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Artigo de método

Espectroscopia de Ressonância Magnética Fósforo-31 para Medições Seriadas de Energia Cardíaca durante Preservação do Coração com Controle de Temperatura

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DOI:

10.3791/70070

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17 de março de 2026

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1Division of Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Division of MR Research, Russell H. Morgan Department of Radiology and Radiological Science, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University, 4Johns Hopkins University School of Medicine, 5Department of Pediatric Cardiac Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste artigo, descrevemos um protocolo reproduzível e com controle de temperatura para a Espectroscopia de Ressonância Magnética ex vivo com Fósforo-31, permitindo avaliação seriada e quantitativa da energia do miocárdio durante a preservação de órgãos.

Resumo

A preservação confiável dos órgãos é fundamental para aumentar a disponibilidade de doadores e melhorar os resultados dos transplantes. Embora o armazenamento estático continue sendo o padrão para corações doadores, há necessidade de métodos precisos para monitorar a energia do miocárdio durante toda a preservação.

A Espectroscopia de Ressonância Magnética de Fósforo-31 (31P MRS) permite a medição direta e dinâmica de metabólitos energéticos-chave, incluindo fosfocreatina (PCr), Adenosina Trifosfato (ATP), fosfato inorgânico (Pi) e pH intracelular. Essa técnica permite a avaliação longitudinal, quantitativa e precisa do status metabólico do miocárdio durante o armazenamento ex vivo . As vantagens da MRS incluem avaliação dinâmica do estado energético e uma avaliação global da energia ventricular.

O protocolo começa com a recuperação do doador suíno, administração de cardioplegia e cardiectomia. O arco aórtico é cortado proximal ao tronco braquiocefálico para maximizar o comprimento da aorta ascendente. Uma cânula com nervuras é fixada na aorta ascendente distal, o átrio esquerdo é marcado e o coração é colocado em um recipiente cilíndrico e isolado, pré-preenchido com cardioplegia específica de temperatura. A tampa se conecta à cânula, suspendendo o coração dentro, e o recipiente é selado, mantendo uma temperatura dentro de 1 °C por 1 hora.

O recipiente é colocado em uma caixa de isopor sob medida, com uma abertura para uma bobina sintonizada com fósforo, alinhando o centro da bobina com o centro do ventrículo esquerdo (LV). Imagens de reconhecimento confirmam a colocação do VE próximo à bobina 31P. A calha B0 garante excitação uniforme, seguida pela aquisição de um espectro MR 31P não localizado. O pós-processamento identifica picos espectrais para calcular PCr/ATP, razões PCr/Pi e pH intracelular.

No nosso protocolo, a ressonância magnética 31P é realizada em pontos de tempo seriais entre h 0 e 8. Entre os pontos de tempo, o coração é armazenado em um dispositivo de armazenamento padrão na temperatura desejada.

31A P MRS nos permitiu estudar mudanças dependentes do tempo na depleção de energia e o papel da temperatura de armazenamento na mitigação do esgotamento ao longo do tempo.

Introdução

O transplante cardíaco continua sendo o tratamento definitivo para pacientes selecionados com insuficiência cardíaca terminal1. No entanto, a persistente escassez de órgãos doadores adequados e as limitações das estratégias atuais de preservação são grandes barreiras para resultados ótimos e para a ampliação da disponibilidade detransplantes 2,3. Tradicionalmente, corações doadores são preservados usando armazenamento estático a frio, que é simples e econômico, mas suscetível a esgotamento subclínico de energia durante transporteprolongado 2,4. À medida que os programas aceitam cada vez mais órgãos de maior risco e geograficamente distantes, há uma necessidade crescente de ferramentas objetivas que caracterizem a condição metabólica do miocárdio durante a preservação, em vez de depender apenas do tempo isquêmico e da inspeçãomacroscópica 5,6,7. Além disso, o metabolismo miocárdico e a tolerância isquêmica são fortemente influenciados pela temperatura, e tanto o resfriamento inadequado quanto a hipotermia excessiva podem agravar a depleção energética e a lesão celular durante o armazenamento. Avaliar corações doadores em múltiplas temperaturas de preservação clinicamente relevantes, portanto, ajuda a identificar condições que melhor mantêm a viabilidade miocárdica ao longodo tempo 3.

