Artigo de método

Estabelecimento e Análise da Rejeição Aguda Mediada por Anticorpos em Transplante Cardíaco Murino

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DOI:

10.3791/70191

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13 de fevereiro de 2026

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1Organ Transplantation Research Institution, Division of Kidney Transplantation, Department of Surgery, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo estabeleceu um modelo prático de camundongos de rejeição aguda mediada por anticorpos após transplante cardíaco, caracterizado por produção robusta de DSA, alterações patológicas típicas e sobrevivência moderada de aloenxertos.

Resumo

Um dos principais fatores que contribuem para a falência de aloenxertos em receptores de transplante cardíaco é a rejeição mediada por anticorpos (RAM). Portanto, o modelo de RAM em camundongos serve como uma ferramenta vital para decifrar seus mecanismos subjacentes e fomentar o desenvolvimento de tratamentos inovadores. Neste estudo, os camundongos receptores foram divididos em três grupos: não sensibilizados (NS), pré-sensibilizados (PS) e pré-sensibilizados com tratamento com ciclosporina A (PS + CsA). O grupo NS, que apresentou sobrevivência média de aloenxerto de 6,8 ± 0,7 dias, não apresentou aumento nos níveis séricos de DSA e coloração negativa por aloenxerto C4d dentro de quatro dias após o transplante cardíaco (TC), sugerindo uma patologia dominada por rejeição celular aguda. Este estudo estabeleceu um modelo agudo de RAM ao pré-sensibilizar receptores com transplante de pele (ST) uma semana antes da tomografia computadorizada, pré-ativando assim o sistema imunológico. Essa abordagem induziu com sucesso um fenótipo severo de RAM (AMR), evidenciado por uma sobrevivência curta de aloenxerto de 2,8 ± 0,4 dias, um aumento significativo dos níveis de DSA-IgG após ST e pós-tomografia, e sinais patológicos iniciais de vasculite e extensa deposição de C4d dentro de 12 horas após a tomografia. No entanto, a extrema severidade desse modelo limita sua aplicação mais ampla. Para minimizar a ativação concomitante das células T induzida pela ST e estabelecer um modelo agudo mais específico de RAM aguda, este estudo administrou ciclosporina A. Consequentemente, o grupo PS + CsA apresentou tempo de sobrevivência ao aloenxerto de 5,2 ± 0,4 dias. Os níveis séricos de DSA-IgG estavam significativamente elevados no sétimo dia pós-ST e permaneceram altos dentro de cinco dias após a tomografia. A avaliação patológica no segundo dia pós-tomografia confirmou vasculite significativa e deposição de C4d, achados que coletivamente atendem aos critérios diagnósticos para RAM aguda moderadamente grave. Em conclusão, este estudo estabeleceu um modelo camundongo altamente prático e transferível de RAM aguda após a tomografia computadorizada, definido por produção robusta de DSA, alterações patológicas características e sobrevivência moderada ao aloenxerto.

Introdução

O transplante cardíaco (TC) continua sendo a terapia padrão ouro para doenças cardíacas em estágioterminal 1. Embora a sobrevivência mediana pós-transplante agora ultrapasse 13 anos, a falha do enxerto a longo prazo continua sendoinevitável 2. A rejeição mediada por anticorpos (RAM) é um dos principais fatores que contribuem para a perda tardia do enxerto após aTC 3. Estudos mostraram que a incidência de perda de enxerto devido à RAM supera a causada pela rejeição mediada por células T, e o risco de falha do enxerto na RAM de início tardio é aproximadamente o dobro da RAM inicial 4,5. Portanto, a identificação precoce e a intervenção oportuna para a RAM são fundamentais para melhorar a sobrevivência do enxerto.

A RAM é impulsionada por anticorpos específicos do doador (DSA), que causam falha do enxerto por ativação do complemento, inflamação vascular e lesãoisquêmica 6. A ligação da DSA ao endotélio vascular inicia danos endoteliais, promove trombose e induz respostas inflamatórias agudas e crônicas. Os principais mecanismos de lesão mediada por DSA envolvem citotoxicidade dependente de complemento e vias de citotoxicidade celular dependentes deanticorpos 7. Embora terapias direcionadas, como o anticorpo anti-C5 eculizumabe e o agente depletor de células B rituximabe, tenham sido desenvolvidas, os desfechos clínicos na RAM em estágio avançado permaneceminsatisfatórios 7,8,9. Portanto, investigações mecanicistas adicionais usando modelos animais agudos são essenciais para compreender melhor a progressão da doença e identificar novos alvos terapêuticos.

