Desenvolvimento e Validação de um Método Rápido LC-MS/MS para Quantificação de Carfilzomib em Plasma de Pacientes com Mieloma Múltiplo

Summary

Este estudo teve como objetivo desenvolver e validar um método rápido e sensível de cromatografia líquida-espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS) para a quantificação do carfilzomibe em plasma humano. O método totalmente validado apoia o monitoramento terapêutico de medicamentos em pacientes com mieloma múltiplo, permitindo assim otimização personalizada da dose.

Abstract

O carfilzomib, um inibidor de proteassoma de segunda geração, requer monitoramento terapêutico de medicamentos (TDM). Este estudo teve como objetivo desenvolver e validar um método sensível e robusto de cromatografia líquida-espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS) para a quantificação do carfilzomibe em plasma humano. Amostras de plasma foram processadas usando precipitação proteica com acetonitrila (ACN). A separação cromatográfica foi alcançada em uma coluna C₁₈ (2,1 mm × 100 mm, 3,5 μm) mantida a 40 °C, com uma fase móvel composta por ACN e 10 mmol/L de acetato de amônio em água (80:20, v/v) entregues a uma vazão de 0,35 mL/min. O método demonstrou excelente linearidade em uma faixa de concentração de 2,00-1000,00 ng/mL. Além disso, foram observadas altas precisões e exatidão intradiárias e interdias, com taxas de recuperação do carfilzomibe variando de 84,1% a 93,0%. Esse método validado de LC-MS/MS permite a determinação precisa, eficiente e sensível das concentrações de carfilzomib no plasma de pacientes com mieloma múltiplo, apoiando assim a otimização da terapia baseada em carfilzomib.

Introduction

O mieloma múltiplo (MM) é uma malignidade hematológica caracterizada pela proliferação clonal de células plasmáticas na medula^{óssea 1}. Representa a segunda malignidade hematológica mais comum no^{mundo 2}, representando aproximadamente 10% de todos os cânceres^{hematológicos 3}. Ao longo dos anos, avanços na terapia medicamentosa, incluindo a introdução de inibidores de proteasomosmos, fármacos imunomoduladores e anticorpos monoclonais, levaram a melhores resultados terapêuticos. No entanto, uma proporção significativa (20%-30%) dos pacientes com MM continua a apresentar desafios como sobrevivência livre de progressão curta (PFS^)4,5 reações adversas (ADRs), resistência a medicamentos e^recaída6.

^{Bortezomib, o inibidor de proteassoma 7 de primeira da classe}, transformou o cenário terapêutico da MM. Apesar de sua eficácia, a maioria dos pacientes desenvolve doença recaída ou refratária, frequentemente acompanhada de resistência ao bortezomib ^8,9 e taxas reduzidas de resposta ao tratamento^{e sobrevivência 10,11}. Esses desafios ressaltam a necessidade urgente de abordagens de tratamento inovadoras para melhorar os resultados na MM. O Carfilzomib, um inibidor de proteassoma de segunda geração aprovado pela FDA, oferece um perfil farmacocinético mais estável, permitindo a supressão sustentada da atividade semelhante à quimotripsina e proporcionando potentes efeitos antimieloma. É geralmente indicado para pacientes com MM que passaram por pelo menos duas linhas de terapia prévias, incluindo tratamento com bortezomibe e um medicamento^{imunomodulador 1,11}. Pesquisas mostraram que o carfilzomib alcança uma inibição proteasomo mais robusta nas células do mieloma do que o bortezomibe e possui a capacidade de superar a resistência^{ao bortezomib 12,13}.

