Método de Interação DNA-DNA de Cromatina Associada a RNA

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para capturar as interações DNA-DNA de cromatina associadas ao RNA para mapear a organização do genoma tridimensional relacionada ao RNA.

Resumo

O Método de Interação DNA-DNA (RDD) com Cromatina Associada a RNA é uma estratégia direcionada para mapear interações de cromatina ancorada por um RNA específico. Simultaneamente, identifica loci genômicos associados ao RNA de interesse e resolve contatos de longo alcance DNA-DNA entre esses loci, permitindo inferir a organização espacial e as relações regulatórias. Na RDD, sondas antissenso biotiniladas complementares ao RNA-alvo são usadas para enriquecer complexos RNA-cromatina. As células são reticuladas, a cromatina é fragmentada e reparada por extremidades, e a ligação por proximidade é realizada usando um linker projetado para unir fragmentos de DNA que estão espacialmente adjacentes dentro dos complexos capturados. Os produtos de ligação são purificados, convertidos em bibliotecas de sequenciamento e analisados por sequenciamento de alta taxa para gerar mapas de interação ancorados em RNA. A RDD é aplicável tanto a RNAs endógenos quanto a RNAs exógenos derivados de microrganismos e vírus infectadores do hospedeiro, sendo compatível com diversos tipos celulares e condições experimentais. O método produz perfis de contato específicos para o locus, de alta resolução, adequados para dissecar o par potenciador-promotor, regulação de longo alcance e arquitetura genômica tridimensional associada a RNAs reguladores codificadores e não codificantes. Ao integrar o enriquecimento bioquímico com ligadura por proximidade e sequenciamento de próxima geração, a RDD oferece um fluxo de trabalho robusto e reprodutível para revelar como os RNAs organizam a cromatina e influenciam a expressão gênica.

Introdução

Hi-C e ChIA-PET transformaram estudos de organização do genoma tridimensional (3D) ao converter a proximidade espacial entre fragmentos de cromatina em junções covalentes de DNA que podem ser sequenciadas para inferir contatos físicos em escalas que vão de laços a^{compartimentos 1,2}. Além das proteínas, inúmeros RNAs participam das interações da cromatina, influenciando a comunicação entre potenciador/repressor e promotor e a organização da cromatina^{de ordem superior 3}; no entanto, apesar dos avanços em ensaios ancorados em proteínas, continua sendo desafiador determinar diretamente como um RNA específico organiza interações de longo alcance entre DNA-DNA entre seus loci ligados. O objetivo geral do Método de Interação DNA-DNA (RDD)4 é gerar mapas de interação de cromatina ancorados em RNA de alta resolução e ancorados em RNA que revelem como uma espécie definida de RNA se associa à cromatina e orquestra contatos DNA-DNA dentro de sua vizinhança local, possibilitando inferências mecanicistas sobre a comunicação entre potenciador/repressor e a arquitetura genômica de ordem superior centrada nesse^{RNA 5}. Metodologicamente, a RDD enriquece complexos RNA-cromatina reticulados com sondas antissenso biotiniladas contra o RNA de interesse, realiza ligadura de proximidade em complexos com um linker projetado para unir fragmentos de DNA espacialmente adjacentes e constrói bibliotecas de sequenciamento para fornecer perfis de contato específicos do locus, adequados para análises baseadas em hipóteses em diversos tipos e condições celulares, incluindo contextos envolvendo RNAs bacterianos ou virais exógenos em hospedeiros infectados. Essas características posicionam a RDD como um contraponto ancorado em RNA aos métodos estabelecidos de conformação cromossômica, fornecendo informações de contato interpretáveis em resoluções apropriadas para análise regulatória.

A justificativa para a RDD decorre das limitações das estratégias existentes de mapeamento RNA-cromatina. Abordagens de captura direcionada como ChIRP-seq e CHART-seq identificam a ocupação genômica de DNA em todo o genoma de um único RNA, um paradigma de um RNA para todo o DNA que relata ligação, mas não os contatos físicos DNA-DNA entre loci^{ocupados 6,7}. Ensaios globais, incluindo GRID-seq e MARGI, se estenderam a todo o RNA a todo o DNA, catalogando proximidades RNA-DNA em todo o genoma, mas sem resolução explícita dos contatos DNA-DNA dentro de complexos centrados em^{RNA 3,8}. Métodos multiplexados como o RD-SPRITE relatam colocalização de ordem superior entre muitos RNAs e loci de DNA e transmitem aspectos da topologia^{nuclear 9}, mas os sinais são tipicamente dominados por RNAs abundantes, que podem obscurecer RNAs reguladores de baixa abundância e limitar a profundidade direcionada para a rede de interação de um único RNA. Estratégias de enriquecimento mais ligação ancoradas em proteínas ou marcas, como ChIA-PET¹⁰,^{PLAC-seq 11} e HiChIP¹², efetivamente mapeiam laços centrados em fatores, mas não ancoram interações a um RNA definido sem um módulo de captura específico para RNA, deixando a dimensão DNA-DNA ancorada no RNA sem resolver. Ao integrar enriquecimento bioquímico direcionado com ligadura de proximidade em complexo, a RDD captura diretamente os contatos DNA-DNA entre fragmentos de cromatina co-ocupados pelo RNA de^{interesse 4}, aumenta a sensibilidade e especificidade para RNAs de baixa a moderada abundância e gera mapas de contato específicos de locus de alta resolução que complementam métodos globais centrados na ocupação (ChIRP/CHART)^6,7 e centrados na proximidade (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE^{)3. 8,9} enquanto conceitualmente paralela às estratégias de ligação ancoradas em fatores proteicos (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP)10,11,12. Os leitores devem considerar a RDD quando uma questão biológica exige resolver relações espaciais entre loci de cromatina especificamente associados a um RNA-alvo — especialmente quando esse RNA é hipotetizado para estruturar, fazer pontes ou restringir interações genômicas de longo alcance para ajustar a transcrição — ou ao priorizar alvos regulatórios supostos do conjunto de ligação de um RNA, distinguindo hubs centrados diretamente no RNA da mera coocupação, delimitando redes de aprimorador/repressor para RNAs específicos, ou acompanhando a reprogramação de contatos ancorados em RNA através de perturbações, estágios de desenvolvimento ou infecções. Nesses cenários, a RDD atende a uma necessidade não atendida ao fornecer informações de interação DNA-DNA ancoradas em RNA, com a sensibilidade, especificidade e resolução necessárias para estudos mecanicistas rigorosos.

