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Um método cirúrgico para estabelecer um modelo murino de osteoartrite no joelho usando um procedimento de casco modificado

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DOI:

10.3791/70379

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15 de maio de 2026

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve as etapas cirúrgicas refinadas do modelo Hulth modificado, fornecendo um método padronizado e reproduzível para induzir osteoartrite experimental.

Resumo

A osteoartrite do joelho (KOA) é uma doença articular degenerativa crônica caracterizada por degeneração da cartilagem articular, remodelação óssea subcondral, formação de osteófitos e sinovite, que é o tipo mais comum de osteoartrite.

Este protocolo apresenta um método cirúrgico para estabelecer um modelo murino de osteoartrite no joelho usando um procedimento Hulth modificado. Comparado a modelos cirúrgicos induzidos por injeção ou convencionais, como a desestabilização do menisco medial (DMM) e a transseção do ligamento cruzado anterior (ACLT), o modelo Hulth modificado induz um início precoce da doença e uma inflamação articular mais grave. Ao seccionar o ligamento colateral medial, menisco medial e ligamento cruzado anterior, esse método interrompe o alinhamento mecânico da articulação do joelho, promovendo assim a progressão da OA. Esse modelo é particularmente adequado para estudar a patologia aguda da artrosis e avaliar possíveis intervenções terapêuticas. Para avaliar a gravidade da artrite, utilizamos ultrassom em pequenos animais combinado com reconstrução tridimensional (3D) da cavidade articular para quantificar seu volume e avaliar o acúmulo de líquido sinovial. Além disso, foi realizada coloração com safranina-O/verde rápido em seções histológicas para a pontuação da Osteoarthritis Research Society International (OARSI) para avaliar a destruição da cartilagem.

Introdução

A osteoartrite do joelho (OA) é uma doença articular crônica, crônica e degenerativa, caracterizada clinicamente por dor, rigidez, amplitude de movimento limitada e fraqueza muscular ao redor do joelho. Sua prevalência é maior em mulheres do que em homens. Se não for adequadamente controlada, a OA pode levar à perda progressiva da capacidade física, distúrbios do sono, fadiga crônica e, eventualmente, incapacidade. À medida que as populações globais envelhecem, a incidência de OA no joelho continua a aumentar, representando um desafio substancial para os sistemas de saúde e as economias emtodo o mundo.

Fisiopatologicamente, a perda de cartilagem representa a característica central da OA, acompanhada por comprometimento estrutural e funcional de toda a articulação e dos tecidos periarticulares. Para elucidar os mecanismos da doença e avaliar intervenções terapêuticas, uma variedade de modelos animais foi desenvolvida que recapitula aspectos-chave da artrite oteclótica humana. Entre esses, os modelos induzidos cirurgicamente são os mais frequentemente empregados. Como a desestabilização do menisco medial (DMM)3 e da transeção do ligamento cruzado anterior (ACLT)4, que perturbam a estrutura normal da articulação, resultando em degeneração da cartilagem e alterações semelhantes à OA. Alternativamente, modelos químicos dependem da injeção intraarticular de agentes que degradam a matriz extracelular (por exemplo, colagênase ou iodoacetato monosódico), levando à rápida morte dos condrócitos e erosãoda cartilagem 5,6. Enquanto modelos de injeção normalmente alcançam a patologia final em poucas semanas, modelos cirúrgicos geralmente exigem um período mais longo.

Entre as técnicas cirúrgicas disponíveis, selecionamos e refinamos ainda mais o modelo Hulth devido ao seu início acelerado daOA 7. Ao combinar a transeção dos ligamentos cruzado anterior e cruzado posterior com resseção do ligamento colateral medial e meniscectomia total medial, esse modelo induz de forma confiável danos graves e progressivos à cartilagem e alterações ósseas subcondrais. O curto período até a falha da articulação estrutural torna o modelo Hulth modificado particularmente adequado para estudos de artrite ardomia aguda ou subaguda, e propomos que nosso protocolo otimizado ofereça uma plataforma prática e reprodutível para futuras investigações pré-clínicas.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Machos C57BL/6 camundongos com idades entre 6 e 8 semanas e pesando aproximadamente 20 g foram adquiridos de fornecedores comerciais (ver Tabela de Materiais) (número de aprovação ética: PZSHUTCM2312210005).

1. Cuidados pré-operatórios

  1. Permita que os camundongos se aclimatem por pelo menos 1 semana antes da cirurgia.
  2. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia e desinfete o espaço de trabalho cirúrgico.
  3. Ligue a máquina de anestesia gasosa e coloque o rato em uma câmara de indução por 5 minutos usando isoflurano a 2-3% para iniciar a anestesia geral.
    NOTA: Certifique-se de que a taxa de fluxo de oxigênio seja mantida entre 0,5 NL/min e 1 NL/min.
  4. Após a anestesia, transfira o camundongo para a plataforma cirúrgica e mantenha a anestesia usando isoflurano 1-1,5% via máscara anestésica até a conclusão da cirurgia (isoflurano 1-1,5%).
  5. Posicione o rato em posição supina com as articulações do joelho voltadas para cima, garantindo estabilidade e acesso adequado ao local cirúrgico.
  6. Confirme a profundidade da anestesia verificando a ausência de reflexos, depois aplique creme depilatório para remover completamente os pelos ao redor da articulação do joelho.
  7. Remova cuidadosamente o creme residual usando gaze ou cotonetes, depois desinfete a pele exposta primeiro com etanol 75%, seguido de tintura de iodo para garantir condições assépticas.

