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Artigo de investigação
Este estudo utilizou o sequenciamento do rRNA 16S para comparar a microbiota intestinal entre controles saudáveis, pacientes com DP não tratados e pacientes com DP tratados com piribedil, e identificou diferenças na composição microbiana associadas ao tratamento com piribedil.
Este estudo teve como objetivo determinar se a terapia com piribedil altera a microbiota intestinal de pacientes com doença de Parkinson (DP), fornecendo uma referência teórica para entender as alterações da microbiota intestinal induzidas pelo piribedil e suas potenciais implicações clínicas. As amostras fecais foram analisadas usando sequenciamento do gene do RNA ribossomal 16S (16S rRNA). Foram feitas comparações entre pacientes com DP que tomaram piribedil (grupo piribedil), pacientes com DP que não tomaram piribedil (grupo DP) e controles saudáveis (grupo em branco). Comparado ao grupo branco, a abundância relativa de Staphylococcus, Rhodococcus e outros gêneros foi maior no grupo PD, enquanto a abundância relativa de Achromobacter e Delftia foi menor. Além disso, a abundância relativa de Achromobacter, Delftia e Stenotrophomonas foi maior no grupo piribedil em comparação com o grupo PD, enquanto a abundância relativa de Staphylococcus, Rhodococcus e outras espécies foi menor. Comparado a indivíduos saudáveis, a microbiota intestinal dos pacientes com DP apresentou mudanças significativas. A microbiota intestinal dos pacientes que tomam piribedil difere significativamente da dos pacientes não tratados. Esses resultados sugerem uma associação entre piribedil e microbiota intestinal alterada em pacientes com DP.
A incidência da doença de Parkinson (DP) está aumentando gradualmente; no entanto, sua etiologia e patogênese ainda não foram totalmente esclarecidas. Mais estudos indicaram que a microbiota intestinal está intimamente relacionada ao início e desenvolvimento da DP. He et al.1documentaram que a composição da microbiota intestinal em pacientes com DP difere da de pessoas saudáveis, e que um aumento de patógenos intestinais pode estar associado ao aparecimento da DP. Scheperans et al.2confirmaram que a abundância relativa de Prevotella e Bacteroides no intestino de pacientes com DP é reduzida, e que esses gêneros bacterianos estão fortemente associados à função da barreira intestinal.
Diversos estudos investigaram a conexão entre a microbiota intestinal e a DP. Pesquisas sugerem que a disbiose pode desempenhar um papel crucial na fisiopatologia da DP, influenciando sintomas motores e não motores por meio de múltiplos mecanismos, incluindo inflamação e distúrbiosmetabólicos 3. Além disso, tratamentos medicamentosos para DP demonstraram alterar a composição do microbiomaintestinal 4,5, destacando a complexa interação entre medicamentos e microbioma intestinal.
Como agonista não seletivo dos receptores de dopamina, o piribedil é fundamental no manejo da DP; Pode melhorar os sintomas motores dos pacientes ao estimular os receptores dedopamina 6. No entanto, seu uso clínico é frequentemente limitado por reações adversas, principalmente sintomas gastrointestinais como náusea, vômito e desconfortoabdominal 7. O mecanismo subjacente desses efeitos colaterais ainda não está claro, e se eles estão relacionados a alterações na microbiota intestinal induzidas pelo piribedil ainda é desconhecido.
A ligação entre a microbiota intestinal e as reações adversas a medicamentos tem despertado interesse crescente nos últimos anos. Hill-Burns et al.8analisaram a microbiota intestinal em pacientes com DP e descobriram que a diversidade da microbiota intestinal estava associada à resposta à terapia medicamentosa. Além disso, agonistas da dopamina podem impactar a motilidade intestinal e a composiçãomicrobiana 9. Acredita-se que os mecanismos por trás dessas mudanças envolvam alterações no tempo do transporte intestinal, o que, por sua vez, afeta a diversidade e abundância microbiana. Além disso, a microbiota intestinal pode influenciar a absorção e o metabolismo dosmedicamentos, afetando assim a eficácia e os efeitos colaterais desses medicamentos. No entanto, ainda falta pesquisa sistemática sobre se e como o piribedil, um agente comumente usado para a doença de Parkinson, modula a estrutura da microbiota intestinal, bem como a associação entre essas mudanças microbianas e suas reações adversas gastrointestinais.
