Relação Causal Entre Acidente Vascular Cerebral Isquêmico e Demência Vascular: Um Estudo de Randomização Mendeliana

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho reprodutível de randomização mendeliana de duas amostras para avaliar a possível associação causal entre acidente vascular cerebral isquêmico e demência vascular, utilizando estatísticas sumárias de estudos de associação genômica ampla disponíveis publicamente.

Resumo

O acidente vascular cerebral isquêmico (AVCi) é uma das principais causas de incapacidade e mortalidade em todo o mundo, e a demência vascular (DVa) é um subtipo comum de demência associado a lesões cerebrovasculares. Estudos observacionais sugeriram uma relação entre AVCi e DVa, mas esses estudos são suscetíveis a confusão e causalidade reversa. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho reprodutível de randomização mendeliana (RM) de duas amostras para avaliar a possível associação causal entre AVCi e DVa, utilizando estatísticas sumárias de estudos de associação genômica ampla (GWAS) de acesso público. Os instrumentos genéticos associados ao AVCi foram extraídos de um conjunto de dados GWAS público, e as associações de desfecho para DVa foram obtidas de um conjunto de dados GWAS público sobre DVa. Os IDs correspondentes dos conjuntos de dados são fornecidos na seção Protocolo. Após o pareamento dos desfechos e a harmonização de alelos, 51 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram mantidos para a análise final de RM. O fluxo de trabalho inclui seleção de variáveis instrumentais, agrupamento por desequilíbrio de ligação, harmonização de alelos, avaliação da força dos instrumentos, análise ponderada pela variância inversa (IVW), análise de mediana ponderada, análise RM-Egger, teste de heterogeneidade, avaliação de pleiotropia horizontal e análise de sensibilidade leave-one-out. Na análise representativa, o método IVW mostrou uma associação positiva entre o AVCi predito geneticamente e o risco de DVa, e o método de mediana ponderada produziu um resultado com concordância direcional. A estimativa RM-Egger foi direcionalmente consistente, mas não alcançou significância estatística. Portanto, esses achados devem ser interpretados como evidência sugestiva de um possível efeito causal, e não como prova definitiva de causalidade. Este protocolo pode ajudar pesquisadores a aplicar um fluxo de trabalho de RM transparente e reprodutível para investigar desfechos relacionados a doenças cerebrovasculares utilizando dados GWAS públicos.

Introdução

O acidente vascular cerebral isquêmico (AVC-I) é uma das principais causas de deficiência grave e morte em todo o mundo¹. De acordo com os dados mais recentes do Estudo Global de Carga de Doenças, a incidência global de AVC-I diminuiu, mas continua sendo um fardo significativo, especialmente na Europa Oriental, Ásia Oriental, Ásia Central e África Subsaariana^2,3. Além disso, a incidência de AVC-I está em aumento em países com um baixo Índice Sociodemográfico (SDI), e projeta-se que continue aumentando de 2020 a 2030.

Diversos estudos epidemiológicos sugeriram uma possível ligação entre doenças cerebrovasculares e demência vascular (DVC)^4,5. Especialmente na China, a DVC é um dos tipos mais comuns de demência entre idosos, e a alta prevalência de AVC isquêmico está estreitamente associada ao surgimento da DVC. No entanto, a maioria dos estudos existentes é observacional, e fatores de confusão residuais, causalidade reversa e diferenças na definição das doenças podem limitar a interpretação causal. Portanto, são necessárias abordagens analíticas adicionais para avaliar se o AVC isquêmico pode estar envolvido no desenvolvimento da DVC.

O AVC isquêmico pode influenciar o início da DA através de vários mecanismos. Os danos cerebrovasculares causados pelo AVC isquêmico podem levar à perfusão cerebral insuficiente e a alterações neurodegenerativas subsequentes⁶. Além disso, a DA pode estar relacionada a lesões cerebrovasculares crônicas, danos microvasculares e respostas inflamatórias após o AVC isquêmico^7,8. Portanto, investigar a relação entre AVC isquêmico e DA é importante para compreender possíveis vínculos entre as doenças e orientar estratégias futuras de prevenção.