Os métodos mais amplamente utilizados para quantificar concentrações de fármacos em matrizes biológicas incluem cromatografia líquida de alta performance-detecção ultravioleta (HPLC-UV), ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) e cromatografia líquida-espectrometria de massas tandem (LC-MS/MS⁾¹⁴. Embora o HPLC-UV ofereça simplicidade operacional e baixo custo, sua utilidade é limitada por sensibilidade e seletividade relativamente baixas. Consequentemente, a quantificação precisa dos analitos-alvo, especialmente em baixas concentrações ou dentro de matrizes biológicas complexas, continua sendo um^{desafio 15}. O ELISA demonstra alta sensibilidade. No entanto, sua aplicação enfrenta várias limitações, incluindo um longo processo de desenvolvimento, dependência de anticorpos de alta qualidade e suscetibilidade à reatividade cruzada com compostos estruturalmente semelhantes na amostra. Esses fatores comprometem coletivamente a especificidade do^{ensaio 16}. Em contraste, o LC-MS/MS oferece seletividade excepcional, sensibilidade superior e rápido débito analítico. Essas vantagens a estabelecem como a metodologia padrão ouro para monitoramento terapêutico de medicamentos (TDM) e investigações^{farmacocinéticas 17}. O carfilzomib apresenta características de extensa ligação proteica plasmática, baixa estabilidade in vivo e índice terapêutico estreito. A tecnologia LC-MS/MS pode realizar análises quantitativas rápidas do composto-alvo, reduzir efetivamente o efeito matricial e fornecer uma base científica para a administração clínica precisa de medicamentos.

O nível de exposição ao carfilzomibe ao medicamento está intimamente relacionado ao seu efeito terapêutico e^{ADRs 18,19}. O Carfilzomib possui uma propriedade dependente da^{dose 20}, e seu nível de exposição aumenta positivamente com a dose no corpo, o que pode afetar diretamente seu efeito terapêutico. Um estudo mostrou que a taxa de resposta total (CR) de carfilzomibe no tratamento da MM foi de 28%, a taxa de resposta parcial muito boa (VGPR) foi de 73% e a taxa geral de resposta (ORR) foi de 93%²¹. Além disso, em comparação com o grupo controle, a incidência de cardiotoxicidade em pacientes tratados com carfilzomib aumentou significativamente, enquanto não houve mudança significativa na neuropatia periférica. Outro estudo também mencionou a eficácia e segurança do carfilzomibe no tratamento da MM e confirmou que o carfilzomib pode aumentar o risco de cardiotoxicidade enquanto melhora o efeito^{terapêutico 22}. Portanto, a eficácia e as ADRs do carfilzomibe estão relacionadas ao nível de exposição. Até o momento, poucos métodos validados de LC-MS/MS foram relatados para a quantificação do carfilzomibe em plasma humano, especialmente aqueles que atendem a rigorosos critérios de validação bioanalítica (por exemplo, diretrizes da FDA). Estudos existentes focam principalmente em modelos animais ou outras matrizes^{biológicas 23,24}, destacando uma lacuna nos ensaios clinicamente aplicáveis para TDM em pacientes com MM.

Portanto, há uma necessidade urgente de estabelecer um ensaio rápido, preciso e sensível para monitorar as concentrações de carfilzomib em pacientes com MM, a fim de otimizar sua utilidade terapêutica e perfil de segurança. Neste trabalho, desenvolvemos e validamos um método confiável de LC-MS/MS capaz de quantificar carfilzomib em plasma humano em até 3 minutos, demonstrando excelente sensibilidade e reprodutibilidade. Desenvolvido para TDM do carfilzomibe em MM, este método apoia otimização de dose e avaliação de exposição-resposta. Os usuários devem estar cientes da instabilidade do medicamento no plasma; A quantificação precisa exige processamento da amostra dentro de 4 horas após a coleta de sangue.

Protocol

Esse protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital da Universidade Médica Naval (Hospital Changzheng de Xangai). Todos os pacientes inscritos no estudo assinaram o consentimento informado.

1. Instrumentação LC-MS/MS

1. Use um sistema de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (UHPLC) acoplado a um espectrômetro de massa quadrupolo triplo equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) para realizar o desenvolvimento do método e análise de amostras.
2. Configure o sistema UHPLC para incluir um degasser online, uma bomba binária, um autosampler e um forno de coluna.
3. Realize aquisição e processamento de dados utilizando o software de aquisição de dados do fabricante do instrumento.