No presente estudo, comparamos a estrutura da microbiota intestinal entre controles saudáveis, pacientes com DP não tratados e pacientes tratados com piribedil. Hipotetizamos que o tratamento com piribedil está associado a alterações distintas na composição da microbiota intestinal em pacientes com Parkinson e que essas alterações microbianas podem estar ligadas a efeitos colaterais gastrointestinais associados ao piribedil. Nosso objetivo era identificar alterações microbianas específicas associadas ao piribedil e explorar sua potencial associação com efeitos colaterais gastrointestinais, fornecendo assim uma base teórica para entender o mecanismo das reações adversas relacionadas ao piribedil.
A microbiota intestinal é uma direção importante para a pesquisa sobre a patogênese da PD11. Ao observar os efeitos do piribedil na microbiota intestinal em pacientes com DP, este estudo ajuda a esclarecer a importância clínica das alterações da microbiota intestinal relacionadas a medicamentos e fornece uma referência para otimizar o uso clínico e o manejo da segurança do piribedil.
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Este estudo foi revisado pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Anhui (Número da revisão ética: 2025AH-101, Data de aprovação ética: 2025-07-02).
Temas de pesquisa
Pacientes com DP e controles saudáveis do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Anhui foram inscritos. Amostras frescas de fezes foram coletadas para análise de acompanhamento. Amostras fecais frescas eram coletadas, alicotadas em tubos EP estéreis, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e então armazenadas a −80 °C para preservação a longo prazo. Os critérios de inclusão dos pacientes com DP foram os seguintes: (1) diagnóstico clínico de DP; (2) idade >70 anos; (3) para o grupo Piribedil: iniciou a monoterapia com piribedil após o registro e não teve exposição prévia a este medicamento; para o grupo de DP: não receber tratamento com medicamentos anti-Parkinson; (4) não há outras doenças sistêmicas graves, como doenças cardíacas graves, doença hepática, doença renal ou câncer. Antes da inscrição, foi obtido consentimento informado por escrito de cada participante. Os critérios de exclusão foram os seguintes: (1) complicações graves da DP, como disfunção motora severa; (2) recebeu tratamento antibiótico recentemente; (3) presença de outras condições de saúde que possam afetar os resultados do estudo, como doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, etc.; (4) alérgico ao piribedil. Os participantes saudáveis do controle (grupo Blank) eram indivíduos com idade pareada (idade >70 anos) sem histórico de doenças neurológicas ou gastrointestinais graves.
Todos os participantes foram obrigados a manter seus hábitos alimentares regulares antes da inscrição. Nenhum recebeu probióticos, prebióticos, suplementos de fibras alimentares ou outros suplementos nutricionais. Além disso, todos os participantes não haviam recebido qualquer tratamento antibiótico por pelo menos três meses antes da coleta da amostra. Nenhuma intervenção dietética padronizada foi realizada durante o estudo, mas todos os participantes foram instruídos a manter um estilo de vida e uma dieta estáveis para minimizar possíveis efeitos de confusão sobre a microbiota intestinal.
Agrupamento de pesquisa
Essa coorte do estudo foi dividida em três grupos: grupo DP (n = 10): amostras fecais coletadas de pacientes com doença de Parkinson que não estavam tomando medicação anti-Parkinson. Grupo Piribedil (n=10): amostras fecais coletadas de pacientes com doença de Parkinson após 21 dias consecutivos de tratamento com piribedil (50 mg, duas vezes ao dia). Grupo controle em branco (n=5): amostras fecais coletadas de indivíduos saudáveis.