Protocolo

NOTA: Para este método RDD, o sistema exemplo utiliza células Drosophila S2 e tanto os ncRNAs roX2 quanto 7SK ; Reagentes de reação estão listados na Tabela 1, as composições dos tampões na Tabela 2, os detalhes dos reagentes e os detalhes do instrumento estão em Materiais . A Figura 1 oferece uma visão geral do protocolo para geração de bibliotecas RDD. Procedimentos envolvendo rotação (F8) usam os seguintes parâmetros: F8, 20 rpm, uu20 e UU30. Para todos os tampões usados do Passo 2 ao Passo 10, suplemente fresco com 1x inibidor de proteinase (PI) e inibidor de RNase (RI, 0,05 U/μL).

Princípios de projeto de sondas: Para RNA novo e não reportado, projete sondas online com o Stellaris Probe Designer, depois filtre sequências não específicas usando ferramentas de alinhamento (por exemplo, alinhamento do tipo BLAST) ou UCSC BLAT, seguido pela 3′-biotinilação das sondas selecionadas. Para novos RNAs-alvo, projete sequências que correspondam ao RNA-alvo para servir como controles negativos, também submetidos à 3′-biotinilação. O controle de qualidade envolve o design de primers de transcrição reversa contra o RNA-alvo para validação da transcrição e primers direcionados para DNA genômico para qPCR a fim de avaliar a contaminação; incluam primers localizando sítios de ligação genômica e regiões não ligantes para avaliar a especificidade de ligação. Sondas relacionadas a roX2 e 7SK são fornecidas na Tabela 1.

1. Colheita de células e cruzamento duplo

1. Cultive células S2 de Drosophila a 27 °C. Procure coletar um total de aproximadamente 3 x 10⁹ células. Resuspenda as células diretamente no meio de cultura e, após a contagem Trypan-blue, coloque 8 x 10⁸ células em cada tubo cônico de 50 mL.
   1. Misture 2 μL de células com 8 μL de DPBS, adicione 10 μL de Trippan Blue e depois coloque no hemocitômetro para contagem celular.
      NOTA: As células de Drosophila S2 são apresentadas como exemplo. Tipicamente, 8 x 10⁸ células correspondem a aproximadamente 40 mL de volume de cultura processados em um único tubo cônico de 50 mL. Os usuários podem ajustar as condições da cultura e coletar quantidades celulares de acordo com o tipo celular utilizado e a abundância do RNA-alvo.
2. Adicione formaldeído a uma concentração final de 1% (p/v) e gire a 27 °C por 20 minutos.
   NOTA: Realize a fixação na temperatura de cultura ou em temperatura ambiente (RT; 20-25°C). A menos que indicado, gire no mixer (F1, 12 rpm). Para células aderentes, use um agitador orbital (50 rpm).
   ATENÇÃO: Formaldeído é tóxico; Use uma exaustora exaustiva.
3. Células de pellet a 845 x g por 5 minutos em RT; descarte supernadante ao resíduo químico/biológico apropriado. O pellet celular de 8 x¹⁰ 8 células S2 tem tipicamente cerca de 1^{cm e 3} de volume.
4. Ressuspenda o pellet em 2 mM de EGS recém-preparado até um volume total de 40 mL em DPBS e gire a 27 °C por 40 minutos.
   NOTA: Dissolva o EGS no DMSO e transfira para o DPBS (veja a Tabela 2). EGS no DMSO é perigoso.
5. Apague adicionando 2 mL de glicina 2,5 M (final 0,125 M); Gire a 27 °C por 10 minutos.
6. Pellet a 845 x g por 5 min em RT; descarte supernadante ao resíduo químico/biológico apropriado. Lave pellets duas vezes com 40 mL de DPBS pré-aquecido a 27 °C.
7. Pellet a 845 x g por 5 minutos. Ressuspenda o pellet celular em 10 mL de DPBS e conte as células. O número de células pode diminuir durante a etapa de reticulação, tipicamente cerca de 30%.
8. Aliquota 1 x 10⁹ células em cada tubo de 50 mL; pellet a 845 x g por 5 minutos em RT; Descarte o supernadante. Armazene os pellets a −80 °C.
   NOTA: Todos os passos de reação a seguir são para uma biblioteca RDD.

