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Artigo de método

Ki-67 com razões neutrófilos-linfócitos e CD4-positivas/CD8 prevê resposta precoce em câncer de pulmão não de pequenas células

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DOI:

10.3791/70014

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20 de março de 2026

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1Department of Oncology, Binhaiwan Central Hospital of Dongguan, 2Department of internal medicine, Binhaiwan Central Hospital of Dongguan

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo padroniza a avaliação precoce da resposta em pacientes com CPNM que recebem inibidores de PD-1/PD-L1, integrando o NLR basal, razão CD4/CD8 fluxocitométrica, pontuação imunohistoquímica do Ki-67 do tumor e avaliação RECIST 1.1 após dois ciclos, com checkpoints de controle de qualidade focados na reprodutibilidade ao longo de todo o processo.

Resumo

Este estudo avaliou o valor preditivo combinado do status de expressão do Ki-67 tumoral, a razão neutrófilo-linfócitos (NLR) do sangue periférico e a razão de células T CD4-positiva/CD8-positiva para avaliação de resposta de curto prazo em pacientes com câncer de pulmão não de células pequenas que receberam terapia com inibidor de PD-1/PD-L1. Analisamos retrospectivamente 102 pacientes consecutivos tratados no Hospital Central de Binhaiwan entre janeiro de 2021 e outubro de 2023, que completaram dois ciclos de tratamento. As respostas foram avaliadas usando Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos (RECIST), versão 1.1: 13 pacientes alcançaram resposta completa, 26 resposta parcial, 54 doença estável e 9 doença progressiva. Para análise, definimos resposta como resposta completa mais resposta parcial e não resposta como doença estável mais doença progressiva. A triagem univariável identificou preditores candidatos associados ao status de resposta, que foram inseridos na regressão logística multivariada ajustada por idade, status de desempenho do Grupo Cooperativo de Oncologia do Leste e histórico de tabagismo, identificando o status Ki-67, NLR e a razão CD4-positivo/CD8-positivo como preditores independentes da classificação de resposta de curto prazo. A análise de características operacionais do receptor apoiou uma discriminação aprimorada para o modelo combinado de biomarcadores em comparação com marcadores individuais, destacando uma abordagem prática e minimamente invasiva para estratificação precoce da resposta nesse contexto clínico.

Introdução

Representando quase 85% das malignidades pulmonares, o câncer de pulmão não de pequenas células (NSCLC) é o subtipo histológico mais prevalente e afeta predominantemente adultos de meia-idade e idosos naChina 1. Sua etiologia é multifatorial e inclui exposição ao tabaco, contato prolongado com poeira ou poluentes industriais, suscetibilidade hereditária e exposição crônica a carcinógenosambientais 2˒3. O CPNPC em estágio inicial frequentemente apresenta sintomas respiratórios inespecíficos e pode ser atribuído erroneamente a condições comuns das vias aéreas na atenção primária, contribuindo para o atraso no reconhecimento e para uma alta proporção de pacientes diagnosticados em estágiosavançados 4˒5.

Nos últimos anos, o bloqueio de pontos de controle imunológico tornou-se um componente central do tratamento sistêmico para CPNPC avançado. Os inibidores da morte programada 1 (PD-1) e do ligando 1 da morte programada (PD-L1) demonstraram benefício clínico duradouro e melhora da sobrevivência em pacientesselecionados 6. No entanto, a heterogeneidade da resposta permanece substancial, e o ônus financeiro e a potencial toxicidade da terapia prolongada não são triviais7˒8. Preditores clinicamente usados, como imunohistoquímica tumoral PD-L1 e carga mutacional tumoral (TMB), fornecem informações valiosas, mas ambos possuem restrições práticas que limitam sua implantação uniforme. A avaliação da PD-L1 pode ser afetada pela heterogeneidade intratumoral e variabilidade do ensaio/plataforma, enquanto a TMB geralmente requer recursos de sequenciamento, prazo mais longo e custosmais altos 9. Essas restrições tornam clinicamente relevante o desenvolvimento de fluxos de trabalho que utilizem materiais rotineiramente disponíveis e que possam ser executados com controle de qualidade padronizado em centros com capacidade laboratorial variável.

