Este protocolo descreve um fluxo de trabalho reprodutível de randomização mendeliana de duas amostras para avaliar a possível associação causal entre acidente vascular cerebral isquêmico e demência vascular, utilizando estatísticas sumárias de estudos de associação genômica ampla disponíveis publicamente.
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Relação Causal Entre Acidente Vascular Cerebral Isquêmico e Demência Vascular: Um Estudo de Randomização Mendeliana
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11 de setembro de 2026
Neste artigo
Resumo
Resumo
O acidente vascular cerebral isquêmico (AVCi) é uma das principais causas de incapacidade e mortalidade em todo o mundo, e a demência vascular (DVa) é um subtipo comum de demência associado a lesões cerebrovasculares. Estudos observacionais sugeriram uma relação entre AVCi e DVa, mas esses estudos são suscetíveis a confusão e causalidade reversa. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho reprodutível de randomização mendeliana (RM) de duas amostras para avaliar a possível associação causal entre AVCi e DVa, utilizando estatísticas sumárias de estudos de associação genômica ampla (GWAS) de acesso público. Os instrumentos genéticos associados ao AVCi foram extraídos de um conjunto de dados GWAS público, e as associações de desfecho para DVa foram obtidas de um conjunto de dados GWAS público sobre DVa. Os IDs correspondentes dos conjuntos de dados são fornecidos na seção Protocolo. Após o pareamento dos desfechos e a harmonização de alelos, 51 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram mantidos para a análise final de RM. O fluxo de trabalho inclui seleção de variáveis instrumentais, agrupamento por desequilíbrio de ligação, harmonização de alelos, avaliação da força dos instrumentos, análise ponderada pela variância inversa (IVW), análise de mediana ponderada, análise RM-Egger, teste de heterogeneidade, avaliação de pleiotropia horizontal e análise de sensibilidade leave-one-out. Na análise representativa, o método IVW mostrou uma associação positiva entre o AVCi predito geneticamente e o risco de DVa, e o método de mediana ponderada produziu um resultado com concordância direcional. A estimativa RM-Egger foi direcionalmente consistente, mas não alcançou significância estatística. Portanto, esses achados devem ser interpretados como evidência sugestiva de um possível efeito causal, e não como prova definitiva de causalidade. Este protocolo pode ajudar pesquisadores a aplicar um fluxo de trabalho de RM transparente e reprodutível para investigar desfechos relacionados a doenças cerebrovasculares utilizando dados GWAS públicos.
Introdução
O acidente vascular cerebral isquêmico (AVC-I) é uma das principais causas de deficiência grave e morte em todo o mundo1. De acordo com os dados mais recentes do Estudo Global de Carga de Doenças, a incidência global de AVC-I diminuiu, mas continua sendo um fardo significativo, especialmente na Europa Oriental, Ásia Oriental, Ásia Central e África Subsaariana2,3. Além disso, a incidência de AVC-I está em aumento em países com um baixo Índice Sociodemográfico (SDI), e projeta-se que continue aumentando de 2020 a 2030.
Diversos estudos epidemiológicos sugeriram uma possível ligação entre doenças cerebrovasculares e demência vascular (DVC)4,5. Especialmente na China, a DVC é um dos tipos mais comuns de demência entre idosos, e a alta prevalência de AVC isquêmico está estreitamente associada ao surgimento da DVC. No entanto, a maioria dos estudos existentes é observacional, e fatores de confusão residuais, causalidade reversa e diferenças na definição das doenças podem limitar a interpretação causal. Portanto, são necessárias abordagens analíticas adicionais para avaliar se o AVC isquêmico pode estar envolvido no desenvolvimento da DVC.
O AVC isquêmico pode influenciar o início da DA através de vários mecanismos. Os danos cerebrovasculares causados pelo AVC isquêmico podem levar à perfusão cerebral insuficiente e a alterações neurodegenerativas subsequentes6. Além disso, a DA pode estar relacionada a lesões cerebrovasculares crônicas, danos microvasculares e respostas inflamatórias após o AVC isquêmico7,8. Portanto, investigar a relação entre AVC isquêmico e DA é importante para compreender possíveis vínculos entre as doenças e orientar estratégias futuras de prevenção.
A randomização mendeliana (MR) é um método analítico que utiliza variantes genéticas como variáveis instrumentais para avaliar possíveis associações causais entre uma exposição e um desfecho9. Em comparação com estudos observacionais convencionais, a MR pode reduzir a confusão e o viés de causalidade reversa sob suposições válidas de variáveis instrumentais. Em comparação com ensaios clínicos randomizados ou modelos experimentais, a MR pode utilizar estatísticas sumárias de estudos de associação do genoma inteiro (GWAS) já existentes para avaliar associações clinicamente relevantes quando estudos de intervenção direta são inviáveis, antiéticos ou difíceis de realizar. Estudos genéticos recentes que utilizam abordagens de randomização mendeliana investigaram a associação entre IS e VaD10. No entanto, descrições detalhadas em nível de protocolo sobre a seleção de instrumentos de exposição, extração de dados do desfecho, harmonização de alelos, avaliação da força do instrumento, teste de heterogeneidade, avaliação de pleiotropia e análises de sensibilidade permanecem essenciais para a implementação reprodutível.
Este protocolo é apropriado quando estão disponíveis estatísticas sumárias de GWAS de acesso público tanto para a exposição quanto para o desfecho de interesse, é possível selecionar instrumentos genéticos válidos para a exposição, e a questão de pesquisa visa avaliar uma associação causal potencial, em vez de estabelecer diretamente mecanismos biológicos. Este estudo apresenta, portanto, um protocolo de MR de duas amostras para avaliar a associação causal potencial entre AVC isquêmico (IS) e demência vascular (VaD), utilizando estatísticas sumárias de GWAS de acesso público. O objetivo é fornecer um fluxo de trabalho analítico reproduzível, e não estabelecer mecanismos biológicos definitivos. Este protocolo descreve a seleção de instrumentos genéticos, pareamento do desfecho, harmonização de alelos, estimativa de MR e análises de sensibilidade, utilizando a associação entre IS e VaD como exemplo representativo.