A randomização mendeliana (MR) é um método analítico que utiliza variantes genéticas como variáveis instrumentais para avaliar possíveis associações causais entre uma exposição e um desfecho⁹. Em comparação com estudos observacionais convencionais, a MR pode reduzir a confusão e o viés de causalidade reversa sob suposições válidas de variáveis instrumentais. Em comparação com ensaios clínicos randomizados ou modelos experimentais, a MR pode utilizar estatísticas sumárias de estudos de associação do genoma inteiro (GWAS) já existentes para avaliar associações clinicamente relevantes quando estudos de intervenção direta são inviáveis, antiéticos ou difíceis de realizar. Estudos genéticos recentes que utilizam abordagens de randomização mendeliana investigaram a associação entre IS e VaD¹⁰. No entanto, descrições detalhadas em nível de protocolo sobre a seleção de instrumentos de exposição, extração de dados do desfecho, harmonização de alelos, avaliação da força do instrumento, teste de heterogeneidade, avaliação de pleiotropia e análises de sensibilidade permanecem essenciais para a implementação reprodutível.

Este protocolo é apropriado quando estão disponíveis estatísticas sumárias de GWAS de acesso público tanto para a exposição quanto para o desfecho de interesse, é possível selecionar instrumentos genéticos válidos para a exposição, e a questão de pesquisa visa avaliar uma associação causal potencial, em vez de estabelecer diretamente mecanismos biológicos. Este estudo apresenta, portanto, um protocolo de MR de duas amostras para avaliar a associação causal potencial entre AVC isquêmico (IS) e demência vascular (VaD), utilizando estatísticas sumárias de GWAS de acesso público. O objetivo é fornecer um fluxo de trabalho analítico reproduzível, e não estabelecer mecanismos biológicos definitivos. Este protocolo descreve a seleção de instrumentos genéticos, pareamento do desfecho, harmonização de alelos, estimativa de MR e análises de sensibilidade, utilizando a associação entre IS e VaD como exemplo representativo.

Protocolo

Este estudo utilizou estatísticas sumárias de GWAS disponíveis publicamente. Os estudos originais obtiveram aprovação do comitê de ética e consentimento informado dos participantes. Nenhuma aprovação ética adicional foi necessária para esta análise secundária.

1. Desenho do estudo e declaração de ética

1. Utilize um delineamento de MR com duas amostras para avaliar a possível associação causal entre IS e VaD.
2. Utilize apenas estatísticas sumarizadas de GWAS de acesso público. Como todos os estudos originais incluídos nos conjuntos de dados de GWAS obtiveram aprovação do comitê de ética e consentimento informado dos participantes, nenhuma aprovação ética adicional é necessária para esta análise secundária.
3. Defina IS como exposição e VaD como desfecho antes da extração dos dados.

2. Preparação do software

1. Realize todas as análises utilizando o software estatístico R.
2. Carregue o pacote TwoSampleMR para extração de instrumentos, extração de dados do desfecho, harmonização de alelos, estimativa de MR, teste de heterogeneidade e análises de sensibilidade. Carregue o pacote MRPRESSO para avaliar pleiotropia horizontal global e variantes discrepantes potenciais.
3. Utilize as seguintes funções principais no fluxo de trabalho: extract_instruments, extract_outcome_data, harmonise_data, mr, generate_odds_ratios, mr_heterogeneity, mr_pleiotropy_test, mr_singlesnp, mr_leaveoneout, mr_scatter_plot, mr_forest_plot, mr_funnel_plot e mr_leaveoneout_plot. Utilize MRPRESSO::mr_presso para realizar o teste global MR-PRESSO e, quando aplicável, os testes de discrepantes e distorção.