A avaliação precisa e dinâmica da bioenergética do miocárdio durante o armazenamento é essencial para melhorar as técnicas de preservação e maximizar a utilização dos órgãos. Atualmente, a prática padrão depende do armazenamento estático a frio em temperaturas na faixa de aproximadamente 4-8 °C 8. Embora esse protocolo tenha apresentado resultados bem-sucedidos em períodos curtos de armazenamento, o armazenamento prolongado nessa temperatura pode comprometer a integridade do miocárdio. Portanto, é essencial realizar medições seriadas da atividade metabólica em uma faixa de temperaturas e durações para delimitar as condições ótimas de armazenamento necessárias para garantir o sucesso do transplante de órgãos. A avaliação convencional da lesão de preservação frequentemente depende de exame histológico ou ensaios bioquímicos a partir de biópsias miocárdicas, que são invasivas, destrutivas e fornecem apenas instantâneos regionais intermitentes do estado dotecido 9. Em contraste, a espectroscopia de ressonância magnética do fósforo-31 (31P MRS) é uma modalidade poderosa e não destrutiva que permite a medição direta e serial de metabólitos energéticos-chave, incluindo fosfocreatina (PCr), trifosfato de adenosina (ATP), fosfato inorgânico (Pi) e pH intracelular, dentro do tecido cardíacointacto 6,10,11,12. Ao permitir medições repetidas no mesmo órgão sem manuseio adicional dos tecidos, a 31P MRS fornece insights globais e longitudinais sobre o estado energético miocárdico, aumentando a precisão experimental e a reprodutibilidade em comparação com abordagens baseadas em biópsia ou substitutasséricas 6,13.

A avaliação da viabilidade do enxerto cardíaco com 31P RMS foi revisada por Bernard etal 14. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado e com controle de temperatura para a RMS ex vivo 3 Tesla 31P do coração do porco durante a preservação. Esse método fornece uma estrutura prática para monitorar a depleção do substrato, testar variáveis de armazenamento e validar intervenções de preservação. O protocolo é particularmente adequado para laboratórios que buscam medições seriadas do ventrículo inteiro durante armazenamento estático a frio, como estudos de preservação dependente da temperatura, lesão por isquemia-reperfusão ou otimização de soluções para corações doadores marginais e de critério estendido.

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Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes institucionais de cuidado animal e foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal da Johns Hopkins (Protocolo número SW24M319) para todos os procedimentos envolvendo animais vivos, incluindo a colheita cirúrgica. Todos os experimentos ex vivo subsequentes foram realizados usando tecidos obtidos após a eutanásia.

1. Procedimento pré-colheita

  1. Ajuste a incubadora para uma temperatura 2 °C abaixo da temperatura alvo de preservação. Deixe a incubadora se estabilizar por pelo menos 2 horas.
  2. Coloque de 6 a 7 bolsas de gelo na incubadora para pré-resfriá-las até a temperatura definida. Certifique-se de que as bolsas de gelo sejam suficientes para manter a temperatura durante o transporte.
  3. Prepare uma solução modificada para cardioplegia de São Tomás:
    1. Em 1 litro de saquinho de solução de Ringer Lactado, adicione
      1. 30 mL de bicarbonato de sódio 8,4%
      2. 5 mL de 30 mmol/10 mL de cloreto de potássio
      3. 2,5 mL de sulfato de magnésio 20 mmol/10 mL
      4. 15 mL de 50% de dextrose
      5. 100 mg de nitroglicerina 50 mg/10 mL
      6. 5000 U de eritropoietina fria
    2. Prepare um total de 3 L de solução para cardioplegia e armazene a solução na incubadora pré-resfriada.
  4. Separe o cooler isolado com um tubo de silicone embutido que permite o posicionamento ideal da altura vertical do coração. Coloque uma marca preta de referência no tubo de silicone no ponto que fica diretamente abaixo da ponta da abertura na tampa do resfriador.
  5. Separe uma cânula canelada para prender e suspender o coração colhido. Coloque uma marca de referência preta na superfície externa da cânula para servir como ponto de alinhamento reproduzível.