2. Lise celular e permeabilização dos núcleos

1. Pegue 1 célula de 10⁹ S2 de dupla reticulação do freezer de −80 °C. Descongele em água gelada por 30 minutos.
2. Resuspenda as células em 50 mL de DPBS, centrifuge a 845 x g por 5 minutos em RT e descarte o sobrenadante.
3. Lisis celular: Resuspenda o pellet celular em 20 mL de buffer de lise FA 0,1% (sem Triton X-100). Gire no RT por 15 minutos. Verifique por microscopia; Ajuste o tempo por tipo de célula. A lise bem-sucedida é indicada pela permeabilização da membrana plasmática e liberação citoplasmática, de modo que núcleos se tornam facilmente visíveis como estruturas distintas sob um microscópio óptico padrão (Figura 2A).
4. Permeabilização dos núcleos: Adicione 1,8 mL de SDS 10% (1% final). Gire a 37 °C por 15 minutos. Centrifuge a 3.200 x g por 20 minutos em RT e descarte o sobrenadante. Verificação por microscopia (Figura 2B); Ajuste o tempo por tipo de célula. Núcleos parecem mais escuros, semelhantes a véus de membrana, ou alguns são separados. Repita até a lise estar completa.
5. Lavagem do núcleo: Resuspenda o pellet em 20 mL de tampão de lise FA 0,1% (sem Triton X-100), gire em RT por 10 min, depois centrifuge a 3.200 x g por 20 minutos em RT, descarte o sobrenadante e marque o tamanho do núcleo do pellet. Armazene o pellet de núcleos a −80 °C para uso posterior.

3. Fragmentação da cromatina

1. Ressuspenda o pellet de núcleos em 15 mL de tampão de lise FA de 0,1% (com Triton X-100). Aliquota 1,5 mL do núcleo em suspensão em cada tubo de ensaio de fundo arredondado de 14 mL, evitando bolhas.
   1. Marque o tamanho do pellet antes da sonicação para comparação e repita a sonicação se o pellet permanecer grande após a sonicação.
2. Sonice em amplitude de 38% por 4,5 minutos, com ciclos de 30 s LIGADO / 30 segundos DESLIGADO. Colete toda a cromatina sonicada em um tubo de 15 mL e centrifuge a 3.200 x g por 20 minutos em RT, depois transfira o sobrenadante (~13 mL) para um novo tubo de 15 mL.

4. Pré-clear cromatina com esferas C1

1. Prepare esferas de estreptavidina C1: Aliquota 400 μL de esferas de estreptavidina C1 se transforme em um tubo de 1,5 mL (100 μL por 1 × 10 células⁹ S2), coloque sobre o ímã por 30 s e remova o sobrenadante. Lave duas vezes com 200 μL de buffer de lise FA 0,1% (com Triton X-100), depois resuspenda em 100 μL de buffer de lise FA 0,1% (com Triton X-100).
2. Pré-clareza de cromatina: Adicione os 100 μL de esferas preparadas de C1 de Streptavidina no tubo contendo ~13 mL de sobrenadante de cromatina sonicada (do Passo 3.2); rotacionar 20 minutos no RT; coloque em um suporte magnético por 1 minuto e transfira o sobrenadante (cromatina pré-liberada) para novos tubos de 50 mL; tomar 10 μL e armazenar a −20 °C para QC1 (Figura 3A).

5. Hibridizar a sonda de RNA com a cromatina pré-liberada

1. Adicionar 2 volumes (26 mL) de tampão de hibridização recém-preparado a 1 volume (13 mL) de cromatina pré-limpada; Faça rotação de 30 minutos no RT.
2. Aliquota a mistura em três tubos de 15 mL; adicionar 6 μL de sondas biotiniladas de 100 μM (oligonucleotídeo de DNA, Tabela 1) a cada amostra (2 μL por tubo de 15 mL); gire a 37 °C durante a noite. Sele as tampas dos tubos com filme.

6. Imobilizar sonda - complexo de cromatina em esferas C1

1. Bloquear esferas de estreptavidina C1 com tampão bloqueador: Pegue 400 μL de esferas frescas de estreptavidina C1 e lave duas vezes com 800 μL de tampão de lise FA de 0,1% (sem Triton X-100); adicionar 400 μL de Buffer de Bloqueio e incubar em um misturador (F8) por 30 minutos em RT. Colocar sobre um ímã por 10 minutos e descartar o sobrenadante; lavar três vezes com 800 μL de buffer de lise FA de 0,1% (sem Triton X-100). Para cada lavagem, faça uma pipeta suave para misturar, coloque sobre o ímã por pelo menos 30 segundos e depois descarte o sobrenadante.
2. Resuspenda as esferas de C1 em 400 μL de tampão de hibridização.
3. Imobilize o complexo sonda-cromatina nas esferas de estreptavidina C1: Adicione as esferas de estreptavidina C1 tratadas com Blocking Buffer à cromatina hibridizada correspondente e gire por 2,5 horas em RT.
4. Transfira a reação de imobilização de tubos de 15 mL para um tubo de 1,5 mL usando um suporte magnético. Coloque cada tubo de 15 mL em um suporte magnético por 5 minutos; Remova o sobrenadante. Ressuspenda as esferas com 1 mL de buffer de lavagem e transfira para um novo tubo de 1,5 mL.
5. Lave as esferas cinco vezes com 800 μL de buffer de lavagem, depois duas vezes com buffer TE. Para lavar, adicione o buffer, incube na batedeira (F1, 12 rpm) por 5 minutos a 37 °C, coloque em uma grade magnética por 30 segundos e descarte o sobrenadante.
6. Segure as esferas em 1.000 μL de buffer TE (1x PI) em RT.