3. Seleção do conjunto de dados de exposição e triagem da variável instrumental

1. Extraia polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) associados ao ACV do conjunto de dados IEU OpenGWAS ebi-a-GCST90018864. Este conjunto de dados inclui 11.929 casos de ACV e 472.192 controles, com um tamanho total da amostra de 484.121 participantes.
2. Selecione SNPs candidatos associados ao ACV utilizando um limiar de significância de p < 5 × 10^-6.
   1. O limiar de p < 5 × 10^-6 é utilizado neste protocolo representativo para manter um número adequado de instrumentos independentes para análises de sensibilidade. Como este limiar é menos rigoroso do que o limiar convencional de significância no genoma inteiro, os achados baseados nesses instrumentos devem ser interpretados como exploratórios e sugestivos, e não definitivos.
3. Realize a eliminação por desequilíbrio de ligação para manter SNPs independentes. Utilize um limiar de r² igual a 0,001 e uma janela de eliminação de 10.000 kb.
4. Utilize o seguinte comando em R para extrair os instrumentos candidatos:
   extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE)
5. Calcule a estatística F para cada SNP mantido utilizando a fórmula F = (β/SE)², onde β e SE são, respectivamente, a estimativa do efeito do SNP–exposição e o erro padrão.
6. Exclua SNPs com estatística F < 10 para reduzir o risco de viés de instrumento fraco. Resuma a distribuição das estatísticas F utilizando o mínimo, máximo, mediana e amplitude interquartil (IQR).

4. Extração do conjunto de dados de resultado

1. Extraia as associações de desfecho para DAV do conjunto de dados FinnGen GWAS finn-b-F5_VASCDEM. Este conjunto de dados inclui 881 casos de DAV e 211.508 controles.
2. Extraia as associações de desfecho para todos os SNPs associados à AI previamente selecionados utilizando a função extract_outcome_data.
3. Busque SNPs substitutos quando os SNPs-alvo não estiverem diretamente disponíveis no conjunto de dados de desfecho. Mantenha as variantes correspondentes por proxy quando houver informação válida de proxy e correspondência de alelos.
4. Utilize o seguinte comando em R para extrair o conjunto de dados de desfecho:
   extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)

5. Harmonização de alelos e retenção de SNP

1. Harmonize os conjuntos de dados de exposição e desfecho antes da análise de MR.
2. Alinhe o alelo de efeito e o outro alelo de modo que as estimativas do efeito SNP–exposição e SNP–desfecho correspondam ao mesmo alelo de efeito.
3. Examine os SNPs durante a harmonização para identificar incompatibilidades alélicas, associações de desfecho indisponíveis e alinhamento alélico ambíguo. Mantenha os SNPs com estimativas de efeito disponíveis para exposição e desfecho após a harmonização.
4. Utilize o seguinte comando em R para harmonização alélica: harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
5. Registre o número de SNPs inicialmente extraídos do conjunto de dados de exposição, o número de SNPs com associações de desfecho disponíveis, o número de variantes correspondentes por proxy e o número de SNPs mantidos para a análise final de MR.

6. Análise MR primária e análises de sensibilidade

1. Realize a análise primária de MR utilizando o método ponderado pela variância inversa (IVW).
2. Realize análises complementares de MR utilizando os métodos da mediana ponderada e MR-Egger para avaliar a consistência da estimativa causal sob diferentes premissas.
3. Gere razões de chances (ORs) e intervalos de confiança de 95% (ICs) a partir das estimativas de MR.
4. Utilize os seguintes comandos em R para executar a análise de MR e calcular as ORs:
   res <- mr(dat)
   res <- generate_odds_ratios(res)
5. Como uma associação exposição–desfecho primária pré-especificada é avaliada, defina o limiar corrigido por Bonferroni para a inferência primária de MR como 0,05/1 = 0,05. Utilize um valor de p bicaudal < 0,05 como limiar de significância estatística para a análise IVW primária.
6. Para contextualizar a precisão estatística da análise primária dadas as limitadas quantidades de casos de DaV, realize um cálculo pós-hoc de poder com o teste de Wald bicaudal com base na estimativa IVW observada e seu erro padrão. Calcule o poder utilizando o parâmetro de não-centralidade βIVW/SEIVW em um nível de α bicaudal de 0,05. Calcule o efeito mínimo detectável correspondente a um poder de 80% como exp[(z0,975 + z0,80) × SE]. Como o AVE é uma exposição binária e as associações SNP–exposição são expressas na escala log-odds, relate esta análise como uma avaliação descritiva condicionada ao efeito da precisão, e não como um cálculo pré-especificado de tamanho amostral¹¹.