Protocolo
Este estudo utilizou estatísticas sumárias de GWAS disponíveis publicamente. Os estudos originais obtiveram aprovação do comitê de ética e consentimento informado dos participantes. Nenhuma aprovação ética adicional foi necessária para esta análise secundária.
1. Desenho do estudo e declaração de ética
- Utilize um delineamento de MR com duas amostras para avaliar a possível associação causal entre IS e VaD.
- Utilize apenas estatísticas sumarizadas de GWAS de acesso público. Como todos os estudos originais incluídos nos conjuntos de dados de GWAS obtiveram aprovação do comitê de ética e consentimento informado dos participantes, nenhuma aprovação ética adicional é necessária para esta análise secundária.
- Defina IS como exposição e VaD como desfecho antes da extração dos dados.
2. Preparação do software
- Realize todas as análises utilizando o software estatístico R.
- Carregue o pacote TwoSampleMR para extração de instrumentos, extração de dados do desfecho, harmonização de alelos, estimativa de MR, teste de heterogeneidade e análises de sensibilidade. Carregue o pacote MRPRESSO para avaliar pleiotropia horizontal global e variantes discrepantes potenciais.
- Utilize as seguintes funções principais no fluxo de trabalho: extract_instruments, extract_outcome_data, harmonise_data, mr, generate_odds_ratios, mr_heterogeneity, mr_pleiotropy_test, mr_singlesnp, mr_leaveoneout, mr_scatter_plot, mr_forest_plot, mr_funnel_plot e mr_leaveoneout_plot. Utilize MRPRESSO::mr_presso para realizar o teste global MR-PRESSO e, quando aplicável, os testes de discrepantes e distorção.
3. Seleção do conjunto de dados de exposição e triagem da variável instrumental
- Extraia polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) associados ao ACV do conjunto de dados IEU OpenGWAS ebi-a-GCST90018864. Este conjunto de dados inclui 11.929 casos de ACV e 472.192 controles, com um tamanho total da amostra de 484.121 participantes.
- Selecione SNPs candidatos associados ao ACV utilizando um limiar de significância de p < 5 × 10-6.
- O limiar de p < 5 × 10-6 é utilizado neste protocolo representativo para manter um número adequado de instrumentos independentes para análises de sensibilidade. Como este limiar é menos rigoroso do que o limiar convencional de significância no genoma inteiro, os achados baseados nesses instrumentos devem ser interpretados como exploratórios e sugestivos, e não definitivos.
- Realize a eliminação por desequilíbrio de ligação para manter SNPs independentes. Utilize um limiar de r2 igual a 0,001 e uma janela de eliminação de 10.000 kb.
- Utilize o seguinte comando em R para extrair os instrumentos candidatos:
extract_instruments(outcomes = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE) - Calcule a estatística F para cada SNP mantido utilizando a fórmula F = (β/SE)2, onde β e SE são, respectivamente, a estimativa do efeito do SNP–exposição e o erro padrão.
- Exclua SNPs com estatística F < 10 para reduzir o risco de viés de instrumento fraco. Resuma a distribuição das estatísticas F utilizando o mínimo, máximo, mediana e amplitude interquartil (IQR).
4. Extração do conjunto de dados de resultado
- Extraia as associações de desfecho para DAV do conjunto de dados FinnGen GWAS finn-b-F5_VASCDEM. Este conjunto de dados inclui 881 casos de DAV e 211.508 controles.
- Extraia as associações de desfecho para todos os SNPs associados à AI previamente selecionados utilizando a função extract_outcome_data.
- Busque SNPs substitutos quando os SNPs-alvo não estiverem diretamente disponíveis no conjunto de dados de desfecho. Mantenha as variantes correspondentes por proxy quando houver informação válida de proxy e correspondência de alelos.
- Utilize o seguinte comando em R para extrair o conjunto de dados de desfecho:
extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)
5. Harmonização de alelos e retenção de SNP
- Harmonize os conjuntos de dados de exposição e desfecho antes da análise de MR.
- Alinhe o alelo de efeito e o outro alelo de modo que as estimativas do efeito SNP–exposição e SNP–desfecho correspondam ao mesmo alelo de efeito.
- Examine os SNPs durante a harmonização para identificar incompatibilidades alélicas, associações de desfecho indisponíveis e alinhamento alélico ambíguo. Mantenha os SNPs com estimativas de efeito disponíveis para exposição e desfecho após a harmonização.
- Utilize o seguinte comando em R para harmonização alélica: harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
- Registre o número de SNPs inicialmente extraídos do conjunto de dados de exposição, o número de SNPs com associações de desfecho disponíveis, o número de variantes correspondentes por proxy e o número de SNPs mantidos para a análise final de MR.
6. Análise MR primária e análises de sensibilidade
- Realize a análise primária de MR utilizando o método ponderado pela variância inversa (IVW).
- Realize análises complementares de MR utilizando os métodos da mediana ponderada e MR-Egger para avaliar a consistência da estimativa causal sob diferentes premissas.
- Gere razões de chances (ORs) e intervalos de confiança de 95% (ICs) a partir das estimativas de MR.
- Utilize os seguintes comandos em R para executar a análise de MR e calcular as ORs:
res <- mr(dat)
res <- generate_odds_ratios(res) - Como uma associação exposição–desfecho primária pré-especificada é avaliada, defina o limiar corrigido por Bonferroni para a inferência primária de MR como 0,05/1 = 0,05. Utilize um valor de p bicaudal < 0,05 como limiar de significância estatística para a análise IVW primária.