7. Bloqueio de locais desocupados em esferas de C1 com Iodoacetil-PEG2-Biotina (IPB) desnaturada

1. Dissolva 4,8 mg de IPB em 400 μL de tampão de lavagem IPB; Gire em RT por 15 minutos.
2. Solução β-ME: Adicionar 1 μL de β-ME a 312 μL de H₂O; misture e gire no RT por 15 minutos.
3. Desnature do IPB: Adicionar 44 μL da solução β-ME a 400 μL de IPB; misture e gire no RT por 15 minutos.
4. Bloqueie as esferas C1: Adicione 220 μL do IPB desnaturado às esferas C1 ligadas ao complexo sonda-cromatina (em 1.000 μL TE); Gire em RT por 15 minutos.
5. Lave as esferas C1 com TE cinco vezes. Adicione o buffer, incube em uma batedeira (F8) por 5 minutos em RT, depois coloque em um suporte magnético por 30 segundos e descarte o sobrenadante.

8. Reparo final de cromatina (em contas)

1. Adicione 693 μL de mistura de reparo final à cromatina nas esferas de C1 e misture bem; depois, adicione 7 μL de DNA polimerase T4.
2. Incubar no termomisturador (800 rpm) a 12 °C por 30 minutos; depois na batedeira (F8) a 16 °C por 15 minutos.
3. Lave as esferas três vezes com 800 μL de tampão ChIA-PET gelado, depois uma vez com TE. Para cada lavagem, faça uma pipeta suave para misturar, coloque sobre o ímã por pelo menos 30 segundos e depois descarte o sobrenadante.

9. Cauda A de cromatina (nas contas)

1. Adicione 693 μL de mistura de A-tailing à cromatina nas esferas C1 e misture bem, depois adicione 7 μL do fragmento de Klenow (exo-3'-5').
2. Incube na batedeira (F1, 12 rpm) a 37 °C por 50 minutos. Lave as esferas três vezes com 800 μL de tampão ChIA-PET gelado, depois uma vez com tampão de elução.

10. Ligação de proximidade por cromatina (em contas)

1. Adicione 1.390 μL de mistura de ligação de proximidade à cromatina nas esferas de C1. Incube na batedeira (F8) em RT por 5 minutos.
2. Depois, adicione 10 μL de ligase de DNA T4. Gire no mixer (F8) em RT por 5 minutos, depois mude para F1 (12 rpm) em RT por 50 minutos, seguido de 16 °C durante a noite.
3. Lave as esferas três vezes com 800 μL de tampão ChIA-PET gelado, depois duas vezes com tampão TE.

11. Liberação do DNA de cromatina ligado por proximidade das esferas C1

1. Adicione 480 μL de tampão de elução LC ChIP à cromatina nas esferas C1, misture bem e adicione 20 μL de 20 mg/mL de Proteinase K para descruzamento.
2. Incube no termomisturador (950 rpm) a 65 °C durante a noite.

12. Purificação de DNA ligada por proximidade (com Fenol: Clorofórmio: reagentes IAA)

1. Gire o tubo de travamento de fase de alta densidade a 13.500 x g por 2 minutos em RT. Adicione produtos de descruzamento (500 μL) no tubo de travamento de fase de alta densidade.
2. Adicione 500 μL de Fenol:Clorofórmio:IAA (usando uma ponta de pipeta de 5 mL) ao tubo de travamento de fase de alta densidade. Misture suavemente à mão.
   ATENÇÃO: Funcione em uma exaustão.
3. Centrifuge a 13.500 x g por 6 minutos no RT. Durante a centrifugação, prepare um tubo de 1,5 mL adicionando 52 μL de acetato de sódio 3 M (pH 5,5) no fundo. Coloque 1 μL de glicogênio com corante azul na tampo. Não misture nem feche o tubo neste momento.
4. Transfira rapidamente o sobrenadante do tubo de bloqueio de fase de alta densidade para o tubo preparado de 1,5 mL.
5. Adicione 520 μL de isopropanol gelado ao tubo de 1,5 mL. Misture suavemente e depois coloque a -80 °C durante a noite.
6. Remova o tubo de -80 °C e descongele em RT (~10 min). Centrifuge a 13.500 x g por ~1 h a 4 °C para precipitar DNA. Um pellet azul estará presente na parte inferior do tubo.
7. Lave a cápsula de DNA com etanol 75% e remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 800 μL de etanol gelado a 75%, centrifuge a 13.500 x g por 5 minutos a 4 °C e remova o sobrenadante. Repita a lavagem com etanol uma vez.
   ATENÇÃO: Remova o sobrenadante imediatamente após a centrifugação: primeiro com uma ponta de 1 mL, depois com uma ponta de 100 μL. Tubos quentes podem desalojar a bola azul.
8. Após a última lavagem com etanol, centrifuge a 13.500 x g por 10 minutos a 4 °C para coletar qualquer etanol residual no fundo e, em seguida, remova cuidadosamente o etanol restante.
9. Seque o pellet de DNA em vácuo (normalmente de 1 min 30 s a 2 min). Resuspenda a pastilha de DNA em 10 μL de tampão de elução e incube em RT por cerca de 2 horas. Quantifique o DNA usando um quantificador de ácidos nucleicos e avalie a qualidade com um sistema automático de eletroforese capilar (Figura 3B-C).

