Desenvolvimento de Nanovesículas Envolvidas em Membrana por Células-Tronco Mesenquimatosas para Entrega Aprimorada de Genes

Resumo

Esse protocolo visa introduzir um método para produzir e purificar biomiméticos extracelulares derivados de células-tronco mesenquimais (MSC) para terapia gênica. A nanovesícula é confinada com bicamadas lipídicas derivadas da MSC e encapsula AAVs recombinantes que carregam o gene de interesse no lúmen. Essa nanovesícula oferece um vetor aprimorado para a entrega de genes in vivo .

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) derivadas de células-tronco mesenquimatosas (MSC) apresentam grande potencial para aplicações terapêuticas e medicina regenerativa. EVs são vesículas em escala nanométrica secretadas por todos os tipos celulares conhecidos, transportando cargas diversas, incluindo proteínas ancoradas à membrana, fatores solúveis, múltiplas espécies de RNA e metabólitos que regulam a fisiologia e o comportamento das células receptoras. Embora EVs derivados ou modificados por MSC possam fornecer proteínas terapêuticas e RNAs, a entrega de DNA mediada por EVs continua sendo desafiadora devido à falta de mecanismos eficientes para separar sequências de DNA em vesículas. Trabalhos anteriores do nosso grupo e de outros demonstraram que os EVs contendo vírus adeno-associado (AAV) permitem a entrega nuclear direcionada e a expressão gênica sustentada in vitro e in vivo. No entanto, sua produção e isolamento foram limitados por procedimentos de baixo rendimento e demora. Aqui, relatamos o desenvolvimento de nanovesículas envolvidas em membrana de MSC geradas por um método de extrusão definido por tamanho para entrega eficiente de genes. Essas vesículas, com aproximadamente 200 nm de diâmetro, imitam as propriedades dos EVs naturais enquanto encapsulam vetores AAV recombinantes que carregam sequências gênicas terapêuticas. Comparadas aos AAVs convencionais, as vesículas MSC projetadas melhoraram a eficiência da entrega de genes e alcançaram rendimentos significativamente maiores, com menor tempo e custo em relação aos EV-AAVs naturalmente secretados. Em resumo, apresentamos uma nova plataforma de nanovesículas de membrana baseada em MSC que combina as vantagens de estruturas que imitam EV com transferência gênica mediada por AAV. Essa abordagem aumenta a eficiência da entrega e a escalabilidade da produção, oferecendo uma estratégia promissora para avançar a terapia gênica rumo à tradução clínica.

Introdução

A terapia gênica representa uma abordagem transformadora para tratar doenças genéticas e adquiridas, introduzindo, substituindo ou silenciando genes específicos para restaurar a função celular normal. Nas últimas duas décadas, avanços na engenharia vetorial e nas estratégias de entrega expandiram significativamente o cenário terapêutico da terapia gênica. Entre os diversos sistemas vetoriais desenvolvidos, o vírus adenoassociado (AAV) emergiu como uma das plataformas mais bem-sucedidas e amplamente adotadas devido ao seu perfil de segurança favorável, transdução eficiente e expressão gênica de longo prazo tanto em células divididas quanto não^{divididas 1,2}. Até o momento, múltiplas terapias baseadas em AAV receberam aprovação regulatória para uso clínico, incluindo tratamentos para atrofia muscular espinhal, distrofias retinianas e hemofilia, marcando marcos importantes na medicina^{translacional 3}. O tropismo amplo e a baixa imunogenicidade dos vetores AAV também permitiram sua aplicação em diversos tecidos, incluindo fígado, músculo, sistema nervoso central e^{olho 4}. Como resultado, o AAV tornou-se uma plataforma líder para a entrega de genes in vivo, apoiando estudos pré-clínicos e clínicos em andamento que focam em distúrbios metabólicos, neurológicos e cardiovasculares.