- Para contextualizar a precisão estatística da análise primária dadas as limitadas quantidades de casos de DaV, realize um cálculo pós-hoc de poder com o teste de Wald bicaudal com base na estimativa IVW observada e seu erro padrão. Calcule o poder utilizando o parâmetro de não-centralidade βIVW/SEIVW em um nível de α bicaudal de 0,05. Calcule o efeito mínimo detectável correspondente a um poder de 80% como exp[(z0,975 + z0,80) × SE]. Como o AVE é uma exposição binária e as associações SNP–exposição são expressas na escala log-odds, relate esta análise como uma avaliação descritiva condicionada ao efeito da precisão, e não como um cálculo pré-especificado de tamanho amostral11.
7. Análise de heterogeneidade, pleiotropia horizontal e exclusão sequencial
- Avalie a heterogeneidade entre SNPs utilizando a estatística Q de Cochran.
- Use o seguinte comando em R para calcular as estatísticas de heterogeneidade:
mr_heterogeneity(dat) - Avalie a pleiotropia horizontal direcional utilizando o teste do intercepto MR-Egger.
- Use o seguinte comando em R para calcular o intercepto MR-Egger:
mr_pleiotropy_test(dat) - Avalie a pleiotropia horizontal global e as variantes suspeitas de serem discrepantes utilizando o MR-PRESSO com 10.000 simulações, limiar de significância de 0,05 e os testes de discrepante e de distorção ativados12.
- Use o seguinte comando em R para a análise MR-PRESSO:
set.seed(20260729)
mr_presso(
BetaOutcome = "beta.outcome",
BetaExposure = "beta.exposure",
SdOutcome = "se.outcome",
SdExposure = "se.exposure",
OUTLIERtest = TRUE,
DISTORTIONtest = TRUE,
data = dat,
NbDistribution = 10000,
SignifThreshold = 0.05
) - Realize uma análise de SNP único para estimar o efeito de cada SNP separadamente.
- Use o seguinte comando em R para a análise de SNP único:
res_single <- mr_singlesnp(dat) - Realize uma análise leave-one-out removendo sequencialmente um SNP por vez e repetindo a análise IVW.
- Use o seguinte comando em R para a análise leave-one-out:
res_loo <- mr_leaveoneout(dat)
8. Visualização e saída
- Gerar um gráfico de dispersão para mostrar as estimativas de RM obtidas por diferentes métodos.
- Gerar um gráfico floresta para mostrar as estimativas individuais de SNP e a estimativa global de RM.
- Gerar um gráfico em funil para avaliar visualmente a simetria das estimativas específicas de SNP.
- Gerar um gráfico de exclusão única (leave-one-out) para avaliar se a estimativa global é influenciada por um único SNP.
- Utilize os seguintes comandos em R para gerar os gráficos:
mr_scatter_plot(res, dat)
mr_forest_plot(res_single)
mr_funnel_plot(res_single)
mr_leaveoneout_plot(res_loo) - Exporte os resultados de RM, a tabela da variável instrumental, a tabela de associação do desfecho e as saídas da análise de sensibilidade para fins de relato e reprodutibilidade.
Resultados
Figura 1 resume o fluxo de trabalho geral do protocolo de randomização mendeliana de duas amostras, desde a seleção dos conjuntos de dados e triagem dos instrumentos até as análises de sensibilidade e a visualização dos resultados. As saídas representativas de cada etapa são apresentadas abaixo.
Variáveis instrumentais genéticas e controle de qualidade da harmonização
Um total de 52 SNPs associados à IS foram inicialmente extraídos do conjunto de dados de GWAS da exposição utilizando um limiar de significância de p < 5 × 10-6. As associações do desfecho foram então extraídas do conjunto de dados de GWAS de DaV. Após o pareamento do desfecho, busca de SNPs substitutos e harmonização de alelos, 51 SNPs foram mantidos para a análise final de MR. Duas variantes foram pareadas utilizando SNPs substitutos. Os instrumentos genéticos mantidos estão listados na Tabela 1. Os valores de estatística F dos 51 instrumentos mantidos variaram de 20,91 a 46,06, com uma mediana de 25,08 e um IIQ de 22,95–30,71. Nenhum SNP mantido apresentou estatística F abaixo de 10, indicando baixa probabilidade de viés por instrumento fraco.
Estimativas de RM para AVC e Demência Vascular
O gráfico de dispersão mostrou a direção e a magnitude das estimativas específicas de SNP obtidas pelos diferentes métodos de MR (Figura 2). Os métodos IVW e mediana ponderada mostraram associações positivas, enquanto a estimativa MR-Egger foi consistente em direção, mas não atingiu significância estatística.
O gráfico floresta das estimativas individuais de SNP mostrou as associações específicas de SNP com o risco de DVC (Figura 3). As estimativas gerais de MR são resumidas na Figura 4. O método IVW mostrou uma associação positiva estatisticamente significativa entre IS predito geneticamente e risco de DVC (OR = 1,63, IC 95%: 1,21–2,21, p = 0,0013). O método da mediana ponderada produziu uma estimativa significativa concordante (OR = 1,60, IC 95%: 1,06–2,42, p = 0,0240). A estimativa MR-Egger foi direcionalmente consistente, mas não atingiu significância estatística (OR = 2,21, IC 95%: 0,97–5,01, p = 0,0645).
O estudo de associação genômica ampla (GWAS) do desfecho VaD do FinnGen incluiu 881 casos e 211.508 controles. Em um cálculo pós-hoc do teste de Wald bicaudal condicionado à estimativa observada de IVW, a potência estimada para a análise primária de IVW foi de 89,5% em α = 0,05. O efeito mínimo detectável correspondente para 80% de potência foi uma OR de 1,54. Em contraste, o efeito mínimo detectável para a análise MR-Egger foi uma OR de 3,23, o que excedeu a estimativa de MR-Egger observada com direção consistente (OR = 2,21). Portanto, o resultado não significativo de MR-Egger deve ser interpretado como reflexo da precisão limitada desse estimador de sensibilidade menos eficiente, e não, por si só, como evidência contrária à direção da estimativa primária de IVW.
