Este protocolo descreve as etapas necessárias para a colonização de camundongos com pks+ Escherichia coli em condições não inflamatórias, bem como métodos não invasivos para validação da colonização e avaliação da expansão de pks+ E. coli nas fezes.
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Artigo de método
Colonização com Escherichia coli de Murine pks+ Escherichia coli sob condições não inflamatórias
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pks+ Escherichia coli está cada vez mais implicada no desenvolvimento do câncer colorretal (CCR), especialmente entre um subconjunto em rápida expansão de pacientes jovens com CCR de início precoce. Cepas de pks+ E. coli produzem a genotoxina colibactina, conhecida por causar quebras de DNA de fita dupla e mutações nas vias de proliferação e diferenciação celular associadas à CRC. Este artigo detalha um método para colonização de pks+ E. coli em camundongos sob condições não inflamatórias, desde a preparação do inóculo bacteriano até a validação da colonização. Após incubação durante a noite, a cepa de E. coli NC101 de pks+ é administrada a camundongos condicionados a antibióticos por via oral. A colonização nas fezes é avaliada quantificando o número de unidades formadoras de colônias gram-negativas (CFUs) fermentando lactose e por amplificação quantitativa por PCR. Usando esse protocolo, foi demonstrado que, após a colonização bem-sucedida de camundongos C57BL/6 com E. coli NC101, a suplementação com a fibra alimentar inulina promoveu o crescimento de pks+ E. coli, refletido pelo aumento da recuperação das UFC, maior abundância da família Enterobacteriaceae e níveis elevados da E. P Gene. Em resumo, esse modelo permite o estudo de tratamentos preventivos e terapêuticos direcionados a um patobionte-chave envolvido no desenvolvimento do CRC.
Introdução
Sabe-se que a microbiota intestinal desempenha um papel significativo na saúde e doenças do hospedeiro, com disbiose microbiana intestinal, ou crescimento excessivo de certas bactérias potencialmente patogênicas (patobiontes), identificadas como uma característica de vários estados patogênicos, incluindo doenças cardiovasculares, doenças inflamatórias intestinais (DII) e câncer1. pks+ Escherichia coli é um patobionte enriquecido em amostras de tecido colônico de pacientes comDII 2 e câncer colorretal (CCR)3 em comparação com indivíduos saudáveis. A atividade pró-tumorigênica da pks+ E. coli está ligada à expressão do aglomerado gênico policetida sintase (pks) e à produção da genotoxinacolabactina 4. A colibactina transloca para o núcleo das células epiteliais do cólon, levando à formação de quebras de DNA de fitadupla 5 e mutações em vias associadas aoCRC 6. A colonização por pks+ E. coli tem demonstrado contribuir para a iniciaçãotumoral 7 e a progressãotumoral 3 em modelos pré-clínicos de CCR associada à colite (CAC). Recentemente, a mutagênese induzida por colibactina tem sido associada ao CRC de inícioprecoce 8,9. A incidência de CRC de início precoce, ocorrendo em menores de 50 anos, tem aumentado nas últimas décadas, com potencial para reverter a atual diminuição geral nas taxasde CRC 9.
