental.

Procedimento do receptor
Anestesiar os camundongos receptores de C57BL/6J em preparação para o transplante de coração abdominal. Foi realizada uma laparotomia ao longo da linha branca para expor a aorta abdominal e a veia cava inferior do camundongo receptor (Figura 4A). Após a ligadura dos vasos dos ramos dorsais da veia cava inferior com suturas de nylon 10-0, grampos vasculares foram usados para ocluir o fluxo sanguíneo através da aorta abdominal e da veia cava inferior (Figura 4B). Subsequentemente, foi criada uma janela na aorta abdominal e na veia cava inferior do camundongo receptor, e o sangue foi lavado dos vasos com soro fisiológico de heparina. Utilizando suturas de nylon 11-0, foi realizada uma anastomose ponta a lateral para conectar a artéria pulmonar do coração doador à veia cava inferior do receptor e a aorta do coração doador à aorta abdominal do receptor (Figura 4C-E). Por fim, as pinças vasculares foram liberadas para restaurar o fluxo sanguíneo ao camundongo receptor (Figura 4F).

Desenho experimental
Grupo experimental: Vasos linfáticos cardíacos em camundongos BALB/c foram visualizados usando o corante azul Evans e ablados com caneta eletrocauterizadora. Os corações de camundongos BALB/c com vasos linfáticos ablados foram transplantados para camundongos C57BL/6J.

Grupo controle: Vasos linfáticos cardíacos em camundongos BALB/c foram visualizados usando o contraste Evans Blue, mas nenhuma ablação foi realizada. Os corações de camundongos BALB/c foram transplantados para camundongos C57BL/6J.

Neste estudo, o tamanho da amostra foi padronizado em todos os grupos experimentais e pontos de tempo, com n=5 camundongos por grupo para ensaios realizados 24 horas após o transplante cardíaco, n=5 por grupo para ensaios 7 dias após o transplante, e n=5 por grupo para observação do tempo de sobrevivência do enxerto cardíaco.

Os corações doadores colhidos foram preservados em soro fisiológico gelado a 4 °C por 30 minutos antes do transplante cardíaco. Tanto os corações experimentais quanto os do grupo controle foram mantidos em soro fisiológico por um período idêntico.

A duração do batimento dos enxertos cardíacos foi avaliada diariamente por palpação em ambos os grupos (n=5 por grupo).

Avaliação histológica e pontuação de rejeição parênquima (PR)
Amostras de tecido miocárdico passaram por fixação em formalina a 10% por 48 horas, seguidas por desidratação por uma série graduada de etanol (70%, 80%, 95%, 100%), limpeza de xileno, imersão de parafina e corte microtomo (4 μm), com seções resultantes coradas usando hematoxilina e eosina (H&E). A rejeição do enxerto foi avaliada usando o escore PR para transplante cardíaco, e o grau de lesão do enxerto foi avaliado de forma^{cega 20}.

Exame ecocardiográfico
A função cardíaca foi avaliada usando o sistema de ultrassom (transdutor de sonda 550 MHz de 40 MHz). Os ratos foram colocados em posição deitada sobre uma plataforma animal rotacionável de 360 graus. Após a remoção dos pelos abdominais, a função cardíaca foi avaliada sob anestesia de isoflurano a 1,0%. A fração de ejeção (FE) do enxerto cardíaco foi medida por meio de ecocardiografia em modo M.

Detecção de marcadores de lesão miocárdica
A extensão do dano ao tecido miocárdico foi avaliada medindo a expressão de enzimas específicas de cardiomiócitos no soro. Os níveis de troponina I cardíaca (cTnI) foram analisados conforme as instruções do fabricante.

Western blot
Às 24 horas após o transplante cardíaco, foi coletado tecido miocárdico das principais regiões dos vasos linfáticos dos enxertos cardíacos tanto no grupo controle quanto no experimental. Seguindo o protocolo²¹ descrito anteriormente, foi analisada a expressão dos marcadores associados ao vaso linfático. Os tecidos cardíacos foram completamente lisados em um tampão de lise RIPA contendo inibidores de protease (fenil metano sulfonila fluoreto). Antes da desnaturação térmica, a concentração de proteína era determinada usando um kit de BCA e ajustada para uma concentração uniforme. A proteína total de cada grupo foi separada via SDS-PAGE e posteriormente transferida para uma membrana PVDF. A membrana PVDF foi bloqueada com 5% de leite desnatado (temperatura ambiente por 1-2 horas) e depois incubada durante a noite a 4 °C com os respectivos anticorpos primários. No dia seguinte, a membrana foi tratada com um anticorpo secundário (anti-coelho, 1:1000) em temperatura ambiente por 30 minutos. As tiras de membrana foram incubadas com solução de ECL (1-2 mL) e expostas para capturar as imagens.

Os anticorpos utilizados foram os seguintes: anticorpo policlonal LYVE1 (1:500), Anticorpo Podoplanina (1:500) e Receptor Anti-VEGF 3 (1:50).

Análise estatística
Todos os resultados são expressos como média ± erro padrão de média (SEM). Ao comparar dois grupos, análises estatísticas foram realizadas usando o teste t de Student ou o teste de soma de ranks de Wilcoxon, dependendo da distribuição dos dados e das características. A significância estatística foi definida como p < 0,05.

Resultados

Avaliação da função do enxerto cardíaco
Modelos camundongos de transplante cardíaco foram estabelecidos tanto em grupos controle quanto experimental, de acordo com o protocolo descrito. O status funcional dos enxertos foi avaliado 24 horas após o transplante. O nível de expressão da troponina cardíaca sérica I (cTnI) foi maior no grupo experimental do que no grupo controle, mas a diferença não foi estatisticamente significativa (Figura 5A...

Discussão

O sistema linfático cardíaco constitui um componente vital na manutenção da homeostase do fluido tecidular e no suporte à função imune no coração. Ao facilitar a reabsorção de fluido intersticial, o transporte lipídico e o tráfico de células imunológicas, garante o desempenho cardíaco tanto sob condições fisiológicas quanto patológicas. Nos últimos anos, evidências crescentes destacaram o envolvimento crítico do sistema linfático cardíaco em múltiplas doenças cardiovasculares, como infar...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caneta eletrocoagulante	Weitai	V70
Pinças microscópicas	Jinzhong	WA3030
Pinças microscópicas	Jinzhong	WA2040
Suporte microscópico para agulhas	Jinzhong	YZE010
Suporte microscópico para agulhas	Jinzhong	YZE020
Tesoura microscópica	Jinzhong	YBC010
Tesoura microscópica	Jinzhong	YBC020
Suporte de agulha	Jinzhong	J32010
Tesoura	Jinzhong	Y00010
Ventilador para pequenos animais	Zhuodi	DW-300