Apesar de seu notável sucesso clínico, a terapia gênica baseada em AAV enfrenta vários desafios intrínsecos que continuam a limitar sua aplicação mais ampla. Uma das principais limitações está na capacidade limitada de embalagem do genoma do capsídeo AAV (~4,7 kb), que restringe seu uso para entregar genes terapêuticos grandes ou^{múltiplos 5,6}. Além disso, a biodistribuição e o tropismo celular dos vetores AAV são amplamente determinados por seus sorótipos, cada um exibindo afinidades distintas por tecidos específicos. Embora extensas estratégias de engenharia de cápsid e exibição de peptídeos tenham sido empregadas para melhorar a direcionamento tecidual e a eficiência da transdução, alcançar tropismos precisos e previsíveis em diversos contextos biológicos continua sendo um obstáculo^{significativo 7}. Outra limitação crítica é a prevalência de anticorpos neutralizantes (NAbs) pré-existentes contra sorótipos naturais de AAV na população humana. Mesmo títulos baixos de NAbs podem reduzir substancialmente a eficiência da transdução vetorial, limitando a elegibilidade do paciente e complicando a dosagem^{repetida 8,9}. Diversas estratégias, como redesenho racional da capside, regimes imunossupressores e troca plasmática transitória, foram exploradas para mitigar a neutralização mediada por^{anticorpos 10,11}, mas essas abordagens oferecem apenas alívio parcial ou transitório. Coletivamente, essas limitações reduzem a eficácia terapêutica geral e a reprodutibilidade da entrega gênica mediada pelo VA em ambientes clínicos.

Nos últimos anos, o AAV envolvido por vesícula extracelular (EV-AAV) tem sido explorado como um vetor alternativo com potencial para superar várias limitações importantes dos AAVs^{convencionais} 12,13,14,15. Durante o empacotamento vetorial, uma parte das partículas de AAV pode ser secretada por vias de tráfego vesicular e ficar envolvida em vesículas extracelulares. Acredita-se que esse processo envolva a proteína acessória associada à membrana (MAAP) codificada por AAV, que facilita a saída viral e promove a associação com^{membranas 16,17}. As partículas resultantes de EV-AAV apresentam eficiência de transdução aprimorada e resistência aumentada a anticorpos neutralizantes em comparação com o AAV convencional, principalmente devido à membrana vesicular que promove a absorção celular e fornece proteção parcial contra o reconhecimento de^{anticorpos 18}. No entanto, apesar dessas vantagens, a produção de EV-AAV continua ineficiente. Tipicamente, apenas uma pequena fração dos genomas vetores (aproximadamente 0,5%-12%) é secretada no meio de cultivo como AAVs associados a EV, enquanto a maioria permanece intracelular ou existe como AAVs livres^12,13. Consequentemente, é necessária produção em larga escala para obter rendimento vetorial suficiente. Além disso, a geração de EV-AAV tem sido demonstrada principalmente usando células produtoras HEK293T, cujos EVs podem apresentar rápida depuração hepática, meia-vida de circulação curta e potenciais preocupações com a biossegurança. Essas limitações destacam a necessidade de uma estratégia de envolvimento de membrana mais eficiente e personalizável, motivando o desenvolvimento da plataforma AAV envolvida por membrana celular (CME-AAV) apresentada neste estudo.

As células-tronco mesenquimatosas (MSCs) e seus EVs foram amplamente estudados por seu potencial regenerativo e propriedades imunoevasivas. Além das terapias baseadas em células ou VEs naturalmente secretados, estudos recentes demonstraram uma abordagem alternativa para melhorar a entrega de medicamentos usando nanopartículas revestidas com membranas^MSC 19,20,21. O revestimento de membrana MSC confere capacidade ativa de direcionamento, reduz a eliminação imune e prolonga o tempo de circulação, efeitos provavelmente atribuídos à composição molecular intrínseca das membranas derivadas de^{MSC 22,23}. Com base nesse conceito, utilizamos material de membrana derivado do MSC para construir uma nanovesícula de AVA envolvida em membrana celular (CME-AAV) para entrega de genes. Para isso, fragmentos purificados de membrana MSC foram misturados com partículas recombinantes de AAV e submetidos a um processo de extrusão controlada, uma técnica originalmente estabelecida para a fabricação de^{lipossomos 24,25}. Por meio da extrusão definida por tamanho, os componentes da membrana se montam espontaneamente em vesículas em nanoescala que encapsulam partículas de AAV. Os CME-AAVs resultantes foram ainda mais purificados de AAVs livres e não encapsulados usando centrifugação baseada em gradiente de densidade. Essa estratégia permite a preparação eficiente e reprodutível de vetores AAV envolvidos por membrana, que apresentam eficiência de transdução marcadamente aprimorada em comparação com os AAVs convencionais e mantêm resistência comparável a anticorpos neutralizantes como os EV-AAVs. Ao substituir diferentes transgenes, a plataforma CME-AAV possui amplo potencial para o tratamento de diversas doenças genéticas e adquiridas.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo comitê institucional de cuidado e uso animal da Universidade Normal de Pequim, em Zhuhai, China. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação e formação do CME-AAV por extrusão definida pelo tamanho dos poros