2. Procedimento cirúrgico (Figura 1)

  1. Estenda o membro traseiro do rato e aplique tração para apertar a pele. Faça uma incisão longitudinal de 0,5 a 1 cm ao longo da face medial da articulação do joelho direito usando uma lâmina cirúrgica estéril.
    NOTA: Todos os procedimentos cirúrgicos descritos abaixo foram realizados sob um microscópio cirúrgico.
  2. Retrair a pele e realizar uma dissecação romba da fáscia subjacente para expor totalmente a cápsula articular e visualizar o ligamento patelar.
  3. Sonde e incisa a fáscia sobre o ligamento colateral medial (LCM), usando uma agulha fina de injeção.
  4. Transecte o LCM usando microtesouras sob ampliação.
  5. Deslocar o ligamento patelar usando uma agulha para expor o espaço intraarticular e identificar o menisco medial.
  6. Transecte o ligamento meniscotibial medial (MMTL) com microtesoura após o corte e sonde suavemente o tecido com uma agulha para confirmar o descolamento completo e a mobilidade do menisco.
  7. Identifique e transeite o ligamento cruzado anterior (LCA), tomando cuidado para evitar danos ao ligamento cruzado posterior (LCP) ou ao menisco lateral. Isso normalmente resulta em um sinal positivo da gaveta anterior após a cirurgia, confirmando instabilidade articular.
    NOTA: Teste da gaveta: Antes do fechamento da ferida, o fêmur era estabilizado com uma mão enquanto o tornozelo era segurado com a outra, mantendo a tíbia e o fêmur em orientação perpendicular. O deslocamento anteroposterior relativo entre tíbia e fêmur foi aplicado manualmente; Movimento translacional observável indicou sinal positivo de Drawer, confirmando a ruptura do ligamento cruzado.
  8. Para induzir osteoartrite mais grave, alternativamente, realiza-se a transseção simultânea tanto do ligamento cruzado anterior (LCA) quanto do ligamento cruzado posterior (LCP), combinada com meniscectomia medial (TMM) (como no modelo clássico de Hulth).
    NOTA: Esta etapa é opcional e pode ser realizada conforme necessário; se selecionado, isso constitui a abordagem de modelagem do modelo clássico Hulth.

3. Cuidados pós-operatórios

  1. Feche a incisão com pontos de nylon 4-0 e desinfete o local cirúrgico com tintura de iodo.
  2. Coloque o mouse em uma almofada térmica controlada até que ele recupere a consciência e apresente respiração e atividade motora normais. Quando estiver totalmente recuperado e sem sinais de sofrimento, devolva-o à gaiola de origem.
  3. Monitore a integridade dos pontos continuamente por 3 a 5 dias após a cirurgia. Se houver quebra do ponto, reanestesie o rato e realize a sutura novamente
  4. Administre antibióticos intramusculares por até 3 dias após a cirurgia para prevenir infecções pós-operatórias.
    NOTA: A administração de antibióticos é empregada para profilaxia contra infecção pós-operatória. A analgesia pós-operatória é determinada por objetivos experimentais; Na pesquisa com osteoartrite, os analgésicos geralmente são retidos durante a fase aguda para evitar avaliações de eficácia terapêutica confusas.
  5. Monitore diariamente o local cirúrgico em busca de sinais de inchaço, corrimento ou inflamação local.
  6. Eutanasie o camundongo no ponto final do estudo, seguindo protocolos aprovados, e disseque a articulação do joelho para análise histológica ou de imagem.
    NOTA: Nesta etapa, adotamos o protocolo de eutanasia dos animais experimentais por overdose de anestesia. Isso foi alcançado por injeção intraperitoneal de solução de sódio pentobarbital em uma dosagem de >100 mg/kg em camundongos.