2. Condições cromatográficas líquidas

1. Obtenha a separação cromatográfica usando uma coluna ZORBAX-SB_{C 18} (2,1 mm × 100 mm, 3,5 μm).
2. Mantenha a temperatura da coluna em 40 °C.
3. Conduzir elução isocrática com uma fase móvel composta por 20% de acetato de amônio de 10 mmol/L em água e 80% de ACN.
4. Defina a vazão para 0,35 mL/min.
5. Garantir formas de pico simétricas e tempos de retenção adequados tanto para o analito quanto para o padrão interno (IS) nessas condições.
   NOTA: O Carfilzomib-d8 foi selecionado como IS devido à sua semelhança estrutural com o carfilzomib, que garante recuperação de extração, comportamento cromatográfico e eficiência de ionização comparáveis.
6. Defina o tempo total de execução para 3,0 min.

3. Condições de espectrometria de massa

1. Operar o espectrômetro de massa em modo ESI negativo.
2. Ajuste a tensão capilar para -6000 V.
3. Utilize nitrogênio tanto como gás nebulizador quanto como gás de secagem.
4. Use nitrogênio de alta pureza como gás de colisão a uma pressão de 0,2 MPa.
5. Mantenha a pressão do nebulizador em 20 psi.
6. Aqueça o gás de secagem a 400 °C e entregue a uma vazão de 10 L/min.
7. Ajuste a temperatura do gás da bainha para 350 °C, com uma vazão de 12 L/min.
8. Adquira dados no modo de monitoramento de reação múltipla (MRM).
9. Adquira espectros iônicos de produto do carfilzomib (Figura 1A) e do IS (Figura 1B) para ilustrar seus padrões de fragmentação.
10. Use o modo MS2 Scan para identificar o íon pai.
11. Use o modo SIM do MS2 para otimizar a tensão do Fragmentador.
12. Use o modo Íon Produto para determinar a Energia de Colisão (CE) ideal.
13. Detalhe os parâmetros otimizados de espectrometria de massa para carfilzomib e o IS (Tabela 1).

4. Amostras de calibração e controle de qualidade

1. Prepare uma solução estocada de carfilzomibe (1,0 mg/mL) pesando com precisão 2,0 mg de carfilzomib em um frasco volumétrico de 2 mL e dissolvendo-o em 2 mL de metanol (MeOH).
   ATENÇÃO: MeOH é inflamável e tóxico. Durante a operação, deve ser feito em uma exaustão exaustiva para evitar a inalação de vapores ou contato com a pele. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas e proteção para olhos/rosto.
2. Armazene a solução original a -80 °C.
3. Gerar soluções de trabalho por diluição serial da solução original com 10% de MeOH para alcançar concentrações de 100,0 μg/mL, 10,0 μg/mL e 1,0 μg/mL.
4. Estabeleça padrões de calibração aplicando plasma em branco com as soluções de trabalho.
5. Dilua o plasma com espigão com plasma em branco na proporção de 1:9 (v/v) para obter concentrações finais de 2,0, 5,0, 50,0, 200,0, 500,0, 750,0 e 1000,0 ng/mL.
6. Preparar independentemente amostras de controle de qualidade (QC) usando o mesmo método em concentrações de 5,0 ng/mL (baixa), 200,0 ng/mL (média) e 750,0 ng/mL (alta).