1. Produção de vetores AAV recombinantes
   NOTA: O protocolo de produção do AAV segue procedimentos previamente publicados e amplamente utilizados. Etapas detalhadas de otimização e variações foram descritas em estudos^{anteriores 12,26}.
   1. Cultive HEK293T células em meio de crescimento completo e mantenha-as em confluência de 70%-80% no dia da transfecção.
   2. Prepare três plasmídeos codificando (i) o vetor de transferência AAV que transporta o transgene de interesse, (ii) os genes rep/cap AAV correspondentes ao sorotipo desejado, e (iii) funções auxiliares adenovirais.
   3. Co-transfecção HEK293T células com os três plasmídeos usando um método de transfecção estabelecido (por exemplo, fosfato de cálcio ou transfecção à base de polímero), seguindo a prática padrão de laboratório.
   4. Incubar as células transfectadas por 48-72 horas para permitir a montagem e acúmulo do AAV.
   5. Colete células e cultive o meio, e libere partículas de AAV por ciclos repetidos de congelamento-descongelamento ou um método equivalente de lise celular.
   6. Centrifuge o lisado em baixa velocidade para remover detritos celulares e coletar o sobrenadante contendo partículas AAV.
   7. Purificar partículas de AAV usando ultracentrifugação por gradiente de densidade ou outra abordagem de purificação já estabelecida.
   8. Troque vetores AAV purificados por soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) e armazene as alíquotas a −80 °C até o uso.
2. Preparação da fração de membrana da MSC
   NOTA: Células-tronco mesenquimatosas humanas (MSCs) foram isoladas em conformidade com as diretrizes institucionais. As células foram cultivadas e expandidas sob condições estabelecidas ou protocolos modificados em laboratório. A identidade da MSC pode ser confirmada avaliando a expressão de marcadores fenotípicos como CD73, CD90 e CD105 usando citometria de fluxo. A multipotência das MSCs é verificada por sua capacidade de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos e adipócitos in vitro. As células estão prontas para coleta quando atingem 70%-90% de confluência. Os procedimentos a seguir não são necessariamente obrigatórios a serem realizados em condições estéreis.
   1. Remova o meio de cultura e desconecte os MSCs do prato de cultura usando um raspador de células.
   2. Colete as células destacadas em um tubo cônico contendo PBS e centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C para pelletar as células.
   3. Lave as células duas vezes com PBS, centrifugando cada vez a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
   4. Ressuspenda o último pellet celular em PBS suplementado com um coquetel inibidor de protease.
   5. Submeter a suspensão celular a três ciclos de congelamento-descongelamento para romper a membrana plasmática e gerar um lisado celular rudimentar.
   6. Pipete o lisado cuidadosamente para homogeneizar, depois centrifuge a 1.000 × g por 20 minutos a 4 °C para remover detritos celulares.
   7. Transfira o sobrenadante para um novo tubo e centrifuge a 18.000 × g por 1 hora a 4 °C para pelletar a fração de membrana.
   8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet de membrana resultante em PBS. Essa suspensão representa a fração bruta de membrana MSC e será usada para encapsulamento de AAV.
   9. Homogeneize a suspensão de membrana passando-a sequencialmente por seringas equipadas com agulhas de 20 G a 27 G.
   10. Determine a concentração de proteína da suspensão de membrana homogeneizada usando um ensaio BCA. Aliquota e armazene a suspensão a −80 °C, ou prossiga diretamente para as etapas seguintes. Rehomogeneize a suspensão de membrana usando uma seringa de 27 G após cada ciclo de descongelamento.
3. Formação do CME-AAV por extrusão
   1. Misture a suspensão de membrana preparada com AAVs em uma proporção definida de 150 μg de proteína de membrana por 1 × 10 cópias genômicas (g.c.) de AAV. Incube a mistura a 37 °C por 30 minutos com uma sacudida suave.
   2. Carregue a mistura membrana-AAV em um mini-extrusor equipado com uma membrana de policarbonato (PC) de 400 nm. Passe a amostra pelo extrusor 20 vezes para promover o encapsulamento membrana-AAV.
   3. Substitua a membrana PC de 400 nm por uma de 200 nm e repita o processo de extrusão 20 vezes para reduzir ainda mais a heterogeneidade do tamanho das vesículas.
   4. Recolha a mistura processada. Se for necessária uma quantidade maior, agrupe vários lotes de extrusão. A suspensão resultante contém CME-AAVs, juntamente com AAVs não encapsulados e vesículas de membrana vazias. Prossiga imediatamente para a purificação CME-AAV.

