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Artigo de método

Metagenômica da fração do tamanho viral do DNA para amostras de fezes humanas

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DOI:

10.3791/70187

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24 de março de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo flexível para gerar metagenomas de fração de tamanho viral (viromes) de alta qualidade a partir de amostras de fezes humanas. Originalmente desenvolvido para virômica do solo, aqui esse protocolo foi aplicado com sucesso a amostras de fezes, permitindo uma caracterização robusta da virosfera intestinal humana.

Resumo

Compreender a virosfera humana saudável (o componente viral do microbioma) requer medições precisas da composição da comunidade viral em uma ampla variedade de tipos virais. Com base em experiências anteriores com métodos de ecologia de comunidades virais do solo, aqui demonstramos uma série de abordagens laboratoriais para enriquecer e extrair DNA de vírus extracelulares em amostras de fezes humanas. Um protocolo primário funcional é apresentado, juntamente com opções para desvios em diferentes etapas. A abordagem geral envolve adicionar um tampão líquido (padrão: soro salino fosfatado tamponado com proteína, PPBS) para facilitar a remoção de partículas virais livres da matriz de fezes, centrifugação para separar a fração líquida contendo partículas virais, filtração (padrão: 0,2 μm tamanho de poro) para remover a maioria das células, concentração de partículas virais (padrão: ultracentrifugação), remoção de ácidos nucleicos livres com nucleases antes da lise viral, e depois extração de DNA para sequenciamento. Técnicas alternativas, incluindo diferentes buffers, tamanhos de filtro e métodos de concentração, também são observadas. No geral, múltiplas opções para gerar DNA virômico de alta qualidade para sequenciamento são oferecidas. Em vez de adaptar a abordagem a equipamentos e recursos específicos, a flexibilidade do protocolo deve torná-lo amplamente aplicável em laboratórios com equipamentos de biologia molecular padrão variados.

Introdução

A virômica, ou sequenciamento metagenômico não direcionado da fração do tamanho viral das comunidades mistas, pode fornecer insights sobre a diversidade, evolução e ecologia de vírus não cultivados. Desde os primeiros esforços para catalogar comunidades virais intestinais há mais de 20 anos, que utilizaram notavelmente métodos desenvolvidos para amostras ambientais como a águado mar 1, as abordagens virômicas continuaram a permitir descobertas em ecologia viral dentro do microbiomahumano 2. No entanto, não existe um protocolo universal único de virômica, e variações nas técnicas podem impactar os resultados dosequenciamento 3,4, influenciando, em última análise, a interpretação da dinâmica da comunidade viral e dificultando comparações entre estudos. Protocolos otimizados, combinados com uma compreensão profunda de como escolhas metodológicas moldam perfis de virome, são necessários para caracterizar robustamente a virosfera humana.

Embora não exista um protocolo universal de virómicos, a base geral dos métodos de virómica envolve separar e concentrar fisicamente partículas extracelulares semelhantes a vírus (vírions) com base em seu tamanho e/ou densidade, remover ácidos nucleicos livres (derivados em parte de detritos celulares ou capsídeas virais comprometidas) antes da lise viríon, e extrair DNA e/ou RNA para sequenciamento. Algumas técnicas virômicas selecionam a favor ou contra tipos virais específicos, seja por escolha intencional dos pesquisadores ou por uma limitação metodológica não intencional. Seringa ou filtração a vácuo é frequentemente usada para remover células microbianas e outros detritos, e o tamanho do filtro afeta inerentemente a qualidade e a composição do viroma recuperável. Por exemplo, a filtração pode aumentar a pureza dovirome 5, mas pode excluir partículas viraismaiores 6,7. Métodos de concentração de virion, como ultracentrifugação, precipitação de polietilenoglicol (PEG), ultracentrifugação por gradiente de densidade e ultrafiltração, também apresentam compensações entre pureza, vazão e custosde equipamentos 3,8. Múltiplas químicas de tampão são conhecidas por serem eficazes para virômicas. Eles podem não ter impactos desproporcionais na caracterização dovirome 9, mas buffers de armazenamento e ressuspensão ainda podem afetar a recuperação do vírus e os perfis do virome gerados pela análise bioinformática10,11. Por fim, como as concentrações de ácidos nucleicos virais podem ser baixas em amostras naturais, muitos estudos optam por amplificar o DNA viral antes da construção da biblioteca (por exemplo, por amplificação por múltiplos deslocamentos (MDA) ou amplificação de primeiro único independente de sequência (SISPA)). No entanto, algumas dessas técnicas introduzem viés significativo12,13. No geral, embora muitos métodos virómicos possam gerar viromes com sucesso, protocolos otimizados que reconhecem vieses e são um pouco padronizados permitirão pesquisas precisas e reprodutíveis sobre viromes.