O modelo de tomografia computorizada vascularizada heterotópica em camundongos é uma plataforma bem estabelecida para o estudo da tomografia computarizada, especialmente em lesão e rejeição deisquemia-reperfusão 10,11,12. A função do enxerto é tipicamente monitorada pela palpação abdominal diária da intensidade do batimento cardíaco, que reflete o status funcional e define a falênciado enxerto 13. No entanto, modelos convencionais frequentemente falham em detectar o início da RAM logo após o transplante e, portanto, requerem pré-sensibilização para induzir a formação de DSA e desencadear a RAM aguda. Além disso, cepas de camundongos diferem em reatividade imunológica; por exemplo, camundongos C57BL/6 apresentam ativação de complemento mais forte, enquanto camundongos BALB/c favorecem respostas enviesadas para Th214,15. Consequentemente, tanto a estratégia de pré-sensibilização quanto a seleção da cepa do destinatário são determinantes críticos do desempenho do modelo.

Em estudos anteriores, essa equipe utilizou diferentes cepas de ratos para transplante renal após transplante de pele (ST), estabeleceu um modelo de RAM e analisou suas características, acumulando considerável experiência 16,17,18. Em 2021, essa equipe estabeleceu ainda mais um modelo de camundongo AMR agudo induzido por ST em TC para pesquisa fundamental, que demonstrou grandeestabilidade 19. Diferente da pré-sensibilização relativamente ineficiente por transfusão alogênicade sangue 20 ou da infusão de linfócitos do baço mais complexa edemorada 21, a ST oferece um protocolo de sensibilização robusto, estável e mais simples. Esse modelo facilita a detecção precoce pós-transplante de níveis elevados de DSA sérico e lesão observável de aloenxerto causada pela RAM aguda, tornando-o particularmente adequado para estudos intervencionistas em RAM aguda. No entanto, a RAM aguda induzida pela ST é tipicamente grave, causando danos substanciais aos tecidos que frequentemente mascaram a progressão da lesão crônica. Este estudo tem como objetivo fornecer uma descrição detalhada da metodologia e dos procedimentos usados para estabelecer esse modo, analisar as características imunológicas e patológicas do modelo e resumir a experiência prática.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as regulamentações de manejo experimental de animais de Guangdong, a Declaração de Helsinque e os princípios das 3R. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê da Guangzhou Jennio Biotech Co., Ltd. (número de aprovação JENNIO-IACUC-2024-A027). Machos Balb/c e C57BL/6 (6-8 semanas de idade, pesando 20-25 g), todos graus específicos livres de patógenos (SPF), foram obtidos de uma fonte comercial. Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo são detalhados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

  1. Alojar o camundongo de grau SPF no sistema apropriado da instalação animal.
  2. Divida os camundongos em três grupos experimentais, conforme descrito na Figura 1
    1. Grupo não sensibilizado (NS): Use camundongos Balb/c como doadores e camundongos C57BL/6 como receptores da tomografia computarizada.
    2. Grupo pré-sensibilizado (PS): Use camundongos Balb/c como doadores e camundongos C57BL/6 como receptores para ST, seguido pela tomografia uma semana depois.
    3. Pré-sensibilizado + grupo ciclosporina A (PS + CsA): Use camundongos Balb/c como doadores e camundongos C57BL/6 como receptores para ST, seguido pela tomografia uma semana depois. Desde o dia da ST, injetar CsA subcutânea nos camundongos receptores a 2 mg/(kg·d) até a falha do enxerto ou coleta da amostra do enxerto.

2. Preparação pré-operatória

  1. Certifique-se de que os camundongos doadores não fiquem privados de comida ou água antes da cirurgia, enquanto os camundongos receptores fiquem em jejum por 8 horas, mas não fiquem privados de água.
  2. Anestesia
    1. Coloque o camundongo em uma câmara de indução anestésica para indução (concentração de isoflurano: 3%-4%; Vazão: 300-500 mL/min) (seguindo protocolos institucionalmente aprovados). Sacode a câmara de indução para verificar se o animal está totalmente anestesiado.
      NOTA: Se o animal for virado de lado e não tentar voltar para a posição deitado, indica anestesia completa.
    2. Após ajustar a concentração de manutenção na plataforma cirúrgica, retirar o camundongo da câmara de indução, fixar seu nariz na máscara anestésica (Concentração de isoflurano: 1,0%-2,5%; Vazão: 100-200 mL/min), e verifique se o rato está totalmente anestesiado (pressione a pata ou a cauda com o dedo; se não houver resposta, indica anestesia total).