4. Avaliação do desenvolvimento do AO

  1. Antes da eutanásia, avalie o inchaço da articulação e realize ultrassonografia para avaliar as alterações estruturais na articulação do joelho. Avalie o desempenho motor do mouse realizando o teste rotativo.
    NOTA: Anestesia com isoflurano é necessária para exame ultrassonológico em camundongos.
  2. Após a eutanásia, disseque a articulação do joelho e remova cuidadosamente o músculo e a fáscia ao redor, preservando a tíbia, fíbula e fêmur.
    Fixe as articulações e descalcifique-as em solução de ácido etilenediaminêtico (EDTA) a 10% por pelo menos 30 dias, substituindo a solução duas vezes por semana para garantir a descalcificação completa.
  3. Embutida as articulações descalcificadas do joelho em parafina e prepare seções sagitais com espessura de 4μm 8.
  4. Comece a coletar seções assim que o menisco estiver claramente visível. Tinga as seções com safranina O e verde rápido para visualizar a morfologia da cartilagem e do osso subcondral. Avalie a degradação da cartilagem usando o sistema de pontuaçãoOARSI 9 .
  5. Procedimento de coloração Safranin O-Fast Green (Kit comercial utilizado, veja Tabela de Materiais)
    1. Desparafinização e reidratação
      1. Desparafinize seções em xileno por 3 minutos, repita 3 vezes.
      2. Reidrate por uma série graduada de etanol (100%, 90%, 80%) para remover o xileno residual, 2 minutos cada.
        NOTA: Séries de etanol devem ser usadas em ordem decrescente de concentração.
      3. Enxágue em água destilada por 1 minuto e escorra brevemente.
    2. Coloração de Hematoxilina de Ferro de Weigert
      1. Aplique a solução de trabalho da Weigert nas seções, tinga por 5 minutos.
      2. Enxágue em água destilada por 1 minuto e escorra brevemente.
    3. Diferenciação ácida
      1. Aplique a solução diferenciadora de ácido em seções por 15 segundos.
      2. Lave com água por 10 minutos e drene o excesso de água.
        NOTA: O tempo de diferenciação é crítico — diferenciação prolongada impede uma mancha rápida de verde, enquanto diferenciação insuficiente resulta em coloração verde profunda e rápida com pouca absorção de safranina
    4. Coloração Fast Green
      1. Aplique solução verde rápida nas seções por 5 minutos, escorra brevemente.
      2. Aplique uma solução ácida fraca para remover a mancha verde rápida residual por 15 segundos e drene brevemente.
    5. Coloração Safranin O
      1. Aplique solução de Safranin O nas seções por 4,5 min.
      2. Transfira rapidamente as seções para etanol 90% para remover o excesso de safranina O, 2-3 s.
        NOTA: Esta etapa pode ser estendida adequadamente dependendo da intensidade da coloração de safranina.
    6. Desidratação e limpeza
      1. Desidrate as seções em etanol 100% por 1 minuto.
      2. Limpe as seções em xileno para desidratação completa, 2 minutos, repita 3 vezes.
        NOTA: O xileno usado nesta etapa não deve ser misturado com o usado na Seção 4.5.1; A contaminação cruzada pode comprometer a qualidade da seção.
    7. Montagem com balsâmico neutro
      1. Coloque seções em uma exaustão para permitir a evaporação do xileno excessivo.
      2. Remova as seções, aplique a quantidade adequada de bálsamo neutro ao espécime e cubra cuidadosamente com uma capa de cobertura.
      3. Examine as seções sob um microscópio óptico em busca de bolhas de ar e elimine cuidadosamente qualquer uma disponível.
      4. Guarde as seções em uma caixa de slides e coloque em um forno a 60 °C por 24 horas para garantir a cura completa do bálsamo neutro.

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Resultados

Escaneamentos longitudinais da articulação do joelho foram realizados usando um sistema demicro-ultrassom 8 com passo de varredura de 4 mm e resolução axial de 0,04 mm. No dia pós-operatório 7, a reconstrução 3D revelou um aumento significativo no volume da cavidade articular no grupo modelo em comparação com o grupo simulado (Figura 2A,B). Testes de fadiga rotativa 10,11

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Discussão

Comparando com outros métodos de modelagem cirúrgica, como a desestabilização do menisco medial (DMM) e a transeção do ligamento cruzado anterior (ACLT), o modelo Hulth modificado induz osteoartrite por lesão ligamentar e meniscal combinada. A ruptura estrutural específica determina alterações na biomecânica articular em diferentes planos. OACLT 4 compromete a estabilidade rotacional (rotação interna e externa) e reduz a estabilidade anteroposterior, resultando em...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelo Plano de Ação para Inovação em Ciência e Tecnologia em Xangai (23YF1447900 para CJM), pelo Programa Chenguang da Fundação de Desenvolvimento Educacional de Xangai e pela Comissão Municipal de Educação de Xangai (23CGA53 para CJM), e pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (U24A6013 a XH).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringa de injeção de 1 mL//Especificações: 30 G e vezes; 0,13 mm
Sistema de Imagem de Ultrassom 3D Vevo 3100ÓpticaVevo 2100Um sistema de imagem por ultrassom de alta frequência integrado ao software Vevo LAB para análise de dados.
Sutura de nylon 4-0//
75% de etanolShanghai Titan Scientific Co., Ltd.G73537O
C57BL/6J camundongos machos (6-8 semanas de idade)Shanghai Jiesijie Laboratory Animal Co., Ltd./
Creme depilatórioVeetLote: C021123001
Tintura de iodo//
IsofluranoRWD R650-IE
Micro pinçasRWD F12013-10
Micro tesourasRWD S11035-08
Safranin O modificado e kit de mancha verde rápidaSolarbioG1371
Suporte de agulhaRWD F21001-12
Lâminas cirúrgicas (10#)RWD S31010-01
Microscópio cirúrgicoOlympusSZ61

Referências

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
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  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
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  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
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