Como uma única associação entre exposição e desfecho foi pré-especificada, o limiar corrigido por Bonferroni para a inferência principal de MR foi de 0,05/1 = 0,05. Portanto, o resultado da IVW atendeu ao limiar de significância corrigido. Em conjunto, esses achados fornecem evidências sugestivas de um possível efeito positivo da IS predita geneticamente sobre o risco de demência vascular, baseado principalmente na estimativa IVW e apoiado pela análise de sensibilidade por mediana ponderada. No entanto, a estimativa do MR-Egger foi consistente em direção, mas não alcançou significância estatística; portanto, os resultados não devem ser interpretados como evidência definitiva de causalidade.
Análises de heterogeneidade e pleiotropia horizontal
A heterogeneidade entre SNPs foi avaliada utilizando a estatística Q de Cochran. O teste de heterogeneidade IVW resultou em Q = 57,46 com 50 graus de liberdade (p = 0,218), e o teste de heterogeneidade MR-Egger resultou em Q = 56,77 com 49 graus de liberdade (p = 0,208). Esses resultados não indicaram heterogeneidade substancial entre as estimativas específicas para cada SNP. A pleiotropia horizontal direcional foi avaliada utilizando o teste do intercepto MR-Egger. O intercepto MR-Egger foi de -0,0195 (EP = 0,0253, p = 0,444), indicando ausência de evidência estatística de pleiotropia horizontal direcional. A análise MR-PRESSO foi realizada utilizando os 51 SNPs harmonizados mantidos e 10.000 simulações. O teste global MR-PRESSO não mostrou evidência de pleiotropia horizontal global (RSSobs = 59,61; p empírico = 0,2388). Como o teste global não foi estatisticamente significativo, os testes individuais de outlier e de distorção não foram aplicáveis, e nenhuma estimativa corrigida para outliers foi gerada. O gráfico em funnel forneceu uma avaliação visual da simetria das estimativas específicas para cada SNP (Figura 5). Os detalhes dos parâmetros e resultados do MR-PRESSO estão relatados na Tabela Suplementar 1.
Análise de sensibilidade leave-one-out e validação da saída do protocolo
Foi realizada uma análise leave-one-out para avaliar se a estimativa global de RM era influenciada por qualquer SNP individual. O gráfico leave-one-out mostrou que a remoção sequencial de SNPs individuais não alterou materialmente a estimativa global (Figura 6), sugerindo que nenhum único instrumento genético dominou a associação. Juntos, esses resultados representativos demonstram o resultado prático do fluxo de trabalho de RM de duas amostras descrito neste protocolo. Tabela 1 mostra os instrumentos genéticos mantidos após a seleção e harmonização dos SNPs. Figura 2 ilustra a direção das estimativas de RM entre os métodos, Figura 3 apresenta estimativas específicas para cada SNP, Figura 4 resume as estimativas globais de RM, Figura 5 auxilia na avaliação visual de pleiotropia ou assimetria, e Figura 6 avalia a influência de SNPs individuais. Tabela Suplementar 2 vincula cada etapa principal do protocolo à sua saída correspondente de validação.
Todas as estatísticas sumárias brutas de GWAS analisadas neste estudo estão disponíveis publicamente. O conjunto de dados de exposição ao acidente vascular cerebral isquêmico foi obtido a partir da base de dados IEU OpenGWAS sob o ID de conjunto ebi-a-GCST90018864. O conjunto de dados de resultado relativo à demência vascular foi obtido a partir do conjunto de dados FinnGen GWAS sob o ID de conjunto finn-b-F5_VASCDEM. A tabela de variáveis instrumentais extraída, o conjunto de dados analisado harmonizado, as tabelas de resultados de MR e os arquivos de saída relevantes são fornecidos como arquivos suplementares.
Figura 1. Fluxo de trabalho do protocolo de MR com duas amostras. Esta figura resume os principais passos do protocolo, incluindo seleção do conjunto de dados da exposição, triagem da variável instrumental, extração dos dados do desfecho, harmonização de alelos, estimativa de MR, teste de heterogeneidade, avaliação de pleiotropia horizontal, análise leave-one-out e visualização. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 2. Gráfico de dispersão das estimativas de RM para a associação entre IS e VaD. Cada ponto representa uma estimativa específica para SNP. As linhas ajustadas representam a associação estimada obtida utilizando diferentes métodos de RM. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 3. Gráfico em floresta das estimativas de MR individuais por SNP. Esta figura mostra as estimativas específicas para cada SNP da associação entre variantes genéticas associadas à IS e o risco de demência vascular. As linhas horizontais representam os intervalos de confiança de 95%. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4. Gráfico floresta das estimativas gerais de MR obtidas por diferentes métodos. Esta figura resume as estimativas gerais de MR obtidas pelos métodos IVW, mediana ponderada e MR-Egger. As linhas horizontais representam os intervalos de confiança de 95%. MR, randomização mendeliana; IVW, ponderado pela variância inversa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 5. Gráfico em funnel dos estimadores de MR específicos para SNP. Esta figura mostra a distribuição dos estimadores de MR específicos para SNP e permite a avaliação visual da simetria entre os instrumentos genéticos. MR, randomização mendeliana; IVW, ponderado pela variância inversa. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 6. Análise de sensibilidade leave-one-out. Esta figura mostra a estimativa de MR após a remoção sequencial de cada SNP. O gráfico foi utilizado para avaliar se a estimativa geral era influenciada por qualquer único instrumento genético. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.