O papel da pks+ E. coli no desenvolvimento do CRC, assim como em outros aspectos da saúde do hospedeiro mediados pela microbiota, continua a ser elucidado. Além disso, vários fatores demonstraram influenciar a expressão gênica da PKS, incluindoinflamação 10, concentrações de ferroluminal 11 e fatores dietéticos12,13, abrindo portas para intervenções direcionadas à microbiota. Um método é descrito aqui para colonização intestinal de pks+ E. coli via gavage oral em camundongos usando uma cepa murina da cepa pks+ E. coli NC101 (E. coli NC101). Outros modelos avaliaram os efeitos da E. coli NC101 na inflamação e carcinogênese em camundongos livres de germes (GF) monocolonizados por gavage oral e swabretal 3, em modelos geneticamente suscetíveis (IL-10-/-) decolite 3,14, e em modelos quimicamente induzidos de inflamação do cólon e ruptura da barreiraintestinal 15. No entanto, a colonização econômica com pks+ E. coli também pode ser obtida em condições não inflamatórias em camundongos livres de patógenos específicos (SPF) pré-tratados com antibióticos para criar um nicho para colonização eexpansão 14,16,17. Diversos métodos para a detecção e quantificação de pks+ E. coli em fezes de camundongos também são apresentados, incluindo amplificação quantitativa por PCR (qPCR) do gene clbP, avaliação por qPCR da abundância da família Enterobacteriaceae e recuperação de unidades formadoras de colônia (CFUs) em meio de ágar MacConkey específicas para bactérias fermentadoras de lactose gram-negativas. Esses métodos podem ser usados de forma intercambiável ou em conjunto para confirmar a presença de pks+ E. coli e a produção de colabactina, para fins de validação ou para avaliar diferenças na expansão de pks+ E. coli em resposta a intervenções direcionadas à microbiota.
Aqui, este protocolo é usado para avaliar o efeito da inulina da fibra dietética na colonização e expansão de pks+ E. coli por qPCR e recuperação das CFUs. A inulina é um prebiótico que demonstrou promover o crescimento de espécies benéficas de Bifidobacterium e Lactobacillus no intestino, além de aumentar a produção de ácidos graxos de cadeia curta, que desempenham um papel importante na homeostaseintestinal 18. No entanto, a inulina também demonstrou promover o crescimento da produção de pks+ E. coli e colibactina, levando ao aumento da tumorigênese em um modelo de polipose adenomatosa coli (Apc)Min/+ CRC tratado com DSS. Este experimento avalia a expansão de pks+ E. coli em resposta à inulina alimentar em um modelo de camundongo, sem inflamação ou barreira intestinal comprometida.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados Animais após aprovação pelo Comitê Institucional de Cuidados Animais do Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM). Camundongos de sete semanas foram obtidos de uma fonte comercial e aclimatados por uma semana antes do início do experimento. Uma representação esquemática desse método é apresentada na Figura 1. Os detalhes dos animais, reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
Figura 1: Esquema da preparação e colonização de pks+ E.coli. Dia (D)-4: Quatro dias antes do gavage, comece a tomar antibióticos para os camundongos. D-1: 24 horas antes do gavage, retire os antibióticos. Prepare a cultura de E. coli pks+ para incubação durante a noite. D0: Prepare o inoculo bacteriano pks+ E. coli. Administre a pks+ E. coli ou um controle veicular (soro fisiológico) aos camundongos via gavage oral o mais rápido possível após a preparação do inoculo. D7+ Coletar fezes de camundongos para a detecção e quantificação da colonização por pks+ E. coli. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
1. Tratamento antibiótico
- Diluir ampicilina, colistina e estreptomicina em água potável estéril até uma concentração final de 1 mg/mL para ampicilina, 1 mg/mL para colistina e 5 mg/mL para estreptomicina.
- Permita acesso ad libitum a antibióticos na água potável por 3 dias.
- Remova os antibióticos e restableça o acesso à água estéril por um período de lavagem de 24 horas antes do ataque com o inoculo NC101 de E. coli.
NOTA: A solução antibiótica deve ser preparada fresca para cada experimento. A ingestão adequada da solução antibiótica deve ser monitorada. Se necessário, um adoçante pode ser adicionado à água.
2. Preparação do inoculo NC101 de E. coli (até n = 12 camundongos)
NOTA: Os passos 2.1-2.8 devem ser realizados usando técnica asséptica.
- Prepare e autoclave o Caldo de Lisogênia (LB).
- Estire E. coli NC101 do estoque de glicerol em uma placa de ágar LB usando um laço inoculador estéril. Incube durante a noite a 37 °C.