2. Purificação da CME-AAV por centrifugação por gradiente de densidade

NOTA: Esta etapa descreve a separação de CME-AAV puro de AAVs não encapsulados, agregados proteicos e ácidos nucleicos residuais usando ultracentrifugação de gradiente de densidade à base de iodixanol. O CME-AAV purificado obtido nesta etapa é adequado tanto para estudos in vitro quanto in vivo . Todos os procedimentos são recomendados sob uma capa de cultura de tecido estéril.

1. Preparação do gradiente de iodixanol
   1. Prepare soluções de iodixanol de 40% e 25% diluindo a solução original com 10× PBS e água desionizada estéril para alcançar uma concentração final em 1× PBS.
   2. Em um tubo ultratransparente de parede fina aberta com topo aberto, estabeleça cuidadosamente um gradiente de densidade descontínuo ao colocar 1 mL de iodixanol a 40% e 3 mL de iodixanol a partir de baixo.
   3. Sobreposição suave de 7 mL da suspensão contendo CME-AAV obtida a partir do passo 1.14 sobre o topo da inclinação. Equilibre os tubos e coloque-os em um rotor de ultracentrífuga com balde oscilante.
2. Ultracentrifugação e coleta de frações CME-AAV
   1. Centrifuge o gradiente a 150.000 × g por 3 horas a 4 °C usando aceleração rápida e desaceleração lenta (nível 9 e nível 1, respectivamente).
   2. Remova cuidadosamente os tubos do rotor sem perturbar o gradiente. Colete frações de 1 mL do topo para o fundo do tubo em tubos microcentrífugas de 1,5 mL marcados (F1-F11). Mantenha todas as frações no gelo.
   3. Identificar e agrupar frações F7 e F8, que contêm os CME-AAVs purificados, em um novo tubo de ultracentrífuga aberto. Adicione PBS a um volume total de 11 mL e misture suavemente com uma pipeta de 1 mL.
3. Lavagem e recuperação da CME-AAV
   1. Centrifuge novamente as frações acumuladas a 150.000 × g por 3 horas a 4 °C usando aceleração rápida e desaceleração rápida (nível 9 para ambas as configurações).
   2. Descarte cuidadosamente o sobrenadante e resuspenda o pellet CME-AAV em 50-200 μL de PBS estéril, dependendo da concentração desejada.
   3. Aliquota conforme necessário e armazenado a −80 °C até uso adicional.