Do ponto de vista prático, uma abordagem orientada por protocolos que integra um pequeno número de biomarcadores acessíveis pode apoiar o planejamento precoce de acompanhamento após o início do tratamento. Por exemplo, amostragem padronizada de linha inicial antes da primeira infusão e uma janela de avaliação definida de dois ciclos podem ajudar os clínicos a identificar pacientes que justificam monitoramento mais próximo ou reavaliação antecipada, mantendo a transparência sobre as etapas necessárias para reproduzir as medições entre os locais. Essa ênfase na viabilidade e reprodutibilidade é particularmente relevante para artigos do protocolo JoVE, onde os passos metodológicos — e seus pontos de verificação de qualidade — são centrais para a contribuição.

Ki-67 é um marcador de proliferação nuclear que reflete a dinâmica do crescimento tumoral e tem sido discutido em relação à contextura imunológica. Elevação do Ki-67 foi relatada como correlacionada com a expressão de PD-L1 e pode estar ligada a fenótipos de escape imunológico que moldam a sensibilidade a inibidores de checkpoint imunes (ICIs)10. Paralelamente, a razão neutrófilos/linfócitos (NLR) é um índice facilmente acessível do estado inflamatório sistêmico e tem sido amplamente investigada como fator prognóstico ou preditivo em pacientes que receberam terapia com inibidores de PD-1/PD-L1 11. Um NLR mais alto é comumente interpretado como refletindo um ambiente imunossupressor — por meio de neutrofilia relativa e/ou linfoopenia — e tem sido associado a uma resposta menor e redução da sobrevivência em múltiplascoortes 12. A razão periférica CD4-positiva/CD8-positiva para células T oferece uma janela adicional para a homeostase imune adaptativa, e o equilíbrio funcional entre os compartimentos auxiliares e citotóxicos é mecanicamente relevante para a imunidade antitumoral eficaz sob o bloqueioPD-1/PD-L1 13.

Embora Ki-67, NLR e a razão CD4-positivo/CD8-positivo tenham apresentado valor potencial como marcadores individuais, seu uso integrado como fluxo operacional e minimamente invasivo para avaliação de resposta precoce em NSCLC permanece insuficientemente caracterizado. Portanto, este estudo examinou se a combinação do status de expressão do Ki-67 tumoral com NLR do sangue periférico e a razão CD4-positiva/CD8-positiva melhora a classificação da resposta de curto prazo após dois ciclos de terapia com inibidores de PD-1/PD-L1, com o objetivo de informar a estratificação precoce do risco e apoiar a reavaliação clínica oportuna na prática rotineira.

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Protocolo

1. Ética e conformidade regulatória

  1. Obtenha aprovação do Comitê de Ética do Hospital Central Binhaiwan de Dongguan (Aprovação nº: 2021045).
  2. Garanta que todos os procedimentos estejam em conformidade com a Declaração de Helsinque.
  3. Confirme que o consentimento informado por escrito foi obtido antes do tratamento e documente o status do consentimento no arquivo do estudo.