| Nº | SNP | Gene | Chr. | EA | OA | EAF.IS | EAF.VD | IS β (EP) | VD β (EP) | estatística F | R² |
| 1 | rs10886430 | GRK5 | 10 | G | A | 0.118244 | 0.09536 | 0.1147 (0.0220) | -0.0172 (0.0852) | 27.18 | 5,61E-05 |
| 2 | rs10936572 | LOC107986051 | 3 | T | C | 0.179643 | 0.1235 | -0.0512 (0.0104) | 0.1444 (0.0743) | 24.24 | 5,01E-05 |
| 3 | rs11045239 | PDE3A | 12 | A | G | 0.492943 | 0.4629 | 0.0604 (0.0089) | 0.0303 (0.0494) | 46.06 | 9,51E-05 |
| 4 | rs11047532 | LOC105369698 | 12 | G | C | 0.305214 | 0.1513 | 0.0499 (0.0105) | 0.0159 (0.0689) | 22.59 | 4,66E-05 |
| 5 | rs11065836 | CUX2 | 12 | A | G | 0.159123 | 0.07442 | -0.0608 (0.0103) | 0.0245 (0.0929) | 34.84 | 7,20E-05 |
| 6 | rs11105378 | ATP2B1 | 12 | T | C | 0.203466 | 0.07522 | -0.0540 (0.0098) | -0.1174 (0.0916) | 30.36 | 6,27E-05 |
| 7 | rs117140252 | - | 14 | A | G | 0.041216 | 0.06988 | 0.1568 (0.0311) | 0.1498 (0.0967) | 25.42 | 5,25E-05 |
| 8 | rs117343276 | - | 10 | G | A | 0.030533 | 0.0431 | -0.0905 (0.0196) | -0.1449 (0.1233) | 21.32 | 4,40E-05 |
| 9 | rs11831940 | HDAC7 | 12 | A | G | 0.251914 | 0.3526 | 0.0631 (0.0130) | 0.1226 (0.0513) | 23.56 | 4,87E-05 |
| 10 | rs11880613 | DNM2 | 19 | A | G | 0.184857 | 0.1804 | -0.0613 (0.0110) | 0.1499 (0.0640) | 31.06 | 6,41E-05 |
| 11 | rs12445022 | LOC124903748 | 16 | A | G | 0.271667 | 0.3193 | 0.0605 (0.0112) | 0.0218 (0.0527) | 29.18 | 6,03E-05 |
| 12 | rs12509595 | - | 4 | C | T | 0.297929 | 0.3124 | 0.0577 (0.0091) | 0.1462 (0.0533) | 40.2 | 8,30E-05 |
| 13 | rs12633109 | - | 3 | T | G | 0.360897 | 0.3263 | 0.0436 (0.0089) | 0.0395 (0.0526) | 24 | 4,96E-05 |
| 14 | rs1275980 | KCNK3 | 2 | T | C | 0.498545 | 0.5481 | -0.0582 (0.0094) | -0.0128 (0.0495) | 38.33 | 7,92E-05 |
| 15 | rs13123551 | - | 4 | A | T | 0.616442 | 0.5065 | 0.0552 (0.0097) | 0.0818 (0.0493) | 32.38 | 6,69E-05 |
| 16 | rs147871383 | MIR99AHG | 21 | A | G | 0.02368 | 0.01925 | 0.2259 (0.0494) | 0.2534 (0.1903) | 20.91 | 4,32E-05 |
| 17 | rs16918175 | - | 10 | C | T | 0.104037 | 0.0811 | -0.0649 (0.0131) | 0.0332 (0.0895) | 24.54 | 5,07E-05 |
| 18 | rs17182166 | ACVR1 | 2 | T | G | 0.12494 | 0.137 | 0.0751 (0.0156) | -0.0046 (0.0703) | 23.18 | 4,79E-05 |
| 19 | rs1906779 | - | 15 | A | G | 0.211386 | 0.1239 | 0.0438 (0.0095) | -0.0342 (0.0758) | 21.26 | 4,39E-05 |
| 20 | rs1948696 | ITGB5 | 3 | C | T | 0.650138 | 0.6041 | -0.0459 (0.0091) | 0.0219 (0.0501) | 25.44 | 5,25E-05 |
| 21 | rs1973765 | LSP1 | 11 | C | T | 0.486717 | 0.4124 | 0.0441 (0.0092) | -0.0229 (0.0505) | 22.98 | 4,75E-05 |
| 22 | rs2429123 | CACNA1C, DCP1B | 12 | C | T | 0.729926 | 0.725 | 0.0473 (0.0098) | 0.0190 (0.0549) | 23.3 | 4,81E-05 |
| 23 | rs2447561 | - | 8 | T | A | 0.873442 | 0.8382 | -0.0589 (0.0116) | -0.0570 (0.0674) | 25.78 | 5,33E-05 |
| 24 | rs245015 | MSH3 | 5 | A | G | 0.685061 | 0.6562 | -0.0456 (0.0089) | 0.0065 (0.0519) | 26.25 | 5,42E-05 |
| 25 | rs2501968 | CENPQ | 6 | G | A | 0.465302 | 0.4229 | -0.0490 (0.0086) | -0.0879 (0.0498) | 32.46 | 6,71E-05 |
| 26 | rs2526620 | - | 7 | G | A | 0.252144 | 0.2459 | 0.0500 (0.0092) | 0.0505 (0.0576) | 29.54 | 6,10E-05 |
| 27 | rs284160 | TGFBR3 | 1 | A | G | 0.192644 | 0.1186 | 0.0572 (0.0096) | 0.1573 (0.0768) | 35.5 | 7,33E-05 |
| 28 | rs2842870 | PMF1, PMF1-BGLAP | 1 | C | T | 0.360398 | 0.3434 | -0.0446 (0.0087) | -0.0727 (0.0518) | 26.28 | 5,43E-05 |
| 29 | rs2880492 | NCOR2 | 12 | C | T | 0.035841 | 0.01984 | -0.1293 (0.0266) | -0.1917 (0.1781) | 23.63 | 4,88E-05 |
| 30 | rs35790371 | RBFOX1 | 16 | A | G | 0.005125 | 0.001903 | 0.5587 (0.1176) | 0.1447 (0.5420) | 22.57 | 4,66E-05 |
| 31 | rs5752720 | TTC28 | 22 | T | C | 0.28441 | 0.1844 | 0.0422 (0.0091) | -0.0311 (0.0635) | 21.51 | 4,44E-05 |
| 32 | rs57694670 | SH3PXD2A | 10 | G | A | 0.433638 | 0.3834 | -0.0507 (0.0086) | 0.0080 (0.0507) | 34.76 | 7,18E-05 |
| 33 | rs6462001 | - | 7 | T | G | 0.881494 | 0.8329 | -0.0765 (0.0151) | -0.0567 (0.0662) | 25.67 | 5,30E-05 |
| 34 | rs6843082 | - | 4 | A | G | 0.65294 | 0.6907 | -0.0438 (0.0092) | -0.0568 (0.0534) | 22.67 | 4,68E-05 |
| 35 | rs7091346 | SH3PXD2A | 10 | T | C | 0.45273 | 0.2664 | -0.0582 (0.0098) | -0.0143 (0.0552) | 35.27 | 7,28E-05 |