- Inocule 5mL de caldo LB estéril em um tubo de cultura com uma única colônia da placa de ágar LB usando um laço inoculante. Incube durante a noite a 37 °C em um shaker de incubação de bancada a 150 rpm.
- Centrifuge o tubo de cultivo a 1500 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Remova e descarte o sobrenadante, evitando o pellet bacteriano, que aparecerá como um depósito branco sujo na base do tubo.
- Resuspenda o pellet bacteriano em 5 mL de soro fisiológico estéril 0,9%.
- Lave repetindo os passos 4 a 6.
- Meça a densidade óptica em 600 nm (OD600) usando um medidor de densidade celular e ajuste o OD600 para 0,625 (~1 x 108 CFUs/mouse) usando soro fisiológico estéril.
NOTA: Para garantir que não haja contaminação bacteriana do caldo na etapa 3, incube um tubo separado de 2-3 mL de caldo LB estéril durante a noite. O caldo deve permanecer transparente após a incubação durante a noite, indicando que não há contaminação bacteriana. Se o ODinicial 600 for menor que 0,625, repita os passos 4 a 6, usando um volume menor para resuspender o pellet. Para garantir a dosagem precisa da E. coli NC101, diluições seriadas do líquido gavage devem ser placadas e cultivadas durante a noite. O número de UFC para cada diluição pode ser usado para estimar a quantidade inicial de UFC na suspensão bacteriana.
3. Gavage oral de E. coli NC101
- Agite suavemente o inóculo bacteriano para garantir uma distribuição igual das bactérias.
- Coloque a agulha gavage em uma seringa de 1 mL e encha com 0,2 mL de inoculo bacteriano, removendo qualquer bolha de ar.
- Retire o rato da gaiola e segure suavemente, mas com firmeza, a pele desde atrás das orelhas até as omoplatas, usando a almofada do polegar e o lado do dedo indicador. Prenda a cauda com o dedo médio ou anelar da mesma mão.
- Segure o rato em posição vertical e insira a agulha gavage na lateral da boca. Deslize a ponta da agulha de gavage pelo céu da boca até o esôfago e o estômago, empurrando suavemente a cabeça do rato para trás para estender o pescoço. Se sentir alguma resistência, remova a agulha gavage. Faça uma nova limpeza do mouse se necessário antes de tentar novamente.
- Injete lentamente o inóculo bacteriano (0,2 mL) e retire a agulha, seguindo o mesmo ângulo da inserção.
- Devolva o rato para a gaiola e prossiga com os ratos restantes.
NOTA: O inóculo bacteriano deve ser administrado o mais rápido possível após a preparação. Os camundongos controle devem receber 0,2 mL de soro fisiológico estéril 0,9% (veículo). O comprimento, calibre e diâmetro da esfera apropriados da agulha de gavage devem ser determinados com base no peso corporal médio dos camundongos em cada experimento. Verifique o padrão respiratório e a atividade do camundongo após 5 minutos e antes de sair da instalação animal. Se houver dificuldade respiratória ou dificuldade respiratória, eutanasie o rato seguindo um protocolo aprovado. A gavage oral deve ser realizada apenas por equipe de pesquisa treinada. A execução inadequada do gavage oral pode levar a complicações graves ou morte devido à perfuração do esôfago ou à injeção do líquido do gavage nos pulmões. Quando realizada por pesquisadores experientes, não se espera mortalidade com esse procedimento. Os camundongos usados neste experimento devem ser alojados sob condições de FPS. Para evitar contaminação entre gaiolas, devem ser usadas gaiolas ventiladas individualmente, e os camundongos devem ser manipulados em um armário de segurança biológica. Antes de abrir cada gaiola, as mãos e a parte externa da tampa devem ser limpas com um desinfetante apropriado (por exemplo, peróxido de hidrogênio acelerado). Os requisitos de EPI para manipular camundongos usados neste protocolo incluem um avental (descartável ou reutilizável) e luvas. A instalação para animais hospedeiros pode exigir EPIs adicionais. Todas as manipulações envolvendo camundongos controle devem ser realizadas primeiro.