2. Identificação do paciente e triagem de elegibilidade

  1. Identificar pacientes consecutivos diagnosticados com câncer de pulmão não de pequenas células que iniciaram a terapia programada com proteína de morte celular 1/inibidor programado de ligante de morte 1 entre janeiro de 2021 e outubro de 2023 no centro de estudo.
  2. Confirme o diagnóstico patológico revisando o laudo de patologia.
  3. Confirme a conclusão de dois ciclos de tratamento e defina um ciclo como 3 semanas.
  4. Aplique critérios de inclusão.
    1. Confirme a idade de 35 a 80 anos no início do tratamento.
    2. Confirmar ausência de metástase hepática na imagem basal.
    3. Confirme a ausência de outros tumores malignos primários.
    4. Confirme o tempo de sobrevivência esperado documentado > 12 meses no prontuário médico.
    5. Confirme a disponibilidade de prontuários médicos completos e dados de imagem de base.
  5. Aplique critérios de exclusão.
    1. Exclua pacientes que tenham passado por cirurgia cardiotorácica dentro de 6 meses antes do início do tratamento.
    2. Exclua pacientes com acompanhamento documentado e comprometedor de má adesão.
    3. Exclua pacientes com transtornos psiquiátricos graves que comprometam a conformidade com o protocolo.
    4. Exclua pacientes com anormalidades hematológicas ou de coagulação na avaliação inicial.
    5. Exclua pacientes com infecção ativa grave no início do jogo.
    6. Exclua pacientes que receberam imunoterapia ou terapia direcionada dentro de 30 dias antes do período de inscrição.
    7. Exclua pacientes que interrompam o tratamento durante a janela de avaliação de dois ciclos devido a transferência, restrições financeiras ou morte.
  6. Atribua um ID de estudo único a cada paciente elegível e desidentifique todos os registros antes da análise.
  7. Verifique a elegibilidade de forma independente por dois investigadores e resolva discrepâncias por consenso.
  8. Registre a adjudicação em um registro de triagem contendo o ID do estudo, item triado, descrição da discrepância, adjudicadores e data.
    NOTA: Registre condições de base que provavelmente alterem marcadores inflamatórios (por exemplo, febre, suspeita clínica de infecção ou exposição sistêmica a corticosteroides) no registro de triagem para apoiar decisões de exclusão einterpretação 14.

3. Extração de dados clínicos de linha inicial

  1. Recupere variáveis de referência do sistema eletrônico de prontuário médico.
  2. Registre sexo, idade, índice de massa corporal, nível de escolaridade, localização do tumor, diâmetro máximo tumoral, estágio tumor–nódulo–metástase, modalidade de tratamento, histórico de tabagismo e status de desempenho do Eastern Cooperative Oncology Group.
  3. Exporte todas as variáveis de referência para uma planilha desidentificada.
  4. Bloqueie o conjunto de dados para análise salvando uma cópia somente leitura com carimbo de data.
  5. Verifique a precisão dos dados cruzando pelo menos 10% das entradas com registros de origem.
  6. Registre correções em um registro de correções contendo nome do campo, valor original, valor corrigido, iniciais do revisor e data.
  7. Resuma as características da linha de base pelo status da resposta e compile a tabela de características de referência para o relatório como Tabela 1.

4. Coleta de sangue periférico de base e razão neutrófilo-linfócitos derivada da hematologia

  1. Colete sangue venoso em jejum de uma veia do membro superior dentro de 2 horas antes da primeira administração do inibidor usando tubos anticoagulantes EDTA (veja Tabela de Materiais).
  2. Inverta cada tubo 8–10 vezes imediatamente após a coleta.
  3. Realize o exame completo de hemograma em até 2 horas após a coleta usando um analisador hematológico automatizado (modelo listado na Tabela de Materiais).
  4. Verifique diariamente o status interno de controle de qualidade do analisador antes do teste da amostra e registre o status de aprovação/reprovação do controle de qualidade, nível de controle, operador e modelo do analisador no registro do estudo.
  5. Registre a contagem absoluta de neutrófilos e linfócitos absolutos a partir da saída do analisador.
  6. Calcule a razão neutrófilos/linfócitos usando a fórmula NLR = contagem absoluta de neutrófilos / contagem absoluta de linfócitos.
  7. Amostras marcadas com coágulos ou hemólisis como inválidas no registro do estudo.
  8. Repita a coleta de sangue dentro do mesmo período pré-tratamento quando clinicamente viável e documente a razão de qualquer resultado ausente ou inválido.
  9. Registre o tempo da coleta de sangue e o tempo de execução do hemograma para documentar a janela pré-analítica de ≤ 2 horas.