| 36 | rs7194129 | CFDP1 | 16 | T | C | 0.573691 | 0.5538 | 0.0399 (0.0084) | 0.0293 (0.0495) | 22.56 | 4,66E-05 |
| 37 | rs7341574 | ZFPM2 | 8 | T | C | 0.313243 | 0.3895 | 0.0463 (0.0094) | -0.0774 (0.0505) | 24.26 | 5,01E-05 |
| 38 | rs7451833 | - | 6 | G | A | 0.103042 | 0.1166 | 0.1280 (0.0220) | 0.1253 (0.0777) | 33.85 | 6,99E-05 |
| 39 | rs74617384 | LPA | 6 | T | A | 0.070999 | 0.04573 | 0.1415 (0.0281) | -0.0532 (0.1162) | 25.36 | 5,24E-05 |
| 40 | rs74849463 | PIK3C2B | 1 | T | C | 0.240949 | 0.2043 | 0.0445 (0.0092) | -0.0319 (0.0616) | 23.4 | 4,83E-05 |
| 41 | rs757241 | AFAP1-AS1 | 4 | C | G | 0.673377 | 0.6704 | -0.0681 (0.0145) | -0.0274 (0.0523) | 22.06 | 4,56E-05 |
| 42 | rs76099321 | CNNM2 | 10 | A | G | 0.052085 | 0.02979 | -0.0691 (0.0150) | -0.2215 (0.1464) | 21.22 | 4,38E-05 |
| 43 | rs7670136 | - | 4 | C | T | 0.571088 | 0.6269 | -0.0473 (0.0101) | 0.0391 (0.0509) | 21.93 | 4,53E-05 |
| 44 | rs77455924 | MNT | 11 | T | C | 0.056457 | 0.02996 | 0.1632 (0.0331) | 0.0444 (0.1477) | 24.31 | 5,02E-05 |
| 45 | rs7820334 | - | 8 | T | C | 0.246549 | 0.2949 | -0.0643 (0.0127) | -0.1327 (0.0648) | 25.63 | 5,29E-05 |
| 46 | rs7859727 | CDKN2B-AS1 | 9 | T | C | 0.518845 | 0.4151 | 0.0569 (0.0087) | 0.0281 (0.0498) | 42.77 | 8,83E-05 |
| 47 | rs7989823 | COL4A1, COL4A2 | 13 | C | A | 0.591615 | 0.6188 | 0.0527 (0.0089) | 0.0693 (0.0518) | 35.06 | 7,24E-05 |
| 48 | rs79960344 | - | 17 | G | T | 0.102808 | 0.1031 | 0.0651 (0.0130) | -0.1596 (0.0805) | 25.08 | 5,18E-05 |
| 49 | rs880315 | CASZ1 | 1 | C | T | 0.445525 | 0.4139 | 0.0416 (0.0089) | 0.0444 (0.0501) | 21.85 | 4,51E-05 |
| 50 | rs9112 | LOC100505841 | 5 | A | G | 0.436595 | 0.3573 | 0.0407 (0.0085) | -0.0274 (0.0523) | 22.93 | 4,74E-05 |
| 51 | rs979380 | - | 17 | A | G | 0.531844 | 0.6197 | -0.0417 (0.0084) | -0.0196 (0.0506) | 24.64 | 5,09E-05 |
| EAF.IS e EAF.VD indicam as frequências do alelo de efeito nos conjuntos de dados da exposição ao acidente vascular cerebral isquêmico e do desfecho demência vascular, respectivamente. Estatística F = (β/SE)². R² por SNP = F/(F + N − 2), em que N = 484.121. Os SNPs foram selecionados utilizando p < 5 × 10-6 e agrupamento por desequilíbrio de ligação com r² < 0,001 dentro de uma janela de 10.000 kb. | |||||||||||
Tabela 1: Instrumentos genéticos para acidente vascular cerebral isquêmico e associações correspondentes SNP–desfecho para demência vascular. A tabela lista os 51 SNPs finais, incluindo identificação do SNP, gene mapeado, cromossomo, alelos, FAE, estimativas SNP–traço, estatísticas F e R2 por SNP. Os SNPs foram selecionados com p < 5 × 10-6 e agrupados com r2 < 0,001 dentro de 10.000 kb. FAE.AI e FAE.DV indicam as frequências do alelo de efeito nos conjuntos de dados de AI e DV, respectivamente. Chr., cromossomo; AE, alelo de efeito; OA, outro alelo; FAE, frequência do alelo de efeito; AI, acidente vascular cerebral isquêmico; DV, demência vascular. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela Suplementar 1. Avaliação da pleiotropia horizontal pelo MR-PRESSO para a análise entre acidente vascular cerebral isquêmico e demência vascular. Esta tabela resume a análise realizada pelo MR-PRESSO para avaliar a pleiotropia horizontal global e as variantes atípicas potenciais, utilizando o conjunto de dados final harmonizado de 51 SNPs.Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 2. Etapas do protocolo e resultados correspondentes de validação. Esta tabela relaciona cada etapa principal do protocolo com seu resultado representativo correspondente e localização relatada no manuscrito, demonstrando a implementação e validação do fluxo de trabalho analítico.Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Este estudo apresenta um protocolo de MR de duas amostras para avaliar a possível associação causal entre IS e VaD utilizando estatísticas resumidas de GWAS disponíveis publicamente. Na análise representativa, os métodos IVW e mediana ponderada apoiaram uma associação positiva entre IS predito geneticamente e risco de VaD, enquanto a estimativa MR-Egger foi direcionalmente consistente, mas não atingiu significância estatística. Portanto, esses achados fornecem evidências sugestivas de um possível efeito causal, em vez de prova definitiva de causalidade.