4. Coleta de amostras fecais
- Colete um pellet fecal de cada camundongo em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL, fazendo o calugo com o pelo pelo do camundongo, conforme descrito no passo 3.3. O rato deve defecar imediatamente. Alternativamente, coloque o rato em uma gaiola limpa e vazia e espere até 30 minutos para que a deserção ocorra.
- Congele a amostra rapidamente colocando o tubo em nitrogênio líquido. Armazene a amostra a -80 °C até análise adicional.
NOTA: A detecção de clbA ou quantificação de clbP nas fezes por PCR em tempo real deve ser realizada antes do início do experimento para verificar se os camundongos não estão colonizados com pks+ E. coli. Para manter a colonização além de uma semana, pode ser necessário o reaparecimento bacteriano sem a pré-administração de antibióticos (etapas 2.1-3.6), dependendo das condições experimentais. A quantificação da E. coli NC101 em fezes por recuperação da CFU ou PCR em tempo real deve ser realizada pelo menos semanalmente durante a duração do experimento ao implementar este protocolo pela primeira vez, para otimizar a frequência de dosagem.
5. Extração de DNA de bactérias fecais
- Extraia DNA bacteriano de amostras coletadas de fezes usando um kit de extração de DNA seguindo as instruções do fabricante.
- Meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro e ajuste a concentração de DNA para 5 ng/μL.
6. Confirmação da colonização por detecção dos genes 16S de ClbA e E. coli
- Realize a amplificação simultânea dos genes de RNA ribossomal (rRNA) 16S de ClbA e E. coli (Tabela Suplementar 1) por PCR usando uma mistura master apropriada e um instrumento para PCR, seguindo as instruções do fabricante.
- Visualize os genes 16S de clbA e E. coli em camundongos colonizados por E. coli NC101 por eletroforese em gel de agarose, conforme descritoanteriormente 19. Ratos não colonizados devem não ter a faixa clbA .
7. Quantificação da E. coli NC101 pela recuperação da CFU
NOTA: Execute os passos 7.1-7.7 usando a técnica asséptica.
- Pese um tubo vazio de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Adicione cerca de 20 mg de fezes ao tubo da microcentrífuga de 1,5 mL e registre o peso do tubo com a amostra adicionada.
- Adicione 200 μL de soro fisiológico estéril 0,9% em cada tubo.
- Espere de 10 a 15 minutos para as fezes amolecerem em temperatura ambiente e faça vórtice em cada tubo por 5 minutos na velocidade máxima para obter uma suspensão homogênea. Pequenas partículas de alimento não digerido serão visíveis.
- Transfira 100 μL de cada suspensão para uma placa de ágar MacConkey e distribua uniformemente o homogeneado usando um espalhador em formato de L.
- Incube as placas durante a noite a 37 °C.
- Conte o número de colônias rosadas e normalize pelo peso de cada pellet fecal e pelo volume de placas.
NOTA: O ágar MacConkey seleciona bactérias gram-negativas. Além disso, bactérias que podem fermentar a lactose (como E. coli) formam colônias rosas, enquanto aquelas que não conseguem formar colônias incolores ou amarelas. Apenas colônias rosas devem ser contadas para os fins deste protocolo. Se o número da colônia estiver muito elevado para ser contado, diluições seriadas do homogeneado inicial podem ser realizadas usando soro fisiológico estéril de 0,9%. Leve em consideração o fator de diluição ao calcular o número de colônias por amostra.
Peso do pellet = peso do tubo da microcentrífuga com a amostra do pellet - peso do tubo vazio da microcentrífuga.
8. Quantificação do gene clbP
- Realize a amplificação dos genes de rRNA 16S e clbP (Tabela Suplementar 1) por PCR quantitativa usando uma mistura master e instrumento apropriados para PCR em tempo real, seguindo as instruções do fabricante.