3. Pré-sensibilização via ST (para os Grupos 2 e 3)

  1. Colheita de pele da cauda doadora
    1. Desinfete a pele da cauda dos camundongos doadores anestesiados com álcool 75%.
    2. Use um bisturi para amputar a cauda (no terço distal), fixe o toco com pinças na mão esquerda e use o bisturi na mão direita para cortar a pele entre as veias da cauda, expondo o tendão branco subjacente. Depois, fixe o cóccix com pinças, use pinças curvas para prender a pele na incisão e retire cuidadosamente.
    3. Coloque a pele descascada em um béquer contendo soro fisiológico gelado e estéril, com o tecido voltado para baixo. Corte um pedaço de pele de 1,0 cm × 1,0 cm para uso posterior.
  2. ST dorsal receptor
    1. Raspe o pelo da área dorsal dos camundongos receptores anestesiados usando um cortador de cabelo, desinfete com álcool 75% e coloque uma cortina estéril.
    2. Use um bisturi para incisar a pele, segure as bordas da pele com pinças dentadas e corte um pedaço de pele um pouco maior que 1,0 cm × 1,0 cm com tesoura de tecido para criar a cama do enxerto.
    3. Coloque o enxerto de pele do doador no leito do enxerto com o lado do tecido para baixo. Após aparar o enxerto, suture a pele doadora à pele receptora sob um microscópio usando 8-0 Fio de náilon, garantindo que a pele doadora seja colocada uniformemente sobre a cama de enxerto.
    4. Cubra a ferida com uma bandagem adesiva estéril e coloque o rato em uma gaiola de alojamento depois que ele recuperar a consciência.

4. TAC

  1. Colheita de coração por doador
    1. Raspe o pelo do peito e abdômen dos camundongos doadores anestesiados usando um aparador de cabelo, desinfete com álcool 75% e coloque um tecido estéril.
    2. Faça uma incisão abdominal na linha média com um bisturi, expondo o segmento superior da veia cava inferior, e injete 1 mL de soro fisiológico heparinizado de 50 U/mL (4 °C) na veia cava inferior usando uma seringa.
    3. Use tesouras de tecido para abrir a cavidade torácica e expor o coração. Isolar a aorta ascendente e cortá-la antes do primeiro ramo; isolar a artéria pulmonar e transectá-la em sua bifurcação; ligar a veia cava inferior e o tecido conjuntivo no hilo pulmonar usando suturas 6-0 não traumáticas; Corte o tecido distal no local da ligadura com tesoura e remova o coração.
    4. Coloque rapidamente o coração colhido em 2 mL de solução de adenina hipertônica citrato (HCA) e armazene-o em uma mistura de água gelada para uso posterior. Eutanasie o camundongo doador usando o método da luxação cervical.
  2. Receptor CT
    1. Raspe o pelo do abdômen dos camundongos receptores anestesiados usando um aparador de cabelo, desinfete com álcool 75% e coloque uma cortina estéril.
    2. Levante a pele com pinças dentadas e faça uma incisão na linha média da parede abdominal, do processo xifoide até a base da bexiga, usando tesoura de tecido. Coloque gaze estéril e úmida em ambos os lados da incisão para protegê-la.
    3. Use cotonetes estéreis para empurrar os laços intestinais para o lado direito da incisão e enrole-os com gaze úmida. Após dissecar diretamente o peritônio, exponha a veia cava inferior e a aorta abdominal, ligue as veias lombares e use uma pinça vascular para interromper o fluxo sanguíneo para as extremidades distal e proximal da aorta e veia cava.
    4. Ao microscópio, use uma microtesoura para incisar a parede venosa em cerca de 2 mm, correspondendo ao diâmetro da artéria pulmonar cardíaca doadora; Da mesma forma, incisa a parede arterial em 1-2 mm, correspondendo ao diâmetro da aorta ascendente cardíaca doadora.
    5. Colete o coração doador e realize uma anastomose ponta a lateral entre a artéria pulmonar cardíaca doadora e a veia cava inferior do receptor, utilizando suturas 12-0 não traumáticas. Da mesma forma, realize anastomose ponta a lateral entre a aorta ascendente cardíaca do doador e a aorta abdominal do receptor (ao amarrar o último nó, use soro fisiológico para expulsar o ar do lúmen; pinge intermitentemente soro fisiológico a 4 °C na superfície do coração doador durante a anastomose para resfriá-lo).
    6. Solte a pinça vascular e restaure o suprimento sanguíneo ao coração (o preenchimento normal das artérias coronárias é visível, o coração fica rosado e ele volta a bater em 1-2 minutos). Após reinserir as alças intestinais, feche a cavidade abdominal com suturas de nylon 4-0.
      NOTA: Se o sangramento intraoperatório exceder 0,5 mL, administre soro fisiológico normal por via subcutânea para manter o volume de líquido.
    7. Após a operação, coloque os camundongos em uma plataforma de aquecimento a 37 °C para monitoramento. Quando o camundongo receptor recuperar a consciência, coloque-o de volta na gaiola de alojamento. O camundongo retoma a alimentação e o consumo normal após a cirurgia.