A associação observada é biologicamente plausível no contexto de lesão cerebrovascular. O ACV pode levar a lesão neuronal regional, perfusão cerebral prejudicada e alterações neurodegenerativas subsequentes. Estudos anteriores mostraram que a Demência Vascular frequentemente ocorre em situações de fluxo sanguíneo cerebral reduzido ou dano cerebrovascular13,14. Alterações cerebrovasculares crônicas após o ACV podem contribuir ainda mais para a deterioração cognitiva e o risco de Demência Vascular15. Além disso, lesões microvasculares pós-AVC, respostas inflamatórias e disfunção neurovascular crônica podem representar possíveis vínculos biológicos entre o ACV e a Demência Vascular. No entanto, o presente protocolo de RM não pode estabelecer diretamente esses mecanismos, e os achados devem ser interpretados em conjunto com futuros estudos de validação clínica e mecanicista.
A estimativa do MR-Egger não atingiu significância estatística. Esse resultado deve ser interpretado com cautela, e não como uma contradição direta dos resultados do IVW e da mediana ponderada. O MR-Egger pode fornecer estimativas mais robustas a certas formas de pleiotropia direcional, mas geralmente possui menor poder estatístico, especialmente quando os efeitos dos instrumentos são modestos. Nesta análise, o intercepto do MR-Egger não indicou pleiotropia horizontal direcional estatisticamente significativa, e os testes de heterogeneidade não mostraram heterogeneidade substancial entre SNPs. Além disso, o teste global do MR-PRESSO não revelou evidência de pleiotropia horizontal global. Essas análises de sensibilidade reduzem a preocupação com pleiotropia direcional ou horizontal global mensurável, mas não excluem todas as possíveis fontes de viés nem estabelecem causalidade.
O número modesto de casos de Demência Vascular deve, no entanto, ser considerado ao interpretar esses achados. Embora a análise primária IVW tenha tido um poder pós-hoc estimado de 89,5% condicionado ao tamanho do efeito observado, esse resultado é descritivo e não deve ser interpretado como uma justificativa pré-especificada do tamanho da amostra. A contagem limitada de casos reduziu particularmente a precisão dos estimadores de sensibilidade menos eficientes; o efeito mínimo detectável de 80% para o MR-Egger foi uma OR de 3,23, valor maior do que a estimativa observada. Assim, o resultado não significativo do MR-Egger não elimina a incerteza quanto à magnitude da associação. Esses cálculos de poder também não abordam possíveis vieses relacionados à validade do instrumento, sobreposição de amostras, heterogeneidade de fenótipo ou pleiotropia horizontal residual.
Várias etapas analíticas são fundamentais para a confiabilidade deste fluxo de trabalho de MR. Primeiro, os conjuntos de dados de GWAS da exposição e do desfecho devem ser claramente identificados usando IDs de conjunto de dados ou informações de acesso. Segundo, a seleção de SNPs e o agrupamento por desequilíbrio de ligação devem ser realizados usando limiares pré-definidos para obter instrumentos genéticos independentes. Terceiro, a força do instrumento deve ser avaliada por meio de estatísticas F para reduzir o risco de viés decorrente de instrumentos fracos. Quarto, a harmonização de alelos é essencial para garantir que as estimativas de SNP–exposição e SNP–desfecho correspondam ao mesmo alelo de efeito. Por fim, análises de heterogeneidade, pleiotropia horizontal e leave-one-out devem ser utilizadas para avaliar se a estimativa principal é influenciada por efeitos de SNPs inconsistentes, pleiotropia direcional ou um único instrumento genético dominante.
Fontes comuns de falha ou viés neste fluxo de trabalho incluem SNPs associados à exposição insuficientes, instrumentos fracos, SNPs do desfecho indisponíveis, alinhamento ambíguo de alelos, variantes palindrômicas, discordância de SNP substituto, heterogeneidade entre estimativas específicas de SNP, pleiotropia horizontal, discrepância populacional, heterogeneidade de fenótipo e possível sobreposição de amostras. Esses problemas podem ser abordados verificando os identificadores dos conjuntos de dados de GWAS, aplicando limiares consistentes de seleção de SNPs e agrupamento, documentando o uso de SNPs substitutos, examinando os resultados da harmonização, resumindo estatísticas F e interpretando as estimativas de MR juntamente com os resultados de heterogeneidade, pleiotropia e análise leave-one-out. Se for detectada heterogeneidade ou pleiotropia substancial, a estimativa principal IVW deve ser interpretada com cautela e análises de sensibilidade adicionais ou conjuntos de dados alternativos devem ser considerados.
A possível sobreposição de amostras também deve ser considerada. Os estudos GWAS de exposição e os estudos GWAS de desfecho do FinnGen foram ambos derivados de recursos com ascendência europeia, e o grau de sobreposição de participantes não pôde ser quantificado a partir das estatísticas sumárias disponíveis. Essa sobreposição pode enviesar as estimativas de MR de duas amostras em direção a associações observacionais, especialmente quando os instrumentos não estão fortemente associados à exposição. Essa limitação deve ser levada em conta ao interpretar o resultado representativo.