5. Citometria de fluxo para razão de células T CD4-positiva/CD8-positiva

  1. Alíquota de 50 μL EDTA anticoagulou sangue total em um tubo de fluxo de 12 × 75 mm (veja Tabela de Materiais).
  2. Adicione 20 μL de um reagente de subconjunto de células T de quatro cores identificando CD3, CD4, CD8 e CD45 usando quatro fluorocromos (veja Tabela de Materiais).
  3. Entrar em vórtice por 1–2 segundos e incubar por 15 minutos a 20–25 °C protegido da luz.
  4. Adicione 450 μL de solução lisadora de glóbulos vermelhos de 1× preparada a partir de um concentrado de 10× (veja a Tabela de Materiais).
  5. Misture por inversão suave e incube por 10 minutos a 20–25 °C protegido da luz.
  6. Adicione 2 mL de soro salino tamponado com fosfato (veja Tabela de Materiais) e misture por inversão de 3 a 5 vezes.
  7. Centrifuge a 350 × g por 5 minutos em temperatura ambiente.
  8. Descarte o sobrenadante sem mexer na bola.
  9. Resuspenda o pellet em solução salina tamponada com fosfato de 300 a 500 μL para aquisição.
  10. Realize verificações diárias de desempenho do citômetro de acordo com o fluxo de trabalho do instrumento e registre o status de aprovação/reprovação na folha de execução.
  11. Ajuste as tensões do fotomultiplicador usando um tubo não corado.
  12. Execute controles de cor única (células ou esferas) para cada fluorocromo.
  13. Calcule a compensação dentro do software de aquisição usando os controles de cor única.
  14. Mantenha as mesmas configurações de voltagem e matriz de compensação para todas as amostras dentro do mesmo lote e data de gravação, operador, snapshot de tensão e nome do arquivo de compensação.
  15. Adquira cada amostra com uma taxa de fluxo baixa a moderada e colete pelo menos 10.000 eventos linfócitos por amostra.
  16. Linfócitos de gate usando CD45 versus dispersão lateral.
  17. Singlets de gate usando área de dispersão frontal versus altura de dispersão frontal.
  18. Células T CD3-positivas na porta.
  19. Quantifique subconjuntos CD4-positivos e CD8-positivos dentro de eventos CD3-positivos.
  20. Calcule a razão CD4-positiva/CD8-positiva usando a fórmula CD4-positiva/CD8-positiva = (% CD4-positivo entre CD3-positivo) / (% CD8-positivo entre CD3-positivo).
  21. Verifique a separação das populações CD4-positivas e CD8-positivas em parcelas bivariadas.
  22. Recalcule os controles de compensação e execute novamente ao observar sobreposição inconsistente com a separação populacional esperada.
  23. Salve gráficos representativos para cada lote (CD45/SSC, singlets, porta CD3, CD4 vs CD8) e arquive-os com ID e data do lote.
    NOTA: Registre os números dos lotes dos reagentes e as datas de execução em folhas internas para suportar o rastreamento delote 15.