5. Cuidados pós-operatórios e monitoramento

  1. Observação em condição geral
    1. Garanta observação diária do estado de dor do rato após a cirurgia, seja por menor apetite, menor atividade, lambida excessiva ou arranhões na ferida, ou aumento da agressividade.
    2. Garanta a observação diária da ferida cirúrgica após a cirurgia, verificando vermelhidão, inchaço, exsudado ou sintomas de infecção purulenta. Se necessário, limpe e desinfete a ferida.
  2. Observação da sobrevivência do enxerto cardíaco
    1. Garanta observação diária e palpação para verificar e registrar a intensidade do batimento cardíaco transplantado. Se necessário, anestesie o rato e faça uma incisão para observar o batimento cardíaco.
      NOTA: Quando o batimento cardíaco do coração transplantado para completamente, é registrado como falência do enxerto, e o tempo de sobrevivência é registrado.

6. Avaliações pós-operatórias

  1. Detecção de nível de DSA
    1. No grupo NS, colete amostras de sangue nos dias pós-operatórios 0, 4 e 7 após a tomografia para monitorar os níveis de DSA após o transplante. No grupo PS, colete amostras nos dias 0, 4 e 7 após a ST e nos dias 1 e 3 após a TC para avaliar a dinâmica da DSA após a pré-sensibilização. No grupo PS+CsA, colete sangue nos dias 0, 4 e 7 após ST e nos dias 1, 3 e 5 após a TC para avaliar os efeitos da CsA nos níveis de DSA.
    2. Centrifugar a amostra de sangue total do camundongo receptor e coletar o soro (2000 x g, 10 min, 4 °C); dilua o soro 10 vezes com PBS e incube-o com células de baço de camundongo doado a 37 °C por 30 minutos.
    3. Após centrifugação a 350 × g e 4 °C por 5 minutos, descarte o sobrenadante. Lave as células pipetando suavemente 1 mL de PBS e repita essa etapa de lavagem duas vezes após a centrifugação subsequente.
    4. Incubar as células com fluoresceína isotiocianato (FITC) anticorpo IgG de camundongos e anticorpo IgM de ficoeritrina (PE) anti-camundongo a 4 °C por 1 hora.
    5. Após lavar as células com PBS, ressuspenda-as até uma concentração de 5 × 106 /mL.
    6. Use citometria de fluxo para detectar os dois anticorpos separadamente e analise a intensidade média de fluorescência (MFI) para avaliar os níveis de DSA (IgG, IgM) no camundongo receptor (Configurações de Parâmetros: Adquirir 10.000 eventos para análise). Use FSCA vs. SSCA para excluir detritos, depois aplique FSCA vs. FSCH gating para remover duplos. Inclua um controle negativo e ajuste a tensão de cada canal para posicionar a população negativa dentro da faixa de 100-10 1 ).
  2. Exame histopatológico do enxerto cardíaco
    1. Colete enxertos às 6 horas, 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias e 5 dias após a tomografia. Após a coleta, fixe os enxertos em paraformaldeído a 4%, infiltre rotineiramente na parafina, corte e tinga com hematoxilina-eosina (H&E). Observe as alterações patológicas dos enxertos sob um microscópio óptico de 400x.
  3. Coloração C4d
    1. Corte as amostras embutidas em parafina em seções de 4 μm, achate as seções em água a 42 °C e seque no forno a 60 °C por 30 minutos.
    2. Deparafinize e hidrate o tecido usando sequencialmente xileno I, xileno II, etanol e água deionizada.
    3. Imerga as seções em solução de recuperação de antígeno EDTA, aqueça a 95-100°C por aproximadamente 15 minutos e esfrie até a temperatura ambiente.
    4. Incube as seções com solução de peróxido de hidrogênio a 3% em temperatura ambiente por 10-15 minutos para inativar a peroxidase endógena.
    5. Dilua os anticorpos anti-C4d (1:200) com diluiente de anticorpos e incube com as seções a 4 °C durante a noite. Após a incubação, lave as seções com PBS.
    6. Adicione os anticorpos secundários correspondentes e incube em temperatura ambiente por 30 minutos, depois lave com PBS.
    7. Adicione a solução de cromógeno DAB e incube em temperatura ambiente por 30 s para coloração.
    8. Realize contracoloração com hematoxilina, desidrate com etanol, imersa em xileno e monte com resina neutra.
    9. Observe os resultados da coloração dos enxertos sob um microscópio óptico de 400x.