3. Caracterização do CME-AAV usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

NOTA: A microscopia eletrônica de transmissão (MET) é usada para visualizar a morfologia, o tamanho e a estrutura da membrana das partículas CME-AAV. O procedimento segue um protocolo padrão de coloração negativa semelhante ao usado para vesículas extracelulares. Todos os passos são realizados em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

1. Preparação e fixação da amostra
   1. Dilua a suspensão purificada de CME-AAV obtida a partir da etapa 2 para uma concentração de aproximadamente 1 ×^{10 9-1} × 10^{partículas de 10} mL/PBS.
   2. Fixe a amostra adicionando um volume igual de paraformaldeído recém-preparado a 4% (concentração final 2%) e incubando por 30 minutos em temperatura ambiente.
   3. Coloque uma grade de cobre revestida com Formvar/carbono (200-mesh) sobre uma folha de filme de parafina, com o lado carbono para cima.
   4. Pipete 10 μL da suspensão fixa CME-AAV na grade e permita a adsorção por 30 minutos em temperatura ambiente. Evite secar durante a adsorção.
   5. Remova suavemente o excesso de líquido da borda da grade usando papel de filtro sem tocar no centro.
2. Lavagem e pós-fixação
   1. Flutue a grade, lado da amostra para baixo, em uma queda de 50 μL de PBS por 2 minutos para lavar. Repita duas vezes.
   2. Transfira a grade para uma queda de 50 μL de glutaraldeído de 1% por 5 minutos para estabilizar a estrutura da membrana.
   3. Lave sequencialmente a grade 5 vezes com gotas de água deionizada (30 s cada) para remover sais tampão. Apague suavemente após a lavagem final.
3. Coloração negativa
   1. Coloque a grade sobre uma gota de 50 μL de acetato de uranil aquoso a 2% por 1 minuto para obter a coloração negativa.
   2. Remova o excesso de mancha tocando suavemente a borda da grade com papel de filtro e deixe secar completamente ao ar em temperatura ambiente.
4. Imagem
   1. Examine as grades coradas usando um microscópio eletrônico de transmissão operado a 200 kV.
   2. Capture imagens representativas em ampliações entre 30.000× e 120.000× para avaliar a morfologia CME-AAV e a integridade da membrana.
   3. Opcionalmente, meça diâmetros de partículas usando software de análise de imagem TEM para confirmar a consistência do tamanho das vesículas com os resultados do NTA.
      NOTA: Concentração da amostra - Ajuste a concentração de CME-AAV para obter densidade moderada de partículas; Amostras excessivamente concentradas levam à sobreposição de partículas, enquanto amostras excessivamente diluídas produzem poucas vesículas detectáveis. Evitar artefatos - Lavagem incompleta pode deixar cristais de sal que dificultam a visualização das partículas. Certifique-se de que as grades permaneçam hidratadas durante toda a coloração para evitar o colapso da membrana. Colorações alternativas - Ácido fosfotungstico (PTA, 1%-2%, pH 7,0) pode ser usado como alternativa ao acetato de uranila se aplicarem restrições de manuseio radioativo. Armazenamento - Grades preparadas podem ser armazenadas em um recipiente livre de poeira em temperatura ambiente por vários dias antes da imagem, embora a observação imediata seja recomendada para melhor contraste.

4. Quantificação da CME-AAV usando qPCR

NOTA: Esta etapa descreve um método baseado em qPCR para quantificar cópias do genoma CME-AAV (g.c./μL). O protocolo enfatiza a preparação de amostras específicas para CME-AAV e o relato de dados. Todos os outros aspectos da configuração e ciclagem da qPCR devem seguir a prática padrão de laboratório e as instruções do fabricante para o kit de qPCR selecionado.

1. Preparação de amostra e padrão
   1. Descongele alíquotas de CME-AAV purificado em gelo e misture suavemente pipetando. Evite o vórtice.
   2. Prepare as diluições padrão AAV de 1 × 10⁶ a 1 × 10³ g.c./μL por diluições sequenciais de 10 vezes usando água desionizada livre de nuclease ou tampão TE. Prepare standards fresco ou aliquota e armazene a −20 °C para uso de curto prazo.
   3. Prepare os seguintes controles: um controle sem molde (NTC; água), um controle negativo (PBS ou matriz em branco) e um controle positivo (amostra de AAV com concentração conhecida), se disponível.
   4. Prepare a mistura mestre qPCR em gelo de acordo com as instruções do fabricante para a química escolhida (à base de corante ou sonda).
2. Ciclo de qPCR e análise de dados
   1. Execute a qPCR usando os parâmetros de ciclo recomendados pelo fabricante da mistura master da qPCR.
   2. Gerar uma curva padrão plotando C_t (eixo y) versus_{log 10} (concentração padrão em g.c./μL) (eixo x). Ajuste-se uma regressão linear para obter inclinação (m) e interseção y (b).
   3. Calcule a concentração do genoma CME-AAV para cada replicação amostrada usando a equação de regressão:
      ou
      