6. Imunohistoquímica do tumor Ki-67 e atribuição de status binário

  1. Corte seções de tecido tumoral fixado em formalina e parafina a 4 μm e monte seções em lâminas carregadas (veja Tabela de Materiais).
  2. Desparafinize seções em xileno e reidrate seções através de etanol graduado para água.
  3. Realize a recuperação de epítopos induzida por calor usando o tampão de recuperação de citrato, pH 6 (veja Tabela de Materiais).
  4. Pré-aqueça o tampão de recuperação até quase a temperatura de ebulição antes do tempo.
  5. Heat desliza no buffer de recuperação por 20 minutos.
  6. Deslizes frios em temperatura ambiente por 20 minutos.
  7. Enxágue as lâminas com tampão de lavagem para remover a solução residual de recolha.
  8. Incube as seções com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos em temperatura ambiente.
  9. Lave três vezes com o tampão de lavagem por 1–2 minutos por lavagem.
  10. Incubar seções com anticorpo primário Ki-67 (clone MIB-1; formulação pronta para uso; ver Tabela de Materiais) por 20 minutos em temperatura ambiente.
  11. Lave três vezes com o tampão de lavagem por 1–2 minutos por lavagem.
  12. Aplique um sistema de detecção baseado em HRP e desenvolva cromógeno com DAB conforme as instruções do fabricante (veja a Tabela de Materiais).
  13. Interrompa o desenvolvimento de cromógenos enxaguando com água assim que a coloração nuclear estiver claramente visível e o fundo permanecer baixo.
  14. Contra-tingir as seções com hematoxilina, enxaguar, azul, desidratar através de etanol graduado, transparente em xileno e montar com meio de montagem permanente (ver Tabela de Materiais).
  15. Examine seções sob microscopia de campo claro a 400×.
  16. Selecione cinco campos tumorais viáveis não sobrepostos e evite necrose, artefatos de esmagamento e efeitos de borda.
  17. Conte pelo menos 100 núcleos tumorais por campo e registre o número de núcleos com coloração nuclear marrom inequívoca.
  18. Conte pelo menos 500 núcleos tumorais por caso nos cinco campos.
  19. Calcule o índice de marcação Ki-67 em nível de caso usando a fórmula índice de rotulagem (%) = (núcleos tumorais positivos totais / núcleos tumorais totais contados) × 100%.
  20. A intensidade da coloração para cada caso foi 0 (nenhuma), 1 (amarelo claro), 2 (marrom-amarelo) ou 3 (marrom escuro) usando a intensidade predominante entre os núcleos tumorais contados.
  21. Pontuar a porcentagem de células positivas para cada caso como 0 (0–5%), 1 (6–25%), 2 (26–50%), 3 (51–75%) ou 4 (>75%) usando o índice de rotulagem em nível de caso.
  22. Calcule a pontuação imunorreativa usando IRS = intensidade × percentual.
  23. Atribua o status de expressão do Ki-67 para análise como Ki-67 negativo para IRS 0–4 e Ki-67 positivo para IRS 5–12, e use esse status binário de forma consistente ao longo da Tabela 1–4 e dos resultados de modelagem.
  24. Realize pontuação cega por dois patologistas.
  25. Cega ambos os patologistas para os resultados clínicos e os valores dos biomarcadores sanguíneos.
  26. Resolver discordâncias de pontuação por meio de revisão conjunta e registrar a classificação e data finais de consenso.
  27. Arquive imagens representativas de cada caso com ID do estudo e ampliação.
  28. Inclua um tecido controle positivo conhecido e um controle negativo (omitir anticorpo primário) em cada aplicação de coloração.
  29. A coloração repetida após falha no controle ou após a coloração de fundo impede a interpretação.
    NOTA: Arquive a folha de avaliação contendo as contagens de cinco campos, índice de rotulagem, pontuação de intensidade, percentual, IRS e status final negativo/positivo paraauditabilidade 16.

7. Avaliação de resposta após dois ciclos

  1. Realize imagens de referência antes do ciclo 1 dentro do fluxo de trabalho clínico rotineiro.
  2. Repita a imagem após dois ciclos de tratamento e defina cada ciclo como 3 semanas.
  3. Avaliar a resposta ao tratamento usando os Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos, versão 1.1. 14
  4. Realize uma avaliação independente cega por dois radiologistas.
  5. Cegue ambos os radiologistas para valores de biomarcadores e covariáveis de modelagem.
  6. Resolver desacordos por consenso e registrar detalhes da adjudicação (iniciais do leitor, data, decisão final).
  7. Classifique a categoria de resposta como resposta completa, resposta parcial, doença estável ou doença progressiva de acordo com o RECIST 1.1.
  8. Atribua resposta completa + resposta parcial ao grupo de resposta.
  9. Atribuir doença estável + doença progressiva ao grupo de não-resposta.
  10. Armazene datas de imagem de referência e de acompanhamento e verifique se a janela de avaliação corresponde a dois ciclos.
  11. Arquivar as folhas de medição do RECIST com ID do estudo, leitor e data da auditoria.

8. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas usando software estatístico (veja a Tabela de Materiais).
  2. Apresente variáveis contínuas normalmente distribuídas como média ± desvio padrão e compare grupos usando um teste t de amostra independente.
  3. Apresente variáveis categóricas como contagens e percentuais e compare grupos usando o teste do qui-quadrado ou o teste exato de Fisher, conforme apropriado.
  4. Variáveis independentes do código de acordo com o esquema de codificação pré-especificado e compilam a tabela de codificação como Tabela 2.
  5. Selecionar preditores usando análises univariáveis e selecionar variáveis que atendam ao critério pré-especificado para modelagem multivariável.
  6. Ajuste um modelo de regressão logística multivariável usando resposta = 0 e não-resposta = 1 como variável dependente.
  7. Ajuste o modelo multivariável para idade, desempenho do Grupo Cooperativo de Oncologia do Leste e histórico de tabagismo.
  8. Informe as estimativas finais ajustadas do modelo como Tabela 3.
  9. Gerar curvas características de operação do receptor para preditores individuais e o modelo combinado.
  10. Determine os limiares baseados em ROC usando o índice de Youden para NLR e a razão CD4-positivo/CD8-positiva e aplique os limiares derivados de forma consistente nas análises dicotomizadas relatadas na Tabela 4.
  11. Resuma o desempenho da discriminação e classificação para preditores únicos e o modelo combinado como Tabela 4.
  12. Realizar análises de sensibilidade tratando a razão neutrófilo-linfócitos e a razão CD4-positiva/CD8-positiva como preditores contínuos sob o mesmo conjunto de codificação e ajuste de resultados.
  13. Relate os resultados da análise de sensibilidade como Tabela Suplementar S1.
  14. Verifique a consistência entre os valores no texto do manuscrito e as tabelas e figuras correspondentes, e arquive os arquivos finais de saída e a versão do software utilizada.

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Resultados

Características básicas
As características clínicas de base dos 102 pacientes com câncer de pulmão não de pequenas células são resumidas na Tabela 1. O grupo de resposta (resposta completa + resposta parcial) incluiu 30 homens e 9 mulheres, enquanto o grupo de não-resposta (doença estável + doença progressiva) incluiu 50 homens e 13 mulheres (p = 0,771). No grupo de resposta, 79,49% dos pacientes tinham menos de 65 anos, em comparação com 66,67% no gr...

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Discussão

A inibição de pontos de controle imunológico tornou-se um componente essencial da terapia sistêmica para câncer de pulmão avançado não de pequenas células (NSCLC), mas o benefício clinicamente significativo permanece concentrado em um subconjunto depacientes 15˒16. Essa heterogeneidade da resposta, juntamente com o custo e a potencial toxicidade do tratamento prolongado, torna a estratificação da resposta precoce clinicamente relevante para...

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Divulgações

Os autores declaram que não há interesses financeiros ou relacionamentos pessoais concorrentes que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

Agradecemos ao Departamento de Patologia e ao Laboratório Central do Hospital Central Binhaiwan de Dongguan pela assistência técnica em imunohistoquímica e citometria de fluxo. Esse trabalho foi apoiado pelo Projeto do Fundo de Pesquisa em Ciência e Tecnologia Médica de Guangdong (Bolsa nº B2022247).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Analisador hematológico automatizadoSysmex CorporationXN-1000Hemograma completo e cálculo do NLR
Microscópio de campo claroOlympusBX53Avaliação histológica
Tampão de recuperação de antígeno de citrato (pH 6,0)Abcamab93678Recuperação de antígeno induzida pelo calor
Kit de substrato DABLaboratórios VectorSK-4100Desenvolvimento cromogênico
Tubo de coleta de sangue anticoagulante EDTABD em Biociências367525Coleta de sangue periférico
Citômetro de fluxoBD em BiociênciasFACSCanto IIAnálise de subconjuntos de células T
Tubos de citometria de fluxo (12 figure-materials-1 75 mm)BD Falcon352058Tubos de aquisição de amostras
Blocos de tecido tumoral fixados em formol e parafinaArquivo de Patologia ClínicaN/AAmostras de tumores de NSCLC
Reagente de subconjunto de células T de quatro cores (CD3/CD4/CD8/CD45)BD em Biociências340499Para detecção de subconjuntos de linfócitos
Coloração de hematoxilinaSigma-AldrichH3136Contracoloração nuclear
Kit de detecção de HRPDako (Agilent)K5007Sistema secundário de detecção de anticorpos
Anticorpo primário Ki-67 (clone MIB-1)Abcamab16667Detecção imunohistoquímica
MicrotomeLeica MicrosystemsRM2235Cortando 4 figure-materials-2 m seções FFPE
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023Lavagem e ressuspensão das células
Lâminas de microscópio carregadas positivamenteThermo Fisher ScientificJ1800AMNZMontagem em seção de tecido
Solução lisadora de glóbulos vermelhosBD em Biociências349202Lise de eritrócitos antes da citometria de fluxo
Software de análise estatísticaIBMSPSS v26.0Análise de dados

Referências

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