13. Marcação de DNA Tn5 ligada por proximidade

1. Teste de marcação Tn5: Prepare um volume total de reação de 50 μL de acordo com a Tabela 1. Em um tubo PCR sobre gelo, adicione sequencialmente 50 ng de DNA QC1, ddH₂O e 12,5 μL de tampão de marcação 4x. Por fim, adicione a quantidade necessária de enzima Tn5. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo de 10 a 20 vezes após cada adição, evitando bolhas. Gire rapidamente o tubo se necessário.
   NOTA: Misturar suavemente e evitar bolhas é fundamental para a marcação. Além disso, a quantidade de Tn5 deve ser otimizada empiricamente para alcançar a distribuição desejada de fragmentos (predominantemente 200 bp-1 kb), e os usuários podem ajustar a faixa de tamanho ajustando a entrada do Tn5.
2. Reação de marcação: Incube a reação a 55 °C por 10 minutos em um instrumento de PCR com a tampa ajustada a 70 °C, depois mantenha a 4 °C.
3. Liberação de Tn5 e purificação do DNA: Adicione 50 μL de tampão de Elução ChIP e 1 μL de Proteinase K ao DNA marcado (para uma concentração final de SDS de 0,5%). Misture e incube no termomisturador a 65 °C e 900 rpm por 30 minutos. Purifique o DNA com um kit de purificação de DNA e quantifique o DNA usando um sistema automático de eletroforese capilar (Figura 3D).
   NOTA: Neste estágio, os fragmentos de DNA devem variar predominantemente de 200 pb a 1 kb. A relação enzima Tn5 para DNA deve ser otimizada empiricamente.
4. Escalonamento da Marcação Tn5: Com base nos resultados do teste Tn5, amplie a reação para DNA ligado por proximidade usando as mesmas condições. Após a marcação, retire a amostra do instrumento de PCR e coloque-a no gelo. Centrifuge brevemente para baixo, incube em RT por 2 minutos e depois adicione 5,5 μL de 10% de SDS (p/v; concentração final de SDS: 1%). Misture pipetando para cima e para baixo de 10 a 20 vezes, evitando bolhas, e desacelere brevemente. Incube amostras a 37 °C em um instrumento de PCR por pelo menos 15 minutos. O DNA marcado pode ser armazenado a -20 °C por vários dias.

14. Contas M280 bloqueando

1. Pegue 20 μL de esferas M280 e lave duas vezes com 200 μL de 1x buffer preto e branco. Para lavar, adicione um buffer, ressuspenda as contas pipetando, centrifuge brevemente para baixo, coloque sobre o ímã por 30 segundos e remova o sobrenadante.
2. Bloqueio de esferas com buffer de bloqueio: Resuspenda as esferas M280 em 100 μL de buffer de bloqueio; gire no mixer (F8) em RT por 45 minutos.
3. Lavagem de Contas: Faça uma rápida rotação para baixo, coloque no ímã por 10 minutos e descarte o buffer de bloqueio. Lave as esferas duas vezes com 200 μL de 2x buffer preto e branco.
4. Bloqueio de esferas com DNA genômico: Ressuspenda as esferas em 100 μL de 2x tampão B&W, adicione 100 μL de DNA genômico cisalhado (~500 ng, 300-500 bp), misture bem e gire no misturador (F8) em RT por 30 minutos.
5. Descarte a mistura genômica de DNA e lave as esferas duas vezes com 200 μL de 1x tampão B&W.

15. Imobilização de DNA ligado em contas M280

1. Ligando DNA ligado às Esferas M280: Descarte 1x buffer em preto e branco. Adicione todo o DNA fragmentado ligado às esferas M280, misture e gire no mixer (F8) em RT por 45 minutos.
2. Gire rapidamente para baixo, coloque no ímã e descarte o sobrenadante. Lave as esferas cinco vezes com 500 μL de tampão de lavagem pré-aquecido a 37 °C; uma vez com 500 μL de 1x B&W; e uma vez com 200 μL de 1x B&W. Coloque no ímã por 1 min, misture suavemente no fundo do tubo e descarte o sobrenadante. Adicione 30 μL de tampão de elução às esferas (não misturar).
   1. Para lavar, adicione o buffer, incube por 5 minutos na batedeira (F8), coloque no ímã 30 s e depois descarte o sobrenadante. Esferas com DNA ligado ligado podem ser armazenadas a -20 °C.

16. Amplificação de DNA ligado em esferas M280

1. Prepare a reação por PCR (de acordo com o kit de preparação da biblioteca de DNA). Transfira os tubos de PCR para a máquina de PCR e configure o programa.
   NOTA: Ciclos de amplificação por PCR são críticos para a qualidade final da biblioteca; Aumentar o número de ciclos reduz a complexidade da biblioteca. Otimize o número de ciclos empiricamente e geralmente não exceda 15 ciclos.
2. Purificar o produto de PCR usando esferas magnéticas (Figura 3E). Seleção de tamanho: Use esferas magnéticas (0,8-0,61) para fazer a seleção de tamanho duplo da biblioteca RDD.
   1. A biblioteca final de DNA deve variar predominantemente de 250 a 600 pb (Figura 3F). Certifique-se de que 10-30 ng de DNA da biblioteca sejam medidos por quantificador de ácidos nucleicos para sequenciamento.
3. Sequenciamento: Sujeito para sequenciamento Illumina com 2x 150 pb. A profundidade do sequenciamento depende da expressão de RNA, densidade do local de ligação e padrões genômicos em todo o genoma. Aqui, roX2 satura em leituras de ~23M e 7SK em leituras de ~8M, então esta última precisa de menos profundidade. Comece por espécie, depois avalie a redundância para qualquer profundidade extra: ~5M para Drosophila, ~20M para humano/camundongo, ajustando por métricas de controle de qualidade.

Resultados

Este protocolo descreve o método RDD para detectar interações DNA e DNA de cromatina associadas a RNA. O fluxo de trabalho começa com o enriquecimento bioquímico de complexos RNA-cromatina usando sondas biotiniladas, seguido por ligação por proximidade para ligar fragmentos de DNA espacialmente adjacentes. Após a construção das bibliotecas de sequenciamento, é realizado o sequenciamento de alta produtividade.