7. Análise estatística

  1. Use a média ± o desvio padrão para apresentar todos os dados.
  2. Use o teste t para comparações de grupos de dados contínuos com distribuição normal, enquanto use o teste Mann-Whitney U para comparações de grupos de dados contínuos que não seguem uma distribuição normal.
  3. Use a análise de Kaplan-Meier para comparar o tempo de sobrevivência dos aloenxertos cardíacos entre grupos.
  4. Use a versão 27.0 do SPSS para analisar estatisticamente todos os dados e considere um valor P de <0,05 como estatisticamente significativo.

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Resultados

Tempo de sobrevivência do aloenxerto cardíaco
Após o estabelecimento bem-sucedido do modelo camundongo, os tempos de sobrevivência dos enxertos entre os grupos foram avaliados usando análise de Kaplan-Meier. Como previsto, camundongos do grupo PS apresentaram sobrevida média significativamente menor dos aloenxos cardíacos em comparação com aqueles do grupo NS (2,8 ± 0,4 dias vs. 6,8 ± 0,7 dias, P < 0,01), atribuíveis à RAM aguda. Para facilitar a avaliação futura de e...

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Discussão

Atualmente, os tratamentos para a RAM em estágio avançado continuam ineficazes, e métodos confiáveis para seu diagnóstico precoce sãoinsuficientes 22,23,24,25. Para suprir essa lacuna, este estudo estabeleceu um modelo agudo de camundongos de RAM para facilitar a investigação mecanicista. Os receptores foram pré-sensibilizados com ST e receberam CsA para suprim...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82200847), Projeto de Ciência e Tecnologia da cidade de Guangzhou (nº 2024A03J0765) e Fundo de Pesquisa em Ciências Médicas de Guangdong (nº A2025268).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo monoclonal anti-C4dHycult Biotech (Holanda)HP8034Para imunohistoquímica (detectando deposição de complemento)
Conjunto completo de instrumentos microcirúrgicosGuangzhou Qihua Medical Equipment Co., Ltd.Usado para realizar cirurgia de transplante cardíaco de camundongos
Microscópio cirúrgico estereoscópico contínuo de zoomBeijing Zhongtian Guangzheng Technology Co., Ltd.TS-39NKUsado para realizar cirurgia de transplante cardíaco de camundongos
Ciclosporina ANovartis Pharmaceuticals (Suíça)H20100673Usado para inibir a TCMR em camundongos receptores
Anticorpo IgG anti-camundongo FITCBio Legend (EUA)406001Usado para quantificação citométrica em fluxo dos níveis DSA-IgG
Citômetro de fluxoBecton Dickinson, EUABD FACScaliburUsado para avaliação dos níveis séricos de DSA em camundongos receptores
Anticorpo IgM anti-camundongo PEBio Legend (EUA)406507Usado para quantificação citométrica em escoamento de níveis DSA-IgM
Sistema de anestesia gasosa para pequenos animaisAnhui Zhenghua Bio-Instrument Equipment Co., Ltd.ZH-MZJEquipado com isoflurano para anestesia geral
Grampos Vasculares BulldogROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.RS-5481TUsado para bloquear o fluxo sanguíneo durante transplante cardíaco

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