Este artigo apresenta um fluxo de trabalho flexível para gerar viromas a partir de amostras de fezes humanas. Adaptado das técnicas comprovadas de virómicosdo solo 14,15,16, esse protocolo inclui várias etapas que facilitam a modificação, permitindo que pesquisadores o adaptem aos seus próprios equipamentos e necessidades de pesquisa. O método padrão de viromicos, descrito abaixo, aplicado com sucesso tanto em amostras de solo quanto de fezes congeladas, produz viromas de alta qualidade sem uma etapa de amplificação do DNA viral antes da construção da biblioteca. As sugestões para modificações de protocolo foram testadas em graus variados em outros estudos, mas seus efeitos específicos e posteriores nas sequências de viroma das fezes humanas não foram analisados aqui.

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Protocolo

Todos os participantes recrutados para a coleta de amostras de fezes deram consentimento informado. Os protocolos de coleta de amostras foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Califórnia, Davis, e os estudos estão em conformidade com a Declaração de Helsinque. Este protocolo é adaptado de Emerson et al. (2022)17.

1. Preparação de materiais

  1. Prepare soro tampão fosfatado com proteína (PPBS, 10x PBS, 1% K-citrato, 150 mMMgSO 4, 2% de albumina sérica bovina (BSA)18.
    NOTA: Outros tampões comumente usados em protocolos virômicos são magnésio fisiológico (SM)19 ebuffer 11 de citrato de potássio modificado (AKC').
    1. Adicione 10 mL 10x PBS, 10 g de K-citrate, 18,05 g deMgSO anidro 4 em uma garrafa de vidro autoclavável de 1 L e encha até 1 L com água de laboratório ultrapura. Ajuste o pH para 6,5 (normalmente requer cerca de 50 μL de 6 M HCl ou cerca de 100 μL de 2 M HCl). Deixe uma barra de mexer dentro da garrafa para uso na Etapa 1.1.2.
    2. Autoclave a garrafa com buffer e uma garrafa vazia de vidro autoclavável de 1 L. Após o autoclav, quando o tampão esfriar até a temperatura ambiente, coloque-o em uma placa magnética de mexer e adicione lentamente 20 g de BSA diretamente no frasco, adicionando cerca de 5 g de BSA de cada vez (para evitar espuma, minimize a agitação excessiva da solução, por exemplo, comece com uma taxa de mexer lentamente e aumente gradualmente).
    3. Filtre todo o volume do buffer através de um filtro a vácuo estéril de 0,22 μm para a garrafa vazia autoclavada de 1 L do Passo 1.1.2. Armazene o buffer a 4 °C até o uso.
      NOTA: O buffer PPBS pode ser armazenado a 4 °C por cerca de 3 meses, mas não é estável a longo prazo quando armazenado acima de zero.
  2. Prepare os tubos da ultracentrífuga.
    NOTA: Este protocolo utiliza ultracentrifugação para concentrar vírions. Outras abordagens comuns incluem precipitação de polietilenoglicol (PEG), ultracentrifugação por gradiente de densidade (por exemplo, gradientes de cloreto de césio) e ultrafiltração.
    1. Para limpar os tubos das ultracentrífugas, primeiro, esfregue os tubos usando água de laboratório ultrapura. Depois, enxágue os tubos com água de laboratório ultrapura.
    2. Encha os tubos com 1 M de NaOH e deixe de molho por pelo menos 1 hora (pode deixar de molho durante a noite). Limpe as tampas plásticas/borracha das ultracentrífugas e seus anéis de emergência mergulhando-os em 1 M de NaOH.
      NOTA: Não imerga as tampas metálicas com parafuso em NaOH.
    3. Após o mergulho, enxágue três vezes com água de laboratório ultrapura, seguida de uma lavagem usando água sem nuclease, grau biologia molecular. Seque os tubos invertendo e batendo suavemente, ou deixando secar completamente durante a noite. Rotule cada tubo de ultracentrífuga com um identificador de amostra.
  3. Pré-resfrie o rotor da ultracentrífuga a 4 °C deixando o rotor na geladeira ou na sala fria durante a noite.