7. Análise de heterogeneidade, pleiotropia horizontal e exclusão sequencial

1. Avalie a heterogeneidade entre SNPs utilizando a estatística Q de Cochran.
2. Use o seguinte comando em R para calcular as estatísticas de heterogeneidade:
   mr_heterogeneity(dat)
3. Avalie a pleiotropia horizontal direcional utilizando o teste do intercepto MR-Egger.
4. Use o seguinte comando em R para calcular o intercepto MR-Egger:
   mr_pleiotropy_test(dat)
5. Avalie a pleiotropia horizontal global e as variantes suspeitas de serem discrepantes utilizando o MR-PRESSO com 10.000 simulações, limiar de significância de 0,05 e os testes de discrepante e de distorção ativados¹².
6. Use o seguinte comando em R para a análise MR-PRESSO:
   set.seed(20260729)
   mr_presso(
   BetaOutcome = "beta.outcome",
   BetaExposure = "beta.exposure",
   SdOutcome = "se.outcome",
   SdExposure = "se.exposure",
   OUTLIERtest = TRUE,
   DISTORTIONtest = TRUE,
   data = dat,
   NbDistribution = 10000,
   SignifThreshold = 0.05
   )
7. Realize uma análise de SNP único para estimar o efeito de cada SNP separadamente.
8. Use o seguinte comando em R para a análise de SNP único:
   res_single <- mr_singlesnp(dat)
9. Realize uma análise leave-one-out removendo sequencialmente um SNP por vez e repetindo a análise IVW.
10. Use o seguinte comando em R para a análise leave-one-out:
    res_loo <- mr_leaveoneout(dat)

8. Visualização e saída

1. Gerar um gráfico de dispersão para mostrar as estimativas de RM obtidas por diferentes métodos.
2. Gerar um gráfico floresta para mostrar as estimativas individuais de SNP e a estimativa global de RM.
3. Gerar um gráfico em funil para avaliar visualmente a simetria das estimativas específicas de SNP.
4. Gerar um gráfico de exclusão única (leave-one-out) para avaliar se a estimativa global é influenciada por um único SNP.
5. Utilize os seguintes comandos em R para gerar os gráficos:
   mr_scatter_plot(res, dat)
   mr_forest_plot(res_single)
   mr_funnel_plot(res_single)
   mr_leaveoneout_plot(res_loo)
6. Exporte os resultados de RM, a tabela da variável instrumental, a tabela de associação do desfecho e as saídas da análise de sensibilidade para fins de relato e reprodutibilidade.

Resultados

Figura 1 resume o fluxo de trabalho geral do protocolo de randomização mendeliana de duas amostras, desde a seleção dos conjuntos de dados e triagem dos instrumentos até as análises de sensibilidade e a visualização dos resultados. As saídas representativas de cada etapa são apresentadas abaixo.

Variáveis instrumentais genéticas e controle de qualidade da harmonização

Um total de 52 SNPs associados à IS...

Discussão

Este estudo apresenta um protocolo de MR de duas amostras para avaliar a possível associação causal entre IS e VaD utilizando estatísticas resumidas de GWAS disponíveis publicamente. Na análise representativa, os métodos IVW e mediana ponderada apoiaram uma associação positiva entre IS predito geneticamente e risco de VaD, enquanto a estimativa MR-Egger foi direcionalmente consistente, mas não atingiu significância estatística. Portanto, esses achados fornecem evidências sugestivas de um possível efeito causal, em vez de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Conjunto de dados FinnGen GWAS	FinnGen	finn-b-F5_VASCDEM	Conjunto de dados GWAS público utilizado como fonte do desfecho para demência vascular
Banco de dados IEU OpenGWAS	Unidade de Epidemiologia Integrativa do MRC, Universidade de Bristol	ebi-a-GCST90018864	Conjunto de dados GWAS público utilizado como fonte da exposição para acidente vascular cerebral isquêmico
Software R	Fundação R para Computação Estatística	Não aplicável	Software estatístico utilizado para análise MR
RStudio	Posit Software, PBC	Não aplicável	Ambiente de desenvolvimento integrado utilizado para executar scripts em R
Pacote TwoSampleMR	Unidade de Epidemiologia Integrativa do MRC, Universidade de Bristol	Não aplicável	Pacote R utilizado para extração de instrumentos, harmonização, análise MR e análises de sensibilidade
Pacote MRPRESSO	CRAN	Versão 1.0	Pacote R utilizado para avaliar pleiotropia horizontal global e instrumentos potenciais outliers
Pacote writexl	CRAN	Não aplicável	Pacote R utilizado para exportar tabelas de resultados como arquivos xlsx