      onde C são cópias do genoma por μL.
   4. A média técnica replica e reporta a concentração final de CME-AAV como g.c./μL.
      NOTA: Como a desnaturalização térmica durante a preparação da qPCR perturba tanto a membrana envolvente quanto os capsídeos AAV, não é necessária extração separada de DNA. Não realize tratamento com DNase em amostras antes da lise térmica; A DNase pode acessar e degradar os genomas do AAV uma vez que as capsidas/membranas são perturbadas, mas antes que a amostra atinja temperaturas que inativem a DNase. Os padrões devem ser correspondidos sempre que possível: prepare uma curva padrão a partir de um padrão AAV bem caracterizado. Se suas amostras ou padrões diferem na configuração do genoma (AAV de fita simples vs AAV auto-complementar/de fita dupla), ajuste os valores reportados de acordo. Projeto de espolvo/sonda: os espolvadores podem atingir qualquer sequência de AAV conservada; por exemplo, primers direcionados ao promotor CMV (a montante do transgene) são comumente usados.

5. Quantificação dos perfis de partículas CME-AAV

1. Use análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), sensoramento de pulso resistivo sintonizável (TRPS) ou técnicas comparáveis de análise de partículas para determinar a distribuição de tamanho e a concentração de partículas das preparações CME-AAV.
2. Descongelação amostras purificadas de CME-AAV em gelo e homogeneizam suavemente por pipeteamento antes da análise. Realize medições seguindo a prática padrão de laboratório e as instruções do fabricante para o instrumento selecionado, conforme descrito nos protocolos^{publicados anteriormente 12, 27, 28 e 29}.

6. Análise in vitro da transferência gênica mediada por CME-AAV

NOTA: Esta etapa descreve o procedimento para avaliar a entrega gênica mediada por CME-AAV e a expressão de transgenes em células cultivadas. O ensaio é demonstrado usando células HEK293T e CME-AAV9. EGFP, mas pode ser adaptado a outros tipos celulares ou construções repórteres. AAV9 convencional (não envolvido por membrana). O EGFP serve como controle positivo, enquanto PBS ou partículas vazias de AAV são usadas como controles negativos.

1. Preparação celular
   1. Cultivar HEK293T células sob condições padrão (DMEM com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina) a 37 °C em 5% de CO₂.
   2. As células de semente se formam em placas de 48 ou 96 poços para atingir aproximadamente 70% de confluência no momento da transdução (tipicamente 24 horas após a semeadura). Ajuste a densidade de semeadura de acordo com o tamanho do poço (por exemplo, ~5 × células 10⁴/poço para placas de 48 poços ou ~1 × células de 10⁴ por poço para placas de 96 poços).
   3. Permita que as células se conectem e se equilibrem por 24 horas antes de adicionar vetores.
2. Aplicação vetorial
   1. Prepare CME-AAV9. EGFP e AAV9. Soluções de trabalho EGFP em PBS estéril. Dose viral típica: 5 × 10⁸ g.c. por 48 poços (ajuste baseado na força do promotor, gene-alvo e objetivos experimentais).
   2. Para cada poço, adicione cópias iguais do genoma (g.c.) do CME-AAV9. EGFP ou AAV9. EGFP diretamente para o meio de cultura.
   3. Inclua poços de controle negativos com volume equivalente de PBS ou partículas vazias de AAV.
   4. Gire suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme e retorne à incubadora.
   5. Continue a incubação por 24 a 72 horas, dependendo da atividade do promotor e da cinética de expressão do transgene. Para EGFP impulsionado por CMV em células HEK293T, a fluorescência forte é tipicamente observada em 48 horas.
3. Imagem e análise de células vivas
   1. Quando estiver pronto para a imagem, aspire suavemente o meio de cultura e lave as células duas vezes com PBS para remover partículas não ligadas. Evite desalojar células.
   2. Núcleos de células de stain com Hoechst 33342 (compatível com célula viva) seguindo as instruções do fabricante. Não use DAPI para células vivas.
   3. Realizar imagens de fluorescência de células vivas usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com filtros apropriados (por exemplo, excitação 488 nm/emissão 513 nm para EGFP; excitação 350 nm/emissão 460 nm para Hoechst).
   4. Use objetivos de 10× ou 20× para quantificar a eficiência da transdução e 63× objetivo para localização subcelular de alta resolução, se necessário.
   5. Adquira pelo menos cinco campos de visão por poço (por exemplo, quatro cantos e um centro) usando parâmetros de imagem idênticos (tempo de exposição, ganho, abertura, etc.).
   6. Salve todas as imagens em formatos raw e em tons de cinza para análise quantitativa.
4. Análise quantitativa de imagens
   1. Imagens abertas em ImageJ (FIJI) ou software equivalente.
   2. Meça a intensidade média de fluorescência tanto para os canais EGFP quanto Hoechst para cada campo.
   3. Determine a intensidade de fundo selecionando uma região sem sinal fluorescente e fazendo a média dos valores dos pixels.
   4. Calcule a intensidade corrigida para cada canal:
      Eu_corrigi =_{quero dizer} -_{I background}
   5. Calcule a intensidade normalizada para cada campo como:
      