2. Purificação e concentração de vírion

  1. Pese as fezes em um tubo cônico estéril, livre de DNase, RNase e DNA, de 50 mL.
    NOTA: A quantidade de fezes utilizada pode depender da quantidade de material amostral disponível. Aqui, foram usados 2 g de fezes. Se o material da amostra não utilizado precisar ser armazenado congelado, considere aliquotar toda a amostra antes do congelamento para minimizar futuros ciclos de congelamento e descongelamento.
  2. Adicione 8 mL de buffer PPBS diretamente nos tubos cônicos que contêm as fezes (cônica #1). Resuspenda completamente por vórtice.
  3. Agite os tubos a 300 RPM a 4 °C por 10 minutos.
    NOTA: Se necessário, a agitação pode ser feita em temperatura ambiente, mas recomenda-se 4 °C.
  4. Centrifuge amostra no cônico #1 a 4.000 x g a 4 °C por 10 minutos.
    NOTA: Use um rotor de balde oscilante, se possível, para facilitar a separação vertical da densidade e facilitar os próximos passos.
  5. Decante cuidadosamente o sobrenadante em um novo cônico estéril de 50 mL (cônico #2) e armazene a 4 °C (o sobrenadante aqui contém os vírions). Não descarte o tubo cônico que contém o pellet (cônico #1), pois ele é usado novamente no Passo 2.6.
  6. Repita os passos 2.2-2.5 mais duas vezes (de modo que a amostra no cônico #1 tenha passado por um total de 3x resuspensão com buffer, 3x shaking e 3x centrifugação) e continue acumulando o sobrenadante no cônico #2.
    NOTA: Três disparos devem acumular ~24 mL de sobrenadante total.
  7. Centrifuge o tubo cônico de 50 mL contendo sobrenadante acumulado (cônico #2) por 8 minutos a 10.000 x g a 4 °C.
  8. Faça uma segunda rodada de centrifugação. Primeiro, decante o sobrenadante do cônico #2 para um novo tubo cônico de 50 mL (cônico #3). Centrífuga cônica #3 por 8 minutos a 10.000 x g a 4 °C.
  9. Usando filtração por seringa, filtre sequencialmente o sobrenadante do cônico #3, evitando o pellet no fundo ou próximo ao fundo do tubo. Pré-filtro usando um filtro de seringa de polietersulfona (PES) estéril de 5,0 μm, seguido de um filtro de seringa PES estéril de 0,20 μm, diretamente em um tubo ultracentrífuga.
    NOTA: O objetivo da pré-filtragem com filtros de 5,0 μm é reduzir o entupimento dos filtros de 0,20 μm. Ainda pode ser necessário descartar e substituir os filtros da seringa caso fiquem entupidos. A filtração pode ser realizada em uma única etapa, empilhando o filtro de 5 μm sobre o filtro de 0,20 μm, conectado a uma única seringa, diretamente em um tubo de ultracentrífuga. As membranas PES são preferidas, pois outros materiais de membrana podem reter vírions (por exemplo, fibra de vidro) ou entupi-se mais rápido (por exemplo, fluoreto de polivinilideno, PVDF). 0,45 μm é outro tamanho comum de filtro.
  10. Verifique a massa de todos os tubos da ultracentrífuga com o conteúdo da amostra, e pareie os tubos na ultracentrífuga com base na massa. Se necessário, adicione PPBS ao tubo mais leve de cada par para equalizar o peso (dentro de uma margem de erro de 0,05 g para tubos pareados).
  11. Ultracentrífuga a 112.000 x g a 4 °C sob vácuo por 2 h 25 min.
    NOTA: Dependendo do rotor utilizado, a duração do spin variará (de acordo com o coeficiente de sedimento (s) = 58). Consulte a Tabela de Materiais para o rotor utilizado aqui. Antes de remover os tubos da ultracentrífuga, observe a orientação de cada tubo no rotor para ajudar a localizar o pellet viral. Às vezes, após a ultracentrifugação, o pellet viral não é visível, e deve-se ter cuidado extra ao remover o sobrenadante na etapa seguinte.