5. Preparação da amostra

1. Pré-trate as amostras de plasma (100 μL) adicionando 20 μL de uma solução de ácido fosfórico a 4%.
   ATENÇÃO: Ácido fosfórico é corrosivo. Use luvas, óculos de proteção e jaleco para evitar contato visual com pele. Em caso de contato, enxágue imediatamente com grandes quantidades de água.
2. Mistura de vórtice da amostra por 2 minutos na velocidade máxima usando um misturador de vórtice de laboratório padrão.
3. Adicione 200 μL de ACN, garantindo que contenha uma solução de IS a uma concentração de 200,0 ng/mL, à mistura^{de 25}.
   ATENÇÃO: O ACN é inflamável, volátil e tóxico. Todas as operações devem ser realizadas em uma exaustão e mantidas longe de fontes de calor e chamas. Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas e proteção para olhos/rosto.
4. Faça vórtice na mistura combinada novamente.
5. Centrifuge a mistura a 12.500 ×g por 10 minutos a 4 °^{C 25}.
6. Colete 100 μL do sobrenadante.
7. Combine o sobrenadante de 100 μL com 100 μL de água.
8. Transfira a solução resultante para um frasco de HPLC equipado com um inserto de vidro.
9. Injetar 10 μL da solução final no sistema LC-MS/MS para análise.

6. Avaliação de especificidade

1. Avalie a especificidade comparando as respostas do carfilzomibe e do IS em seis lotes diferentes de plasma em branco, plasma com IS-spiked, amostra do limite inferior de quantificação (LLOQ) e amostras de plasma autênticas.
2. Considere a interferência aceitável se a resposta for inferior a 15% do LLOQ para o analito e menor que 5% da resposta IS.

7. Avaliação de linearidade

1. Avalie a linearidade analisando três conjuntos de padrões de calibração em dias diferentes (pelo menos dois dias).
2. Use um modelo de regressão linear ponderada de mínimos quadrados para gerar curvas de calibração baseadas em pelo menos seis padrões de calibração.
3. Defina o padrão de menor concentração como o LLOQ.
4. Exigir concentrações retrocalculadas para cada padrão que estejam dentro de ± 15% de seus valores nominais, com tolerância de ± 20% para o LLOQ.

8. Precisão e determinação de exatidão

1. Determine a precisão e exatidão intradiárias e interdias analisando cinco réplicas de amostras de QC em três níveis de concentração e a amostra LLOQ em pelo menos dois dias diferentes.
2. Expresse a precisão como o desvio padrão relativo (RSD%), exigindo que seja ≤ 15% para amostras de QC e ≤ 20% para o LLOQ.
3. Expresse a precisão como erro relativo (RE%), exigindo que ela esteja dentro de ± 15% para amostras de QC e ± 20% para o LLOQ.

9. Recuperação e determinação do efeito matricial

1. Determine a recuperação comparando a área de pico de carfilzomib disparada no plasma antes da extração com a área de pico de carfilzomib atingida na matriz extraída na mesma concentração.
2. Avalie o efeito matricial comparando a área de pico do carfilzomib com pico na matriz extraída com a área de pico do carfilzomib em uma solução pura na mesma concentração.
3. Indique um impacto consistente da matriz de plasma em branco no sinal do analito se o RSD% para o fator de efeito da matriz for menor que 15%.

10. Avaliação de transferência

1. Avalie a transferência injetando uma amostra em branco imediatamente após o padrão de calibração mais alto para detectar qualquer sinal residual do analito da injeção anterior.
2. Considere o carryover aceitável se a resposta do carfilzomib na amostra em branco for inferior a 20% do LLOQ e menos de 5% da resposta IS.

11. Avaliação do efeito diluição

1. Avalie o efeito de diluição diluindo amostras de plasma com picos com concentrações que excedam o limite superior de quantificação (ULOQ) com plasma em branco para trazer a concentração dentro da faixa de calibração.
2. Compare a concentração medida com a concentração nominal.

12. Avaliação de estabilidade

1. Avalie a estabilidade analisando amostras de QC em três níveis de concentração sob diferentes condições de armazenamento.
2. Armazene amostras de controle de qualidade em temperatura ambiente e analise após 6 horas.
3. Armazene amostras processadas no autosampler e analise em 0, 2, 4 e 6 horas.
4. Submeta as amostras de QC a três ciclos de congelamento-descongelamento alternando o armazenamento a −20 °C e temperatura ambiente, e então analise.
5. Armazene amostras de QC a −80 °C por dois meses e depois analise.
6. Compare concentrações medidas com valores nominais e confirme que os desvios estão dentro de ±15% (RE%).