A análise bioinformática dos dados RDD é simplificada pela plataforma^{ChIA-PIPE 13}. Etapas principais nesse pipeline analítico incluem: cortar linkers de sequenciamento das leituras brutas, mapear leituras de extremidade pareada para o genoma de referência, filtrar pares de leitura mapeados de forma única, remover duplicatas de PCR e atribuir interações a sítios de RNA alvo com base em coordenadas da sonda. Normalmente, cerca de 50% das leituras sequenciadas são mantidas com sucesso após filtragem de linker e qualidade. Eventos de interação válidos foram então agregados para gerar mapas de contato específicos do locus, fornecendo perfis detalhados da arquitetura de cromatina guiada por RNA. Para dados RDD, implementamos três ajustes ChIA-PIPE: a sequência do linker DDD ("ACGCGATATCTTATCTGACT") foi usada no lugar do linker padrão ChIA-PET ("ACGCGATGGCTACTCTGACT"); o agrupamento em loop foi realizado com uma extensão PET encurtada de 50 pb, além dos 500 pbbs padrão, para aumentar a precisão posicional dos sítios de interação do RNA; e a cobertura de enriquecimento de RNA foi calculada com deepTools (bamCoverage v3.5.1) usando um tamanho de bin de 1 ponto base. Essas modificações — configuração do linker, redução da extensão PET para clustering mais fino, e ChIA-PIPE adaptado à cobertura de alta resolução para as bibliotecas RDD.

A Figura 4 apresenta resultados representativos de RDD para dois RNAs não codificantes: roX2¹⁴ (Figura 4A,C; verde), um complexo de RNA de compensação de dosagem envolvido na regulação da estrutura do cromossomo X e da expressão gênica em Drosophila, e 7SK¹⁵ (Figura 4B,D; roxo), um pequeno RNA nuclear altamente conservado que modula o alongamento da transcrição regulando a atividade P-TEFb em metazoários. As interações de ligação ao RNA e cromatina detectadas pela RDD são visualizadas juntamente com os dados RNAPII ChIA-PET (arcos azuis), destacando a relação estrutural entre os laços associados ao RNA e elementos-chave regulatórios como promotores (P), potenciadores (E) e locais de início ou fim da transcrição (TSS/TES). Picos de interação proeminentes nos dados agregados apoiam um modelo no qual tanto roX2 quanto 7SK mediam contatos críticos de potenciador-promotor ou cromatina de longo alcance.

A análise multidimensional é realizada integrando interações ancoradas em RDD com mapas de conformação de cromatina genômica Hi-C (mapas de calor vermelhos do painel inferior) e marcas epigenômicas (H3K27ac, H3K27me3), transcrição nascente (RNA-seq) e dados RNAPII ChIA-PET (Figura 4C,D). Nessas regiões, domínios topologicamente associados (TADs) são claramente visualizados, com laços de cromatina guiados por RNA frequentemente situados nas fronteiras dos TADs ou abrangendo múltiplos TADs. Anotações adicionais com dados de modificação de histonas e transcrição permitem a discriminação entre regiões ativas e inativas da cromatina. Os principais centros reguladores centrados em RNA estão circulados na figura.

Padrões distintos surgem para diferentes ncRNAs. roX2 é caracterizado por se ligar em regiões TES e se tornar em loop para TSSs, frequentemente localizando nos limites TAD e formando contatos de longo alcance que podem cruzar múltiplos TADs. Em contraste, o 7SK predominantemente se liga a potenciadores e forma loops de alcance mais curto com promotores vizinhos, geralmente sem atravessar as fronteiras do TAD.

Coletivamente, esses resultados confirmam que a RDD é um método confiável e de alta resolução para dissecar a cromatina 3D específica de RNA. Essa abordagem permite a investigação direta dos papéis espaciais dos RNAs reguladores na arquitetura genômica e na expressão gênica em diversos contextos biológicos.

Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho de geração de bibliotecas RDD. As etapas centrais do fluxo de trabalho para geração de bibliotecas RDD são apresentadas em sequência e acompanhadas por ilustrações esquemáticas correspondentes. O procedimento começa com reticulação dupla e marcação de cromatina, seguida de hibridização com uma sonda de RNA modificada por biotina e imobilização via estreptavidina. Passos subsequentes incluem A-tailing, ligação de proximidade com linkers modificados por biotina e construção de bibliotecas. Após a ligação do DNA, são realizadas purificações, fragmentação mediada por Tn5, enriquecimento de biotina e amplificação da biblioteca. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Imagens representativas de microscopia das células de Drosophila S2 demonstrando critérios visuais de controle de qualidade para lise celular e permeabilização dos núcleos. (A) A lise celular bem-sucedida é caracterizada pela permeabilização da membrana plasmática e liberação citoplasmática, tornando os núcleos facilmente visíveis. (B) Permeabilização bem-sucedida dos núcleos é indicada pelo inchaço celular, descolamento parcial da membrana plasmática e núcleos intactos e claramente visíveis. Barra da escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise eletroferograma de preparações de cromatina. Captura de tela de um sistema de eletroforese capilar eletroferogramas perfilando várias amostras de cromatina. (A) Exibe cromatina fragmentada (sonicação) com tamanho que varia de aproximadamente 1000 a 3000 pb, indicando fragmentação bem-sucedida. (B) Ilustra a cromatina associada ao RNA (sondas associadas ao RNA + não ligadas), com um pico menor representando sondas não ligadas, conforme indicado pela seta. (C) Apresenta cromatina associada a RNA, também apresentando uma faixa de concentração de 1000 a 3000 pb, refletindo complexos RNA-proteína. (D) Mostra cromatina marcada com Tn5, revelando um alcance indicativo da eficiência da marcação. (E) Exibe a distribuição do tamanho dos fragmentos da biblioteca de sequenciamento após amplificação, abrangendo aproximadamente 180-1000 pb. (F) Mostra a distribuição do tamanho do fragmento da biblioteca de sequenciamento após seleção de tamanho, com fragmentos predominantemente enriquecidos na faixa de ~250-600 pb. Os valores de RFU (unidades relativas de fluorescência) são indicados para cada amostra, demonstrando a quantificação eficaz da integridade e do tamanho da cromatina. Os picos roxos representam o marcador. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Resultados representativos da RDD para interações com cromatina associadas a ncRNA. (A-B) Exibe as localizações genômicas da ligação de ncRNA roX2 (verde) e 7SK (roxa), juntamente com os respectivos loops de interação remota da cromatina. Dados do RNAPII ChIA-PET (azul) revelam uma clara relação regulatória entre esses ncRNAs e a expressão gênica, com picos indicando força de interação. Abreviações: TSS = local de início da transcrição; TES = sítio final da transcrição; P = promotor; E = realçador. (C-D) Fornece uma visão de dimensão mais alta da relação entre os laços de cromatina relacionados a ncRNA roX2 e 7SK e os TADs (vermelho), bem como os diferentes estados ativos versus inativos da cromatina e níveis de expressão gênica. Círculos destacam áreas com interações significativas entre TADs. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Reagentes de reação RDD. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Composições de buffer RDD. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