Sequenciamento de RNA ribossomal 16S
O sequenciamento foi realizado em uma plataforma de sequenciamento, conforme relatado em outrosestudos 12,13. Resumidamente, DNA microbiano total foi isolado de amostras fecais usando o método do dodecilsulfato de sódio (SDS) 14,15,16. A integridade do DNA extraído foi verificada por eletroforese em gel de agarosa a 1%, e a concentração e pureza do DNA foram determinadas com um espectrofotômetro. A região hipervariável V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA foi amplificada a partir do DNA genômico usando primers degenerados 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') e 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') com termociclador de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). A amplificação do gene bacteriano 16S rRNA foi realizada sob as seguintes condições térmicas: uma etapa inicial de pré-desnaturação a 94 °C por 2 minutos, seguida por 28 ciclos consistindo em desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s e elongação a 72 °C por 30 s. Uma extensão final foi realizada a 72 °C por 10 minutos, e a reação foi então mantida em 4 °C. As misturas de PCR contêm 2× mistura mestra PCR de 25 μL, primer direto (10 μM), 2 μL, primer reverso (10 μM) 2 μL, DNA molde de 10 ng e, finalmente, ddH2O até 50 μL. As reações PCR foram realizadas em triplicada. As misturas de PCR contêm 2× mistura mestre de PCR de 25 μL, primer direto (10 μM) 2 μL, primer reverso (10 μM) 2 μL, DNA molde de 10 ng e, finalmente, ddH2O até 50 μL. As reações PCR foram realizadas em triplicada. O produto PCR foi extraído de gel de agarose a 2% e purificado usando um kit de extração em gel. O Kit de Preparação da Biblioteca Universal Plus DNA para MGI V2 foi usado para construir a biblioteca: (1) Ligação Splinter; (2) Utilizar triagem magnética de esferas para remover os segmentos autocontíguos da junta; (3) Enriquecimento de modelos de biblioteca por amplificação por PCR; (4) Esferas magnéticas para recuperar produtos de PCR; (5) Ciclização de produtos PCR. Após a validação da biblioteca, o sequenciamento era realizado.
Pontos de verificação de qualidade: Checkpoint 1 (Coleta de amostras): As amostras foram congeladas imediatamente após a coleta e armazenadas a −80°C. Qualquer amostra com sinais visíveis de descongelamento ou contaminação foi descartada. Ponto de controle 2 (extração de DNA): Pureza aceitável: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 ≥1,8; Integridade verificada por uma única faixa de alto peso molecular em gel de agarose a 1%. Checkpoint 3 (amplificação por PCR): Uma única faixa a ~460bp em gel de agarose a 2% indica amplificação bem-sucedida (primers 341F/806R, região V3-V4); Se ausente ou inespecífico, ajuste a temperatura de recozimento ou a concentração do molde. A concentração de recuperação ≥0,5 ng/μl foi necessária para a preparação da biblioteca. Checkpoint 4 (Preparação e sequenciamento de biblioteca): Realizado pela instalação de sequenciamento seguindo seus protocolos validados padrão; nenhum ponto de verificação adicional interno (por exemplo, dimensionamento do bioanalisador) foi aplicado.
Segurança e descarte de resíduos: Luvas e jalecos eram usados durante todo o manuseio das amostras. As superfícies de trabalho foram limpas com 70% de etanol. Todos os consumíveis contaminados (ponteiras, tubos, géis) foram autoclavados (121°C, 20 min) antes de serem descartados como resíduos bio-perigosos.
Bioinformática
As leituras de sequenciamento bruto do gene 16S rRNA foram primeiro desmultiplexadas, submetidas a filtragem de qualidade usando fastp (versão 0.20.0) e montadas via FLASH (versão 1.2.11) sob critérios padronizados de triagem. Resumidamente: (i) Sequências brutas de 300 pb foram reduzidas quando a média de qualidade caiu para abaixo de 20 dentro de uma janela deslizante de 50 pb. Leituras com comprimentos truncados menores que 50 bp ou contendo bases ambíguas foram removidas; (ii) A montagem da sequência era realizada apenas para sobreposições acima de 10 pb, com a razão máxima de desajuste da região sobreposta definida em 0,2. Leituras não pareadas que não puderam ser montadas foram eliminadas; (iii) Amostras individuais foram particionadas com base em sequências de código de barras e espoletas para ajuste subsequente da orientação. A correspondência de códigos de barras foi realizada com alinhamento exato, enquanto a correspondência de primers permitiu no máximo 2 desajustes de nucleotídeos. As leituras de rRNA 16S foram analisadas usando o pipeline Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) (versão 1.8.0)17. Sequências de tags foram adicionadas a leituras de extremidade pareada usando o FLASH (versão 1.2.11)18. O corte foi realizado usando UPARSE (versão 7.0.1090) com comprimento mínimo de 200 bp e qualidade média de 25, seguido por agrupamento com um corte de 97% para gerar unidades taxonômicas operacionais (OTUs)19. As leituras representativas da OTU foram classificadas taxonomicamente via RDP Classifier 2.2, com limite de confiança ≥0,6. As abundâncias de etiquetas e leituras foram determinadas por comparação usando o USEARCH global20. A identificação de sequências quiméricas foi baseada em comparações com o banco de dados Gold usando UCHIME (v4.2.40)21. A análise de coordenadas principais (PCoA) foi posteriormente realizada no conjunto de dados esparso baseado na dissimilaridade de Bray–Curtis, com o limiar de similaridade de sequência estabelecido em 97% para agrupamento. OTUs representativas e perfis taxonômicos correspondentes foram analisados mais detalhadamente usando o software R (versão 3.1.1). O algoritmo de tamanho do efeito da análise discriminante linear (LEfSe), baseado no tamanho do efeito da análise discriminante linear (LDA), foi aplicado para triagem de biomarcadores com abundância diferencial significativa no nível da OTU. Esse método enfatiza tanto a significância estatística quanto a relevância biológica, identificando primeiro características com diferenças consistentes entre os grupos (usando o teste de Kruskal-Wallis para comparação multigrupo) e depois estimando o tamanho do efeito de cada característica diferencialmente abundante usando LDA. Uma pontuação LDA >2,0 é definida como um aumento significativo daabundância 22.