2. Procedimento de colheita

  1. Sede o animal usando uma combinação de telazol, cetamina e xilazina misturados em uma única seringa e administrado intramuscularmente, para minimizar o estresse e a dor associados a múltiplas injeções.
    1. Telazol (50 mg de tiletamina + 50 mg de zolazepam) a 4,4 mg/kg para cada componente.
    2. Ketamina a 2,2 mg/kg.
    3. Xilazina a 2,2mg/kg.
  2. Intube e anestesie o animal.
    1. Volume de maré de 5-10 mL/kg.
    2. Frequência respiratória de 12-15 respirações/min.
    3. Pressão positiva no final da expiração a 5 cmH2O.
    4. Inalou isoflurano a 0,5-2% com fluxo de oxigênio de 1-2 L/min.
  3. Coloque linhas intravenosas periféricas, realize uma esternotomia e abra opericárdio 15. Administre antiarrítmicos se necessário.
  4. Coloque uma agulha de cardioplegia na aorta ascendente, posicionando-se acima da válvula aórtica, mas abaixo do arco aórtico.
  5. Coloque e conecte um saco de 1 L de solução para cardioplegia na agulha.
  6. Ventile o átrio esquerdo, veia cava inferior e veia cava superior.
  7. Aplique uma pinça cruzada aórtica proximal ao arco.
  8. Inicie o fluxo de cardioplegia pelas coronárias sob uma pressão de aproximadamente 75-80 mmHg. Monitore a pressão usando um manômetro em linha.
  9. Colhe o coração mantendo a integridade anatômica.
  10. Despeje soro fisiológico pré-resfriado sobre o coração colhido para resfriar rapidamente sua superfície.
  11. Coloque o coração em uma tigela cheia de solução fria para cardioplegia.
  12. Insira uma sonda de temperatura miocárdica no ápice do coração e um termômetro na tigela de solução cardioplégica para monitorar a temperatura.
  13. Separe a aorta da artéria pulmonar (PA).
  14. Fixe a cânula com nervuras na aorta usando abraçadeiras de seda e abraçadeiras, garantindo que a porção marcada da cânula corresponda à posição do ventrículo esquerdo (VI).
  15. Encha o cooler com a solução Saint Thomas até 60-70% da capacidade, depois transfira o coração e a solução da tigela para o cooler para um preenchimento total, maximizando a imersão.
  16. Meça e documente a solução final e a temperatura do tecido.
  17. Prenda a cânula canelada à tampa do resfriador com tubos de silicone na marca pré-definida. Certifique-se de que as marcas na cânula canelada e no tubo de silicone estejam alinhadas, para que o LV mantenha uma orientação consistente em relação à tampa quando o cooler estiver fechado, garantindo o posicionamento reprodutível do LV para cada varredura (Figura 1A).
  18. Desareje o órgão para garantir a homogeneidade ideal do campo de RM e boa relação sinal-ruído durante a coleta de dados de RM.
  19. Prenda a tampa do cooler, garantindo o alinhamento do LV.
  20. Coloque bolsas de gelo e um cooler em uma bolsa de transporte.