   6. Intensidades médias normalizadas em pelo menos cinco campos por poço, e relatam a média ± SD em três réplicas biológicas independentes.
      NOTA: O CME-AAV normalmente demonstra intensidade de fluorescência aumentada em relação ao AAV convencional quando cópias iguais do genoma são aplicadas, refletindo melhor absorção celular e/ou proteção contra anticorpos neutralizantes. A eficiência ótima da transdução depende da qualidade da preparação da CME-AAV, tipo celular, força do promotor e título viral. Se sinais fracos forem observados, aumente a entrada de cópias do genoma, confirme a integridade do vetor por qPCR e verifique a calibração do microscópio. Outros repórteres fluorescentes (por exemplo, mCherry, mNeonGreen, tdTomato) ou construtos de luciferase podem ser usados, dependendo das necessidades experimentais. Ao trabalhar com células primárias ou não aderentes, ajuste as condições de semeadura e imagem de acordo (por exemplo, revestindo placas com poli-L-lisina ou usando lâminas de câmara).

7. Avaliação da entrega gênica mediada por CME-AAV em um modelo murino

NOTA: Esta etapa descreve a avaliação da entrega gênica mediada por CME-AAV in vivo usando um modelo murino.

1. Preparação animal
   1. Use camundongos do tipo selvagem como o C57BL/6. Garantir que todos os procedimentos com animais sejam aprovados pelo comitê institucional de cuidado e uso animal e realizados de acordo com as regulamentações relevantes.
   2. Selecione camundongos de 4 a 6 semanas para obter consistência ótima entre os experimentos.
   3. Mantenha os animais sob condições padrão de moradia, com acesso ad libitum a comida e água antes da injeção.
2. Preparação e administração de vetores
   1. Selecione um sorotipo de AAV de acordo com o propósito do estudo e o tecido-alvo. Neste estudo, são utilizados AAV9 e CME-AAV9.
   2. Prepare vetores virais codificando um gene repórter da luciferase (por exemplo, CME-AAV9.luciferase) para imagens não invasivas.
   3. Dilua os vetores virais em soro estéril até uma concentração final de 1 × cópias genômicas de 10¹° (g.c.) por 50 μL para cada camundongo.
   4. Aqueça a cauda suavemente usando uma almofada térmica ou água morna para dilatar a veia antes da injeção.
   5. Coloque 50 μL de suspensão viral em uma seringa de insulina 31-G e injete lentamente na veia lateral da cauda para minimizar vazamentos e ruptura da veia.
   6. Após a injeção, devolve os camundongos às gaiolas e monitore-os até que estejam totalmente recuperados.
3. Imagem bioluminescência in vivo
   1. Duas semanas após a administração, anestesiar os camundongos com isoflurano (de acordo com protocolos institucionalmente aprovados) e injetar D-luciferina (150 μg/g de peso corporal; Sigma) intraperitonealmente no PBS.
   2. Coloque os camundongos anestesiados em um sistema de imagem por bioluminescência.
   3. Adquira imagens de luminescência a cada 2 minutos após a injeção até que o sinal atinja um platô.
   4. Quantifique a bioluminescência usando o software adequado. Defina regiões de interesse (ROIs) ao redor das áreas luminescentes e calcule o fluxo total de fótons (fótons/s) para cada animal.
   5. Inclua grupos tratados com AAV9.luc e injetados com PBS como controles positivo e negativo, respectivamente, para comparação.
4. Imagem ex vivo
   NOTA: Esta etapa é opcional.
   1. Imediatamente após a imagem in vivo , eutanasie os camundongos e colete órgãos principais (fígado, coração, baço, rim e cérebro).