Em comparação com estudos observacionais de coorte ou caso-controle convencionais, a RM pode reduzir a confusão e o viés de causalidade reversa sob suposições válidas de variável instrumental. No entanto, os estudos observacionais continuam sendo valiosos para estimar a incidência de doenças, padrões temporais e prognóstico clínico. Em comparação com ensaios clínicos randomizados ou modelos experimentais, a RM pode avaliar associações causais potenciais utilizando dados genéticos existentes quando estudos de intervenção direta são inviáveis ou antiéticos. Apesar disso, a RM não pode revelar diretamente mecanismos celulares nem substituir a validação mecanicista. Portanto, este protocolo deve ser visto como complementar a estudos de coorte, análises transversais, modelos animais e experimentos em células, e não como substituto deles.
Estudos anteriores exploraram fatores de risco vascular e desfechos relacionados à demência utilizando abordagens epidemiológicas e genéticas. Por exemplo, diabetes e hipertensão foram associados ao risco de demência em pesquisas clínicas e baseadas em populações realizadas anteriormente16. Estudos baseados em MR existentes também investigaram IS, VaD e mecanismos de comorbidade relacionados. O presente manuscrito difere desses estudos em seu objetivo principal. Em vez de buscar identificar novos alvos moleculares ou validar experimentalmente mecanismos da doença, este artigo concentra-se em apresentar um protocolo reproduzível para realizar uma análise de MR de duas amostras utilizando estatísticas sumárias de GWAS disponíveis publicamente.
Este protocolo apresenta várias limitações. Primeiro, a análise foi baseada em estatísticas sumárias de GWAS disponíveis publicamente, e os resultados podem não ser totalmente generalizáveis a populações não europeias ou a conjuntos de dados com definições diferentes de casos. Segundo, foi utilizado um limiar relaxado para seleção de SNPs (p < 5 × 10-6) para manter um número adequado de instrumentos independentes para análises de sensibilidade. Embora todos os instrumentos mantidos tenham apresentado estatísticas F >10, esse limiar é menos rigoroso do que o limiar convencional de significância em todo o genoma e pode incluir variantes com associações de exposição mais fracas ou menos robustas. Portanto, os achados representativos devem ser interpretados como exploratórios e sugestivos, e não como evidência definitiva de causalidade. Terceiro, embora a MR possa reduzir a confusão e o viés de causalidade reversa, ela não pode excluir completamente a pleiotropia horizontal, a classificação incorreta do fenótipo, a sobreposição de amostras ou o viés introduzido por instrumentos inválidos. Quarto, a estimativa não significativa de MR-Egger indica que a interpretação causal deve permanecer cautelosa. Quinto, este protocolo não inclui experimentos em células, modelos animais ou validação em coortes independentes; essas abordagens seriam valiosas para esclarecer os mecanismos biológicos e a aplicabilidade clínica.
Além disso, o IS foi modelado como um fenótipo geral. Este protocolo representativo não foi projetado para identificar se alguma associação é atribuível ao acidente vascular cerebral aterosclerótico de artéria grande, oclusão de vaso pequeno, acidente vascular cerebral cardioembólico ou outro subtipo. Consequentemente, o resultado não deve ser interpretado como evidência de um efeito específico de subtipo. Trabalhos futuros devem aplicar o mesmo fluxo de trabalho a conjuntos de dados de GWAS bem dimensionados por subtipo, utilizando um plano de análise pré-especificado e harmonizado.
Aplicações futuras deste protocolo podem estender-se além do AVC isquêmico e da DA. O mesmo fluxo de trabalho pode ser adaptado para avaliar outras relações exposição-resultado cerebrovasculares, neurodegenerativas, metabólicas, inflamatórias ou cardiovasculares quando estatísticas resumidas de GWAS adequadas estiverem disponíveis. Estudos futuros também podem ampliar este fluxo de trabalho incorporando validação independente de GWAS, MR bidirecional, MR multivariável, MR de mediação ou integração com evidências baseadas em coortes e experimentais.
Em resumo, este protocolo fornece um fluxo de trabalho reprodutível para realizar análise de MR de duas amostras utilizando estatísticas resumidas de GWAS públicos. Os resultados representativos fornecem evidências sugestivas de uma possível associação positiva entre IS predito geneticamente e risco de DaV, apoiada principalmente pelos métodos IVW e mediana ponderada, enquanto a estimativa MR-Egger não atingiu significância estatística. No entanto, os achados não devem ser interpretados como prova mecanicista definitiva. Estudos de validação independentes baseados em populações e investigações experimentais são necessários para esclarecer melhor os mecanismos biológicos e a relevância clínica dessa associação.
Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes. Nenhuma ferramenta de inteligência artificial (AI) ou modelo de linguagem grande (LLM) foi utilizada na redação, edição ou preparação deste manuscrito.
Agradecimentos
Os autores não receberam financiamento específico para este estudo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Conjunto de dados FinnGen GWAS | FinnGen | finn-b-F5_VASCDEM | Conjunto de dados GWAS público utilizado como fonte do desfecho para demência vascular |
| Banco de dados IEU OpenGWAS | Unidade de Epidemiologia Integrativa do MRC, Universidade de Bristol | ebi-a-GCST90018864 | Conjunto de dados GWAS público utilizado como fonte da exposição para acidente vascular cerebral isquêmico |
| Software R | Fundação R para Computação Estatística | Não aplicável | Software estatístico utilizado para análise MR |
| RStudio | Posit Software, PBC | Não aplicável | Ambiente de desenvolvimento integrado utilizado para executar scripts em R |
| Pacote TwoSampleMR | Unidade de Epidemiologia Integrativa do MRC, Universidade de Bristol | Não aplicável | Pacote R utilizado para extração de instrumentos, harmonização, análise MR e análises de sensibilidade |
| Pacote MRPRESSO | CRAN | Versão 1.0 | Pacote R utilizado para avaliar pleiotropia horizontal global e instrumentos potenciais outliers |
| Pacote writexl | CRAN | Não aplicável | Pacote R utilizado para exportar tabelas de resultados como arquivos xlsx |
Referências
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