13. Registro de pacientes e coleta de amostras

1. Obtenha consentimento informado por escrito de todos os pacientes.
2. Inscriva pacientes com MM e trate-os com carfilzomib.
3. Colete amostras de sangue imediatamente após a administração do medicamento (infusão intravenosa com duração de 30 minutos).
4. Obtenha amostras de plasma centrifugando amostras de sangue coletadas em tubos EDTA-3K a 4500 ×g por 10 minutos a 4 °C.

Results

Otimização LC-MS/MS

Para otimizar a detecção do carfilzomib, os valores de resposta do analito foram comparados sob modos de ionização positivo e negativo. O modo de ionização negativa gerou uma resposta maior para carfilzomib do que o modo de ionização positiva e, portanto, foi selecionado para análise subsequente. Comparamos o desempenho das colunas C₈,_{C 18} e T3-C₁₈ para selecionar a mais ótima. A coluna C

Discussion

Em contraste com os métodos tradicionais HPLC-UV e ELISA, o LC-MS/MS oferece seletividade, sensibilidade e velocidade excepcionais, abordando efetivamente as limitações de seus predecessores. Essas vantagens consolidam seu papel como a técnica padrão ouro para análise de fármacos em biomatrices complexas, especialmente para TDM e investigações^{farmacocinéticas 17}. Desenvolvemos e validamos um método LC-MS/MS para quantificar carfilzomibe em plasma humano. Uma vanta...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrila (ACN)	Empresa Merck (Darmstadt, Alemanha)	34888	Grau LC-MS
Acetato de amônio	Empresa Merck (Darmstadt, Alemanha)	9689	Pureza da análise: ≥ 99.0%
Balanço de análise	Sartorius (Alemanha))		Precisão: 0,01 mg
Coluna analítica	Agilent Technologies (EUA)		Agilent ZORBAX SB-C18, 2.1 e vezes; 100 mm, 3,5 e micro; m
Carfilzomib	Biotecnologia yuanye de Xangai (Xangai, China)	868540-17-4	Analisar a amostra padrão, pureza > 99%
Carfilzomib-d8	Biotecnologia yuanye de Xangai (Xangai, China)		Analise a amostra padrão, pureza > 98%
Software de aquisição de dados	Agilent Technologies (EUA)		Software de processamento de dados Agilent Masshunter (versão 6.0)
Software de análise de dados	Agilent Technologies (EUA)		Software de análise quantitativa Agilent MassHunter (versão 10.1)
Água destilada	Shenzhen Watsons Distilled Water Co., Ltd (Shenzhen, China)	Grau LC-MS
Frascos e frascos de HPLC; Inserts	Shanghai Titan Technology Co., Ltd. ((Xangai, China))		-
Sistema de cromatografia líquida	Agilent Technologies (EUA)		A série Agilent 1200 inclui bombas binárias, degasser online, amostrador automático e caixa de temperatura na coluna.
Metanol (MeOH)	Empresa Merck (Darmstadt, Alemanha)	1.06035	Grau LC-MS
Micropipetas	Eppendorf (Alemanha)		Múltiplas faixas de medição (por exemplo, 10 e micro; L, 100 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L)
Escritório & Software estatístico	-		Microsoft Office 365; GraphPad Prism 9.5
Ácido fosfórico	Empresa Merck (Darmstadt, Alemanha)	49685	Pureza da análise, 85% em peso
Centrífuga refrigerada	Eppendorf (Alemanha)		Para amostras centrifugadas a 4° C
Espectrômetro de massa quadrupolar triplo	Agilent Technologies (EUA)	G6475AA	Série Agilent 1200, equipada com fonte de ionização por eletrospray (ESI)
Misturador de vórtice	Labnet  (EUA)	S0200	Velocidade ajustável