3. Resuspensão viral de pellets e tratamento com DNase

  1. Remova o sobrenadante por decantação ou com uma pipeta, tomando cuidado para não perturbar o pellet, que pode ser frágil (o pellet contém os virions concentrados).
    NOTA: Como mencionado no Passo 2.11, a bolinha pode ou não ser visível, mas uma bolinha marrom ou amarela do tamanho de um furo pode ser frequentemente vista.
  2. Trate as amostras com DNase.
    NOTA: Se optar por não tratar amostras com DNase, prossiga para o Passo 4 e siga "Se o tratamento com DNase não foi realizado". Consulte a Discussão para considerações sobre a realização do tratamento com DNase.
    1. Resuspenda o pellet em 100 μL de água de grau biologico molecular livre de nucleases, em um tubo de microcentrífuga marcado de 1,5 mL.
    2. Faça a mistura master do tratamento com DNase adicionando 10 μL de tampão de reação de DNase e 10 μL de DNase para cada amostra a ser tratada. Pipete para misturar bem.
      NOTA: Prepare mistura master de tratamento com DNase suficiente para reações extras que considerem a possível perda de volume durante a pipeteação no Passo 3.2.3.
    3. Adicione 20 μL da mistura master de tratamento com DNase aos vírions ressuspensos. Misture bem pipetando suavemente. Incube a 37 °C por 30 minutos.
    4. Adicione 10 μL de solução de parada de DNase para inativar as nucleases. Breve e breve.

4. Extração de ácidos nucleicos virais

  1. Realize a extração de DNA usando o kit de extração de DNA listado na Tabela de Materiais.
    NOTA: Faça duas modificações nas instruções do fabricante. 1) Após a Etapa 1 do procedimento do kit, aqueça o tubo de esferas contendo os vírions no buffer CD1 a 65 °C por 10 minutos, depois prossiga com a extração conforme as instruções do fabricante. 2) Durante a etapa de elução do DNA (etapa 16 do procedimento do kit), incubar as colunas em temperatura ambiente por 5 minutos após adicionar C6.
    1. Se o tratamento com DNase foi realizado: Após a inativação das nucleases (no Passo 3.2.4), use todo o volume como entrada para a extração do DNA (ou seja, na etapa 1 do procedimento do kit de extração de DNA, adicione esse volume ao tubo de esferas contendo 800 μL de CD1). Certifique-se de não deixar nenhuma solução para trás (essa solução contém os vírions).
    2. Se o tratamento com DNase não foi realizado: Adicione 100 μL de água de grau molecular livre de nuclease ao tubo ultracentrífuga contendo o pellet do Passo 3.1. Raspe suavemente o pellet e volte a suspender. Use o pellet ressuspenso como entrada para extração de DNA.

5. Quantificação do DNA

  1. Quantifique o DNA extraído com o método preferido baseado em fluorescência.
    NOTA: Os rendimentos de DNA do Virome raramente são altos o suficiente para quantificação baseada em absorção; No entanto, isso ainda pode ser útil para identificar contaminantes químicos.
  2. Para armazenamento de curto prazo, armazene o DNA a -20 °C após a quantificação. Para armazenamento a longo prazo, armazene a -80 °C. O DNA agora está pronto para preparação e sequenciamento da biblioteca. Consulte a Tabela de Materiais para o kit de preparação da biblioteca e a plataforma de sequenciamento usada aqui.

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Resultados

Um esforço exploratório aplicando esse protocolo a uma única amostra de fezes congeladas (processada em triplicado técnico para viromas) junto com duas amostras de solo demonstrou sua eficácia na produção de viromas de alta qualidade a partir de diferentes tipos de amostras. Usando dados de sequenciamento filtrados por qualidade e contigs montados de novo gerados por esse protocolo, sequências virais supostas foram identificadas usando uma ferramenta de identificação de...