Etapas críticas do método
Estimar a quantidade de sondas de RNA e os níveis correspondentes de RNA na cromatina é crucial. O excesso de sondas pode levar a que sondas não ligadas ocupem sítios de estreptavidina durante a etapa de imobilização, o que pode dificultar a captura pretendida das interações de RNA-alvo. Além disso, adicionar estreptavidina em excesso desperdiça materiais e exige mais IBP desnaturado para bloquear eficazmente os locais vazios. Bloqueios insuficientes podem impactar negativamente a eficiência da ligação de proximidade subsequente, especialmente porque o ligador de ligação de proximidade também apresenta modificações de biotina. Se o bloqueio não for realizado adequadamente, partes do linker podem se ligar diretamente às esferas de estreptavidina, complicando os resultados. Além disso, a proporção de linker para cromatina deve ser cuidadosamente estimada — um linker excessivo pode causar a marcação de ambas as extremidades do DNA da cromatina, inibindo a ligação de proximidade eficaz.

Modificações do método
Neste estudo, ilustramos o método RDD usando células Drosophila S2 com ncRNA roX2 como exemplo. Os volumes dos reagentes precisam ser ajustados com base no tipo celular e nos níveis de expressão de ncRNA; se a expressão de ncRNA for alta, pode-se reduzir a quantidade celular ou aumentar a concentração de RNA na sonda, e vice-versa. Embora esse protocolo imobilize a cromatina em esferas, uma abordagem alternativa envolve a realização de ligadura de proximidade in situ seguida de enriquecimento com sondas de RNA.

Especificidade, controles e controle de qualidade
Anteriormente descrevemos e validamos RDDs e realizamos RDDs paralelos em múltiplos RNAs, mostrando forte especificidade; Os leitores podem consultar a obra^{anterior 4,16}. A RDD requer enriquecimento dependente da sonda, específico do locus, que seja reproduzível e, quando possível, validado ortogonalmente. Interações verdadeiras atendem a três critérios: enriquecimento em loci direcionados pela sonda versus regiões próximas não ligantes; dependência da sonda (ausente ou marcadamente reduzida nos controles negativos); e reprodutibilidade entre réplicas biológicas e validação independente (por exemplo, RT-qPCR). As sondas antissenso foram projetadas com Stellaris, triadas por BLAST/BLAT para remover alvos fora do alvo, encomendadas com 3'-biotina e validadas por RT e qPCR (incluindo verificações de contaminação por DNA e enriquecimento entre local e não local). Recomendamos três controles — sondas sem sonda, sem embaralhamento/não direcionadas, e sondas de RNA não relacionado ou sem região de ligação — e avaliamos a especificidade comparando a cobertura de qPCR ou sequenciamento entre amostras alvo e controle, reportando enriquecimento de dobras e fundo. Para RNAs de baixa abundância, aumente a densidade da sonda (dentro de restrições fora do alvo), eleve a profundidade de sequenciamento e realize validação ortogonal.

Solução de problemas do método
Se as interações RNA-cromatina capturadas forem notavelmente baixas, a eficiência da ligação por proximidade pode precisar de otimização por meio de ajustes nas quantidades de ligador e cromatina. Além disso, picos elevados de sondas não ligadas foram observados por meio de eletroferogramas capilares automáticos. Os resultados indicam que muitas sondas foram adicionadas, o que pode ser corrigido reduzindo a quantidade utilizada.

Limitações do método
Uma vantagem chave do método RDD é sua eficiência em capturar interações específicas de cromatina associadas ao RNA, o que significa que cada experimento pode focar apenas em um RNA específico por vez. Além disso, como a ligação de proximidade é projetada para detectar interações par a par, as interações entre múltiplos locais não podem ser avaliadas simultaneamente.

Significado do método
O método RDD não apenas revela os sítios de ligação ao RNA, mas também elucida as relações de interação entre esses locais, ampliando nossa compreensão da arquitetura da cromatina.