   2. Imageie os órgãos isolados sob parâmetros de imagem idênticos usando o mesmo sistema IVIS para determinar a expressão específica de luciferase em tecido.
      NOTA: Rotas alternativas de administração (por exemplo, injeção intramuscular, intracerebral ou intraperitoneal) podem ser adotadas, dependendo dos objetivos experimentais. A intensidade da bioluminescência reflete tanto a eficiência da entrega gênica quanto a biodistribuição tecidual. A expressão de luciferase mediada por CME-AAV tipicamente apresenta início precoce e aumento da expressão máxima em comparação com o AAV livre devido à endocitose mediada por membrana por células que absorvem a célula. Garanta a dose, o tempo e as configurações de imagem de luciferina consistentes entre as amostras para uma comparação precisa. A dose viral descrita (1 × 10¹° g.c. por camundongo) normalmente fornece um sinal detectável de 2 a 4 semanas após a injeção, mas pode ser necessária otimização para diferentes vetores ou modelos animais.

Resultados

As MSCs utilizadas neste estudo foram isoladas do tecido do cordão umbilical humano sob protocolos, de acordo com as diretrizes éticas relevantes. Frações de membrana de MSC foram preparadas de acordo com o protocolo descrito. AAV9. O EGFP foi produzido internamente usando um sistema transitório de transfecção de dois plasmídeos em HEK293T células, conforme relatado^{anteriormente 12,26}. Para fabricação de CME-AAV, preparações de m...

Discussão

Etapas críticas do protocolo CME-AAV

Esse protocolo descreve um método para gerar AAVs envolvidos em membrana da MSC, e várias etapas são críticas para a formação bem-sucedida de CME-AAV. Primeiro, um pré-processamento cuidadoso da membrana celular é essencial. O objetivo dessa etapa é obter fragmentos de membrana adequados para extrusão enquanto minimiza a contaminação por DNA nuclear, proteínas citosólicas e organelas subcelulares. Além diss...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bioluminescence imaging system	PerkinElmer	IVIS Spectrum optical imaging system (Lumina III)
D-Luciferin potassium salt	Yeasen Biotechnology	40902ES03
Fetal bovine serum	Yeasen Biotechnology	40130ES76
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Observer 7
Formvar/carbon-coated copper grid 200 mesh	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
Glutaraldehyde	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
High-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium	Hyclone	SH30243
High-speed centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
NTA instrument	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Open-top thinwall ultra-clear tube for ultracentrifuge	Beckman Coulter	344059
OptiPrep iodixanol	Millipore-Sigma	D1556
Paraformaldehyde 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
Penicillin-streptomycin	Millipore-Sigma	V900929
qPCR instrument	Applied Biosystems	QS6 real-time PCR system
Rotor for high-speed centrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SW 41 Ti Swing-bucket rotor for ultracentrifuge	Beckman Coulter	331362
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-2100F
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XE-100
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Whatman Nuclepore polycarbonate membranes filters (200 nm)	Cytiva	10417004
Whatman Nuclepore polycarbonate membranes filters (400 nm)	Cytiva	10417104