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Discussão

Esse protocolo apresenta um método relativamente simples e adaptável para gerar viromes. Comprovado nos solos14, 15, 16 e 21, é aplicado com sucesso aqui em amostras de fezes humanas. Este protocolo é a melhor opção para recuperar vírus extracelulares e intactos de DNA e não foi projetado para recuperar intencionalmente vírus intracelulares ou profagos (embora ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos aos Drs. Sean Adams, Trina Knotts e Mohamed R. Ali (Faculdade de Medicina da Universidade da Califórnia, Davis) por coletar e fornecer a amostra de fezes em conformidade com os protocolos e padrões éticos do IRB. Agradecemos ao Dr. Matthew R. Olm (Universidade do Colorado, Boulder) pela colaboração na análise da amostra de fezes. Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH Common Fund (Programa de Viroma Humana), Prêmio # U01DE034198. O LSH também foi parcialmente apoiado pelo Departamento de Energia dos EUA (DOE), Escritório de Ciência, Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental (BER), Programa de Ciências Genômicas, número de concessão DE-SC0023127 (bolsa para JBE, subsídio do PI Sydney Glassman).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pó Sérico de Albumina Bovina (BSA) Livre de DNase e ProteaseBiorreagentes FisherBP9706100Para receita PPBS (Passo 1.1)
DNeasy PowerSoil Pro KitQIAGEN47016Kit de extração de DNA (Passo 4.1)
Kit de biblioteca KAPA DNA HyperPrepRocheN/AAs bibliotecas geradas por esse kit foram sequenciadas usando a plataforma Illumina NovaSeq 6000 (2 x 150 bp).
Sulfato de magnésio (MgSO4), anidro, ≥ 99.5%Sigma-AldrichM7506Para receita PPBS (Passo 1.1)
Soro Tamponado com Fosfato (PBS), 10x, pH 7,4, Livre de RNaseInvitrogenAM9624Para receita PPBS (Passo 1.1)
Filtros de seringa de membrana de polietersulfona (PES), estéreis, 28 mm, 0,2 e mu; mCorning431229Para filtração por seringa (Passo 2.9)
Tubos centrífugos cônicos de polipropileno, estéreis, 50 mLOlympus Plastics28-108
Citrato de potássio monohidratado (Cristalino/Certificado)Fisher ChemicalP222Para receita PPBS (Passo 1.1)
Qubit  Tubos de ensaioInvitrogenQ32856Para quantificação do DNA (Passo 5.1)
Fluorômetro Qubit 4InvitrogenP33238Para quantificação do DNA (Passo 5.1)
Kits de Quantificação de Quantificação de DNA dsDNA de QubitInvitrogenQ32850Para quantificação do DNA (Passo 5.1)
RNase RNase RQ1 DNase LivrePromegaPR-M6101Inclui o buffer de reação, DNase e solução de parada
Filtros de seringa de membrana de polietersulfona hidrofílica (PES), estéreis, 32 mm, 5,00 & micro; m Cytiva (anteriormente Pall Lab)28150-956Para filtração por seringa (Passo 2.9)
Rotor de ultracentrífuga: Rotor de ângulo fixo Tipo 50.2 Ti, 50.000 rpm, 302.000 x g, 12 x 39 mBeckman Coulter337901Também usamos o Beckman Coulter Type 70 Ti Fixed Angle Titanium Rotor (Cat. 337922). Centrifuge por 3 horas se estiver usando a 70 Ti.
Tubos de ultracentrífuga: Garrafa de policarbonato de 26,3 mL com conjunto de tampon, 25 x 89mmBeckman Coulter355618Compatível com os rotores Beckman Coulter Tipo 50.2 Ti (Cat. 337901) e Tipo 70 Ti (Cat. 337922)
Ultracentrífuga: Beckman Instruments Optima LE-80K Ultracentrífuga de pisoBeckman Coulter365668Também usamos a Ultracentrífuga Refrigerada Beckman Coulter L8-70M (Cat. 344196)

Referências

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