3. Protocolo de espectroscopia

  1. Esse protocolo é otimizado para um scanner de ressonância magnética 3T. O scanner de RM é equipado com uma opção de espectroscopia multinúcleo, incluindo um amplificador e receptor de radiofrequência banda larga de 4 kW, incluindo a bobina de fósforo padrão fornecida pelo fornecedor (P140). A bobina 31P é uma bobina de transmissão e recepção de laço único de 14 cm de diâmetro, com duas hastes para sintonia e adaptação.
  2. Avise a equipe da instalação de ressonância magnética antes do transporte e confirme a disponibilidade do exame.
  3. Prepare uma caixa de isopor com as seguintes dimensões externas: comprimento 33,5 cm, largura 28 cm (borda mais longa), largura 23 cm (borda mais curta) e espessura 4 cm. Faça uma fenda de 3,3 cm de largura em um dos lados da caixa para permitir a colocação da bobina 31P adjacente ao coração (Figura 1B).
  4. Insira o resfriador com o coração suspenso adjacente ao eixo central da bobina, mirando a localização do VE (Figura 1C). Prepare um cooler com 25,4 cm de altura e 11,4 cm de largura. O tubo de silicone é fixado a um comprimento de 7 cm a partir da superfície interna da tampa, no ponto de montagem do coração (Figura 1D).
  5. Coloque compressas de gelo em espaços ao redor do cooler, tomando cuidado para não criar espaço entre o cooler e a bobina, depois fite a tampa da caixa para garantir estabilidade durante a varredura (Figura 1E).
  6. Centralize o resfriador ao isocentro do ímã usando as guias do laser e o marco de centralização, para garantir a homogeneidade ideal deB0 (Figura 1F).
  7. Conecte a bobina 31P no conector de varredura e conecte as hastes de afinação e correspondentes à bobina (Figura 1F).
  8. Adquira imagens de explorador localizador tri-plano para verificar a posição da bobina e a proximidade ótima do LV à bobina 31P (Figura 2).
  9. Se o posicionamento do LV estiver incorreto, gire a tampa do resfriador e refaça a varredura scout.
  10. Adquirir ummapa de campo estático B 0 para shimming localizadode ordem 2 16 para garantir um campo magnético uniforme na região de interesse necessária para alta qualidade espectral:
    1. Após a aquisição do mapaB 0, um "Shimtool"16 é lançado automaticamente com esse mapa carregado (Figura 3).
    2. Pontos de clique de um polígono suavizado que delineia o músculo cardíaco em todas as fatias (Figura 3A).
    3. O "Shimtool" então realiza um ajuste de mínimos quadrados restritos para determinar a frequência de ressonância localizada e as correções de campo de calço de primeira (x, y, z) e segunda ordem (xy, xz, yz, x2-y 2, z2-(x2+y 2)/2) (Figura 3C). Envie esses termos de correção para o scanner e aplique-os às seguintes varreduras.
  11. Antes da aquisição do MRS 31P, gire as hastes de sintonia da bobina para garantir a sintonia ideal da bobina de radiofrequência e ajuste sua impedância ao sistema MR, maximizando assim a eficiência da transmissão do sinal e minimizando reflexões no sistema de radiofrequência (Figura 4).
  12. Adquirir um espectro inicial não localizado de 31P MR (tempo de repetição [TR]: 10 s, ângulo de inversão = 90° usando pulsos adiabáticos B 1-Rotação-4 Insensível (BIR-4); tempo de eco [TE] = 0,1 ms; largura de banda = 3000 hertz (Hz); 1024 pontos espectrais, 5 médias) para determinar a frequência de ressonância no centro entre os picos PCr e γ-ATP. Tempo total de aquisição: 50 s.
  13. Depois, adquire espectros de MR 31P totalmente relaxados e não localizados após ajustar a frequência de deslocamento com base no cálculo em 3,12 (TR: 16 s, ângulo de inversão = 90° usando pulsos adiabáticos BIR-4; TE = 0,1 ms; largura de banda = 3000 Hz; 512 pontos espectrais, 20 médias). Tempo total de aquisição: 5 min 20 s.
  14. Após a varredura, meça as temperaturas do líquido e do miocárdio; garantindo que o desvio do alvo seja ≤1 °C.
  15. Armazene o coração na incubadora na temperatura desejada até o próximo exame agendado.

4. Análise de dados

  1. Exporte os dados totalmente relaxados do MRS 31P como . SDAT e carregados em uma interface gráfica para processamento (Figura 5A)17.
  2. Primeiro, apodize os espectros usando um filtro lorentziano de 15 Hz (Figura 5B), depois aplique um deslocamento de fase de ordem 0 e 1, e defina a frequência para 0 partes por milhão (ppm) no centro do pico PCr (Figura 5C).
  3. Ajuste os espectros usando a funçãoAMARES 18 usando os valores de conhecimento listados na Tabela 1.
  4. Revise a análise para ajuste adequado na próxima janela (Figura 6), garantindo que cada pico seja corretamente identificado (componentes individuais) e que um sinal residual mínimo permaneça após a análise (resíduo).
  5. Calcule as razões do metabólito miocárdico PCr/ATP e PCr/Pi com base na amplitude máxima espectroscópica (Figura 7). A ressonância γ-ATP é usada como medida do ATP.
  6. Calcule o pH intracelular com base na variação química entre Pi e PCr após ajuste, para refletir a condição de temperatura14.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado após cada exame de ressonância magnética (passo 3.15). Garanta que o controle de temperatura seja mantido durante todo o processo.

5. Equações

  1. Calcule o pH intracelular (pHi) conforme descritoanteriormente 19:
    Equação 1
    Onde T é a temperatura em °C, e δ0 é a diferença de deslocamento químico observada entre as ressonâncias PCr e Pi, em ppm.

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Resultados

O shimming localizado de2ª ordem16 resultou em um campo magnético B0 mais homogêneo na região de interesse, indicado por uma redução no desvio padrão em cada ponto de tempo (0 h: 14,0 a 4,0 Hz; 4 h: 17,5 a 3,2 Hz; 8 h: 16,0 a 3,2 Hz). Isso garantia que uma excelente qualidade espectral fosse alcançada em cada momento (Figura 7). As alterações metabólicas do miocárdio durante o armazenamento a frio ex vivo indicam um rápido esgotamento do...

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Discussão

Este manuscrito descreve uma preparação cirúrgica e um protocolo de aquisição e análise da RMS 31P para avaliação seriada da energética do miocárdio durante a preservação cardíaca. 31A P MRS permite a avaliação serial e não destrutiva dos principais metabólitos cardíacos em diferentes temperaturas de armazenamento a frio, o que fornece novos insights sobre a viabilidade metabólica do tecido miocárdico. Esse protocolo de RMS 31P é relativamente rápido, exi...

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Divulgações

Não temos nenhum conflito de interesses.

Agradecimentos

Queremos reconhecer nossa equipe da Johns Hopkins, nos departamentos de cirurgia cardíaca e radiologia, por ajudar a realizar essa pesquisa com sucesso. Este estudo foi financiado pela Associação Americana de Cirurgia Torácica (AATS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IncubadoraBenchmark Scientific & nbsp;H2265-HCIncubadora de Resfriamento por Aquecimento MyTemp 65HC
Resfriador isolanteGatoradeUPC 052000047097Cooler Esportivo Isolado Gatorade
jMRUI versão 7.0Javawww.jmrui.euInterface gráfica para análise de dados
Sonda de temperatura miocárdicaDeRoyal81-030415Sonda de temperatura miocárdica DeRoyal série 400 (15mm)
Scanner de Ressonância MagnéticaPhilipshttps://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingAchieva 3T, Philips Healthcare
Bobina de fósforo de laço únicoPhilips Healthcare & nbsp;https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imagingP140, Philips Healthcare

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