Usos práticos e potencial futuro da RDD
A RDD é adequada para vários RNAs associados à cromatina, incluindo RNAs endógenos hospedeiros e RNAs exógenos de vírus ou outros microrganismos, destacando sua ampla aplicabilidade em diferentes áreas de pesquisa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G
1 M acetato de magnésio	Sigma-Aldrich	63052-100ML
1 M Tris-HCl pH 7,0	Invitrogen	AM9851
1 M Tris-HCl pH 8,0	Invitrogen	AM9856
Tubos de 1,5 mL	Eppendorf	30108051
10 mM dATP	Invitrogen	18252015
SDS 10% (peso/volume)	Invitrogen	AM9822
10 vezes; Buffer de cauda A	NEB	B7002S
10 vezes; Buffer de reparo final	NEB	B6002S
10 vezes; T4 DNA ligase tampão	NEB	B0202S
10 vezes; Buffer TBE	Invitrogen	AM9863
Tubos de ensaio de fundo redondo de 14 mL	Corning	352057
2 vezes; Mistura master PCR	NEB	M0541
20 e vezes; Buffer SSC	Invitrogen	AM9770
200-μ Tubos L PCR	Sangon Biotech	F611541-0010
Frascos de armazenamento de PET quadrados de 250 mL	Corning	431531
2-Mercaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250-100mL	! ATENÇÃO β-ME é tóxico; Sempre use em uma exaustão.
Tubos de 2 mL	Eppendorf	22431048
3 M Acetato de sódio pH 5,5	Invitrogen	AM9740
5 M NaCl	Invitrogen	AM9759
5 M acetato de potássio	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
Garrafas quadradas de armazenamento PET de 500 mL	Corning	431532
Balanço analítico	Sartorius	BP211D
Contador automático de células	Contraestrela	IC1000
Sistema automático de eletroforese capilar	Bióptico	C100100
Sondas biotiniladas	GENEWIZ		Consulte Tabela 1
Pólvora bloqueadora	Invitrogen	T2015
Bridge linker oligos	GENEWIZ		Consulte Tabela 1
Incubadora CO2	Termo Científica	51033549
Dimetil sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100mL
Kit de preparação de biblioteca de DNA V2 para Illumina	Vazyme	TD501
Kit de purificação de DNA	Zymo	D4013
Dulbecco' S soro salino tamponado com fosfato (DPBS) (1&vezes;)	Gibco	14190250
Coquetel inibidor de protease livre de EDTA	Roche	11836170001
EGS (Etilenoglicol bis[succiniMidylsuccinate])	Termo Científica	21565
Amortecedor de elução	Qiagen	19086
Álcool etílico, puro	Sigma-Aldrich	E7023-500mL
Solução de formaldeído	Sigma-Aldrich	47608-250mL-F	! ATENÇÃO: Formaldeído é tóxico; Sempre use em uma exaustão.
Formamida	Invitrogen	AM9342
Sistema de imagem em gel	Tanon	3500R
Glicina	Invitrogen	50046-1kg
Glicogênio com corante azul	Invitrogen	AM9516
Cartucho de alta sensibilidade	Bióptico	C105105
Tubos de travamento de fase de alta densidade (1,5 mL)	Qiagen	129046
Kit de ensaio fluorométrico de dsDNA de alta sensibilidade	Invitrogen	Q32851
Kit Index V2 para Illumina	Vazyme	TD202
Iodoacetil-PEG2-Biotina (IPB)	Termo Científica	21334
Álcool isopropílico	Sigma-Aldrich	I9030	! ATENÇÃO: O álcool isopropílico é tóxico; Sempre use em uma exaustão.
Cartucho Kilo base	Bióptico	C105106
Fragmento de Klenow (3'→ 5' exo-)	NEB	M0212L
Esferas magnéticas	Beckman	A63881
Rack de separação magnética & nbsp; para tubo de 15 mL	Invitrogen	12301D
Rack de separação magnética & nbsp; para tubo de 2 mL	Invitrogen	12321D
Rack de separação magnética para tubo de PCR	NEB	S1515S
Incubadora microbiológica	Termo Científica	IMH180
Microscópio	Nikon	Eclipse TS2
Misturador	ELMI	RM-2L
N,N-Dimetilformamida (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	! ATENÇÃO: DMF é tóxico; Sempre use em uma exaustão.
Microcentrífuga não refrigerada	Eppendorf	5405000204
Água livre de nuclease (não tratada com DEPC, 1000 mL)	Invitrogen	AM9932
Água livre de nuclease (não tratada com DEPC, 50 mL)	Invitrogen	AM9937
Quantificador de ácidos nucleicos	Invitrogen	Q33226
Agitador orbital	Cristal	SYC-2102
Fenol:Clorofórmio:IAA	Solarbio	P1012-100mL
Solução de K de proteinase	Invitrogen	AM2548
Centrífuga refrigerada	Eppendorf	22628180
Incubadora refrigerada	Termo Científica	IMP180
Microcentrífuga refrigerada	Eppendorf	5404F1621754
Geladeira	Haier	DW-25L262
Inibidor de RNase	Ambion	AM2696
Tubos de 15 mL sem RNase	Invitrogen	AM12500
Tubos de 50 mL sem RNase	Invitrogen	AM12502
Sonicator	Sonics & Materiais	VCX130
Esferas magnéticas revestidas com estreptavidina C1	Invitrogen	65001
Esferas magnéticas revestidas com estreptavidina M-280	Invitrogen	11205D
Ligase de DNA T4	NEB	M0202S
DNA polimerase T4	NEB	M0203S
pH do tampão TE 8,0	Invitrogen	AM9849
Ciclador térmico	Bio-Rad	1851148
Termomisturador	Eppendorf	5382000023
Triton X-100	Acros Organics	327371000-100mL
Freezer de ultra baixa temperatura	Termo Científica	995
Concentrador a vácuo	TOMY	MV-100