9. Quantificação das Enterobacteriaceae
- Realizar amplificação dos genes Enterobacteriaceae e do RNA universal 16S (suplementar) por PCR quantitativa usando uma mistura master e instrumento apropriados para PCR em tempo real.
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Resultados
A amplificação e visualização dos genes ClbA e E. coli 16S nas fezes no ponto final, por PCR e eletroforese em gel, mostraram que, embora ambos os genes fossem visíveis em camundongos colonizados por E. coli NC101, apenas o gene E. coli 16S era visível em camundongos controle, confirmando que E. coli NC101 não estava presente (Figura 2B).
Como esperado, 15 camund...
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Discussão
Os efeitos pró-cancerígenos da pks+ coli, produtora de colibactina, têm sido recentemente associados tanto ao aumento da CRC9 de início precoce quanto à adoção de uma dieta "estiloocidental" 12, fatores que continuarão a moldar as tendências da CRC nas próximas décadas. A maioria dos modelos de colonização por pks+ E. coli é apresentada no contexto do câncer associado à colite, que não permite a caracterização de pks+ ...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma bolsa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde [CIHR, bolsa CSV-198232]. Agradecemos à unidade animal da CRCHUM. As figuras foram criadas usando BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,9% de soro fisiológico estéril | Baxter | JF7634 | |
| Dieta personalizada 10% de Inulina | Teklad | TD.240286 | Resultados representativos |
| 50 ppm FeS04 (Sem fibras) dieta personalizada | Teklad | TD.120515 | Resultados representativos |
| Fêmeas de 8 a 12 semanas de camundongos B6 | Laboratórios Charles River | C57BL/6 | Resultados representativos |
| Ampicilina sal sódico & nbsp; | Wisent Inc | 400-110 XG | |
| Centrífuga de bancada | Fisher científica | 75004381 | |
| Medidor de densidade celular | Biochrom | 80-2116-30 | |
| Tubo de cultura, 13mL | Sarstedt | 62.515.006 | |
| ECNC101 | N/A | N/A | Doado pelo Dr. Christian Jobin, Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill & nbsp; |
| Agulha Gavage, 38mm x 22 G | Aparato de Harvard Canadá | 34-024 | Não mais disponível - Uma alternativa potencial está disponível em Instech Labs (FTP-22-38) e nbsp; |
| Agitador orbital incubador | VWR | 980153 | |
| Anilha inoculante | Fisher científica | 22-363-595 | |
| Espalhador em formato de L | Fisher científica | 14-665-230 | |
| Caldo de lisogénia | Wisent Inc | 800-060 LG | Adicione 35g de LB de pó e 1L de água. Autoclave antes de usar. |
| Agar , caldo de lisogena; | Wisent Inc | 800-011 LG | Adicione 35g de LB de pó e 1L de água. Autoclave antes de usar. |
| Ágar MacConkey | Becton Dickinson | 211387 | Adicione 50g de pó de MacConkey a 1L de água. Autoclave antes de usar. |
| Kit de extração de DNA microbiano | Qiagen | 47016 | |
| Incubadora microbiológica | Fisher científica | 150152633 | |
| Tubo de microcentrífuga, 1,5mL | UltiDent Scientific | 73-M150-C | |
| Rotor de PCR - Tubos de tira genética | UltiDent Scientific | 73-V100-RG | |
| Placa de Petri | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PCR em tempo real SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| Ciclador térmico de PCR em tempo real | Pesquisa Corbett | RG-3000A | |
| Tubo de tampa de rosca, 15mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Colistimetano de sódio | Fresenius Kabi | C309306 | |
| Sal de sulfato de estreptomicina | Millipore Sigma | S9137 | |
| Tubo de deslizamento de tuberculina, 1mL | Becton Dickinson | 309659 | |
| Vórtice | Fisher científica | 12-812 |
Referências
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Reimpressões e permissões