Métodos Estatísticos
Análises estatísticas foram realizadas usando SPSS. Os dados normalmente distribuídos foram analisados usando a análise unidirecional da variância (ANOVA). Dados que não seguiram a distribuição normal foram analisados usando o teste de soma de ranks de Wilcoxon. Todos os dados quantitativos foram expressos como média ± erro padrão (SE) para parâmetros que seguem uma distribuição normal, enquanto dados não distribuídos normalmente foram apresentados como mediana com intervalo interquartil. Um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Diferenças na diversidade microbiana associadas ao tratamento com piribedil
Os resultados do controle de qualidade da extração de DNA (faixa de concentração, pureza) são fornecidos na Tabela Suplementar 1. O controle de qualidade da amplificação por PCR (tamanho da banda, concentrações de recuperação) é mostrado na Tabela Suplementar 2. Métricas de controle de qualidade de sequenciamento (contagem de leituras, profundidade, co...
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A doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais comum no mundo, sendo precedida apenas pela doençade Alzheimer 23. Desde 1970, o piribedil, como agonista dos receptores de dopamina, tem sido amplamente utilizado no tratamento da PD24. No entanto, na prática clínica, o piribedil pode causar algumas reações adversas, como náusea, vômito e desconforto gastrointestinal. Pesquisas crescentes demonstram que o desenvolvimento da do...
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Os autores afirmam que não há interesses concorrentes.
Essa pesquisa foi apoiada pelo Projeto de Financiamento de Candidatos de Reserva para Líderes Acadêmicos da Província de Anhui (nº 2022H287), pelo Projeto de Talentos Excepcionais de Higiene e Saúde da Província de Anhui (nº ahsjhmypygc20230074), pelo Projeto de Pesquisa Científica da Província de Anhui sobre Herança e Inovação da Medicina Tradicional Chinesa (2025CCCX017) e pelo Projeto Especial de Integração Básica-Clínica da Universidade de Medicina Chinesa de Anhui (JCLCA2025009).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | Kangweii | CW0690 | |
| Agarose | (geral) | não aplicável | grau de biologia molecular |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (não fornecido) | |
| Centrífuga de congelamento de alta velocidade de bancada | Hunan Kosei | GTR116C | |
| Reagentes de extração de DNA (SDS, fenol, clorofórmio, etanol) | (geral) | não aplicável | |
| Plataforma de sequenciamento DNBSEQ-G99 PE300 | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| Aparelho de eletroforese em gel | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Sistema de imagem de gel | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| Software LEfSe | (código aberto) | versão online | |
| Espectrofotômetro NanoDrop | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| Máquina de PCR | Hangzhou Langji | A200 | |
| Piribedil | Servier | 6094078 | |
| Primers: 341F e 806R (sintetizados) | (síntese personalizada) | não aplicável | |
| Software QIIME | (código aberto) | http://qiime.org | versão 1.8.0 |
| Fluorômetro Quantus | Promega | E6150 | |
| Fluorômetro Qubit 4.0 | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS (dodecil sulfato de sódio) | (geral) | não aplicável | |
| Software UPARSE | (código aberto) | http://drive5.com/uparse | versão 7.0.1090 |
| Kit de preparação de biblioteca de DNA VAHTS Universal Plus para MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |