Artigo de investigação

Estabelecimento de Culturas Primárias Enriquecidas em Zona a partir do córtex adrenal do camundongo

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DOI:

10.3791/70403

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8 de maio de 2026

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1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

Neste artigo

Resumo

Uma abordagem robusta e reprodutível para estabelecer culturas primárias 2D de células enriquecidas com zona glomerulosa e zona fasciculata foi desenvolvida para o córtex adrenal do camundongo. Esse sistema preserva características moleculares e funcionais chave de cada zona, permitindo uma investigação focada das vias de sinalização, produção de hormônios e comportamento das células corticais adrenais ex vivo.

Resumo

A glândula adrenal do camundongo é encapsulada por uma camada celular mesenquimal (cápsula) e contém um córtex subjacente organizado em zonas concêntricas distintas com funções endócrinas especializadas: a zona glomerulosa (zG), que produz aldosterona, e a zona fasciculada (zF), que produz corticosterona. A medula adrenal, localizada no centro da glândula, produz catecolaminas. Estudos mecanicistas de células de cada zona adrenocortical têm sido limitados pela ausência de modelos in vitro que preservem suas características moleculares, celulares e funcionais específicas de zona. Para superar essa limitação, foi desenvolvida uma abordagem de fracionamento utilizando microdissecação de glândulas adrenais de camundongos adultos. Esse método separa as células suprarrenais de camundongos machos em uma fração externa enriquecida com zG (OF), contendo células cápsula e células zG, e uma fração interna enriquecida com zF (FI), que contém zF e células medulares. Essas frações foram usadas para gerar culturas primárias bidimensionais (2D) enriquecidas para células zG ou zF. A análise de expressão gênica confirmou que as culturas enriquecidas com zG expressam altos níveis de marcadores de zG (Cyp11b2, Dab2 e Shh), juntamente com aumento dos marcadores das vias Wnt/β-catenina (Wnt4, Lef1). Em contraste, culturas enriquecidas com zF apresentaram maior expressão dos marcadores zF (Cyp11b1 e Akr1b7) e níveis mais baixos de marcadores da via Wnt/β-catenina, consistentes com uma assinatura transcricional zF. A expressão de marcadores esteroidogênicos (Nr5a1, Star) validou a origem adrenocortical de ambas as frações celulares. A tirosina hidroxilase indica a presença de células medulares adrenais em culturas enriquecidas com zF. Funcionalmente, culturas enriquecidas com zG produziram aldosterona em condições basais e mostraram aumento na produção em resposta à angiotensina II, potássio e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). Por outro lado, culturas enriquecidas com zF produziram corticosterona no início da produção e apresentaram aumento na produção em resposta à estimulação de ACTH. No geral, esse protocolo representa um modelo in vitro robusto, reproduzível e biologicamente relevante para o estudo da biologia do córtex adrenal. Esse sistema permite a investigação específica de zonas de vias de sinalização, mecanismos moleculares e respostas fisiológicas.

Introdução

Uma cápsula mesenquimatosa fina encapsula a glândula adrenal do camundongo, que consiste em dois compartimentos principais: o córtex externo e a medula interna. O córtex adrenal do camundongo macho adulto é ainda dividido em zonas distintas, a zona glomerulosa (zG) e a zona fasciculada (zF), cada uma com características morfológicas e funcionaisúnicas 1,2,3,4. A principal função do córtex adrenal é a produção de hormônios esteroides, incluindo mineralocorticoides (aldosterona) e glicocorticoides (corticosterona em camundongos)5. O zG é a região mais externa e compacta e consiste em células ovoides organizadas em estruturas rosetas que expressam aldosterona sintase (CYP11B2), permitindo a produção de aldosterona 2,3,5,6,7. A secreção de aldosterona é regulada principalmente pelo sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS), potássio e, em menor grau, ACTH 5,8. O zF é composto por células maiores dispostas em cordões/fascículos radiais, constitui a maior parte (~85%) do córtex e é regulado principalmente por ACTH 2,3,5,9. Múltiplas vias de sinalização orquestram o desenvolvimento, a manutenção e a função das glândulas supra-renais regulando a dinâmica das células progenitoras, a zonação e a atividade esteroidogênica. Entre eles, o SF-1 (Fator-Esteroidogênico-1, Nr5a1) é um regulador mestre essencial para especificação adrenocortical, proliferação e produção dehormônios 10. A sinalização sonic hedgehog (Shh), ativa no zG, promove a expansão das células progenitoras e apoia a renovação cortical nozG 11,12,13.

A sinalização Wnt, especialmente através da via canônica β-catenina, é crucial para a zonação adrenal e a integridade cortical. No camundongo, o tamanho e a zonação adrenocorticais normais são regulados por um gradiente de atividade de sinalização WNT que se estende da cápsula até o zF. Esse gradiente é suportado pela expressão localizada de ligantes e potenciadores WNT, principalmente WNT4 no zG, e WNT2B e R-espondinas (RSPO1 e/ou RSPO3) na cápsula 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . O córtex adrenal é mantido pelo fluxo centrípeto das células progenitoras proliferativas localizadas na região subcapsular/externa zG, que dão origem a células diferenciadas zG que migram para dentro em direção ao zF. À medida que as células fazem a transição do zG para o zF, elas passam por mudanças na expressão e função gênica, chamadas de trans-diferenciação. Esse modelo tem sido fortemente apoiado por estudos de rastreamento de linhagem usando a linha transgênica de camundongosAS Cre/+, que tem como alvo especificamente células produtoras de aldosterona no zG 23,24,25.

Diversas abordagens in vitro foram usadas para estudar a biologia adrenal com base na dissociação de toda a glândula adrenal 26,27,28. Por exemplo, um estudo descreveu dissociação do córtex adrenal para análises eletrofisiológicas epatch-clamp 27, e outro estudo utilizou células corticais adrenais dissociadas para investigar mecanismos de sinalização relacionados à fisiologia adrenal e regulação da pressãoarterial 26. Embora essas metodologias tenham fornecido importantes insights funcionais, elas dependem de células de preparações adrenais completas, em vez da separação das zonas corticais antes da cultura celular.

Dada a complexidade e diversidade histológica da glândula adrenal, compreender os papéis distintos de seus compartimentos celulares é essencial para elucidar os mecanismos subjacentes à função adrenal. Neste estudo, foram estabelecidas culturas celulares adrenocorticais primárias de camundongo, enriquecidas para células zG ou zF. Uma grande vantagem desse método é a geração de culturas celulares enriquecidas com zG, permitindo a modulação experimental de vias de sinalização e fatores ambientais para investigar melhor seu papel específico na biologia do córtex adrenal. Isso inclui o estudo da manutenção das células progenitoras, os mecanismos subjacentes à plasticidade zonal e à transdiferenciação em direção ao zF, e a modelagem da composição da matriz extracelular. Paralelamente, esse método gera culturas de células zF altamente enriquecidas, fornecendo uma plataforma complementar para estudos funcionais e de sinalização específicos por zona. Juntas, essas características fornecem um sistema robusto e experimentalmente controlado para avançar na compreensão da biologia adrenal.

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Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do Hospital Infantil de Boston (IACUC), sob o número de aprovação 00002611. Uma lista completa de todos os materiais usados neste protocolo, incluindo reagentes, consumíveis e equipamentos, é fornecida na Tabela de Materiais, juntamente com os respectivos fabricantes e números de catálogo para garantir a reprodutibilidade.

Culturas primárias de células da zona adrenal de camundongos na zona glomerulosa e zona fasciculada
Os métodos usados para estabelecer culturas primárias de células adrenocorticais do tipo selvagem (Mus musculus, C57BL/6) machos adultos neste estudo foram adaptados de um procedimento originalmente desenvolvido para ratosSprague-Dawley 28. Para confirmar a segregação e identidade das populações celulares da zona glomerulosa e zona fasciculata, foi empregado um modelo de rastreamento de linhagem usando camundongos Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (também conhecidos como Cre) 1,2,3,4 e camundongos Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (também conhecidos como ROSAmT/mG) 29.

Preparação antes do procedimento
Materiais
Dois conjuntos de pinças e tesouras para incisões superficiais e outro conjunto para incisão da cavidade abdominal (Figura Suplementar 1A). Aqueceu o meio de cultivo e o PBS (37 °C). Preparei 2 pratos (P60) com DMEM/F-12. Preparou 3 pratos (P60) com PBS aquecido para lavar as glândulas em sequência (banho 1, 2 e 3) (Figuras Suplementares 1B, 1–3), e 1 prato para manter a adrenal em solução (Figuras Suplementares 1B, 4). Preparei 2 pratos (P60) com papel filtro estéril na superfície (Figuras Suplementares 1C, 1–2). Preparei 2 pratos P60 com 500 μL de solução digestiva e rotulou-os para a glomerulosa (zG) ou fascículo (zF) (Figuras Suplementares 1D, zG, zF). Preparei 2 tubos, rotulei zG e zF, e adicionei 4,5 mL de solução digestiva.

Soluções
Para preparar a solução digestiva, colagênase tipo I (concentração final 4 mg/mL) e DNase I (concentração final 0,04 mg/mL) foram dissolvidas em 5 mL de meio puro DMEM/F-12. Filtrei a solução para um tubo de 50 mL usando uma seringa e um filtro de 0,22 μM. A solução digestiva deve ser preparada fresca a cada vez.

Animais
Para obter culturas primárias enriquecidas para células da zona glórula adrenal e zona fasciculada de camundongos, utilize-se de 10 a 15 camundongos machos adultos, com aproximadamente 6 a 7 semanas de idade. As fêmeas têm glândulas suprarrenais ligeiramente maiores que os homens, e qualquer sexo pode ser usado com esse protocolo. No entanto, neste estudo, apenas machos foram usados para evitar possíveis interferências da zona X presente nas fêmeas jovens, garantindo uma separação zonal precisa. Os camundongos foram eutanasiados por inalação de CO₂, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidado animal. A morte foi confirmada pela ausência de respiração e falta de resposta reflexa. As glândulas suprarrenais foram dissecadas imediatamente, dentro de 3 a 5 minutos após a confirmação da morte, para preservar a viabilidade tecidual.

Posição e exposição do abdômen
O camundongo foi colocado em posição decúbito dorsal sobre uma superfície plana e estéril (Figura 1A). O pelo do animal foi desinfetado com álcool 70%. Pinças e tesouras foram usadas para as incisões cutâneas, e o segundo conjunto para a incisão da cavidade abdominal. Foi feita uma incisão inicial na região inguinal do abdômen, estendendo-se lateralmente em direção ao tórax de ambos os lados para expor o peritônio (Figura 1B). A pele foi cuidadosamente retraída, seguida pela musculatura abdominal, para expor a cavidade abdominal (Figura 1C). A incisão inicial deve ser superficial para evitar danos aos órgãos internos. Avance para a camada muscular com uma incisão cuidadosa e depois exponha a cavidade abdominal. Evite romper vasos sanguíneos, pois o sangramento pode dificultar a localização das glândulas suprarrenais e atrasar a coleta. Troque os instrumentos cirúrgicos para minimizar a contaminação microbiana.

Identificação e coleta da glândula adrenal esquerda
A glândula adrenal esquerda está localizada medialmente e acima do rim esquerdo no retroperitônio, com formato oval e coloração rosa, cercada por tecido adiposo branco (Figuras 1D–G). Ao deslocar cuidadosamente órgãos adjacentes com pinças rombas para melhorar a visualização, use tesouras para remover a maior parte do tecido adiposo usando cortes curtos e controlados, isolando a glândula adrenal. Evite agarrar diretamente a glândula adrenal para evitar danos à sua cápsula. A glândula foi colocada imediatamente após o isolamento em um prato de cultura P60 com 10 mL de DMEM/F-12 pré-aquecido a 37 °C (Figura 1F).

Identificação e coleta da glândula adrenal direita
A glândula adrenal direita está localizada lateralmente e acima do rim direito no retroperitônio, com formato oval e coloração rosa (Figuras 1E–H). Identificar essa glândula adrenal pode ser mais difícil devido à sua proximidade com outros órgãos, como o fígado e o cólon ascendente, além de vasos sanguíneos próximos. Ao deslocar cuidadosamente órgãos adjacentes com pinças rombas para melhorar a visualização, use tesouras para remover a maior parte do tecido adiposo usando cortes curtos e controlados, isolando a glândula adrenal, sem tomar cuidado para danificar a cápsula. A glândula foi colocada imediatamente após o isolamento em um prato de cultura P60 com 10 mL de DMEM/F-12 pré-aquecido a 37 °C. As adrenais são combinadas no mesmo recipiente (Figura 1F). Durante o procedimento, é essencial manusear cuidadosamente os principais vasos sanguíneos da área para evitar cortes acidentais, que podem causar sangramento e complicar o processo de coleta. Os principais vasos a serem observados incluem as veias renais e as artérias renais. Coletaram a glândula adrenal com um pouco de tecido adiposo aderente. Isso facilita o manuseio da glândula e protege contra danos e contaminação da cápsula (Figura 1I).

Trabalho em um exaustor de fluxo laminar estéril
Antes de transferir as glândulas para o exaustor de fluxo laminar, o prato era limpo com álcool a 70%. As adrenais foram lavadas com PBS três vezes em temperatura ambiente (25 °C) (nos pratos 1, 2 e 3 e coletadas no recipiente 4) (Figura Suplementar 1B). O papel filtro ajuda na aderência da gordura e garante melhores resultados. Durante a preparação de múltiplas glândulas, os tecidos separados devem ser mantidos em DMEM pré-aquecido para preservar a viabilidade. A glândula adrenal foi agarrada pelo tecido adiposo aderente (Figuras 1I–J), e a gordura foi cuidadosamente dissecada no papel filtro (Figura Suplementar 1C, prato 1), usando pinças finas e movimentos controlados para evitar danos à cápsula. O resultado esperado é uma glândula lisa e intacta, livre de excesso de tecido adiposo e conjuntivo, como mostrado na Figura 1K. As glândulas adrenais foram transferidas cuidadosamente para papel de filtro novo (Figura Suplementar 1C, prato 2) para facilitar a microdissecção precisa. A cápsula foi suavemente beliscada com pinças finas e, usando a lâmina do bisturi, foi feita uma incisão radial na glândula sem cortar completamente o tecido.

O conteúdo interno do córtex foi suavemente exposto ao ser expelido para fora pela incisão, aplicando uma leve pressão mecânica com as pinças. A cápsula e o zG permaneceram conectados à ponta da pinça, enquanto o material glandular expelido interna correspondia ao zF e à medula. A digestão enzimática deve ser iniciada somente após o processamento de todas as glândulas (Figura 1L), devido à separação mecânica das zonas externa e interna.

Digestão
Dois tubos foram rotulados como OF (Fração Externa: cápsula e zG) ou IF (Fração Interna: zF e medula) (Figura 1M). Um total de 4,5 mL de solução digestiva pré-aquecida (37 °C) foi adicionado, e o OF e o IF foram transferidos para os tubos apropriados. As amostras foram incubadas a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ por 30 minutos, e os tubos foram suavemente girados a cada 10 minutos, invertendo-os manualmente 2 a 3 vezes para garantir uma exposição uniforme à solução enzimática. O tempo necessário para a digestão pode variar dependendo da qualidade, atividade e condições de armazenamento da colagènase. Após 30 minutos, o tecido foi dissociado pipetando 40 vezes com movimentos lentos e controlados, usando uma pipeta sorológica de 5 mL para gerar uma suspensão de célula única. Após a dissociação do tecido, idealmente, não devem permanecer fragmentos visíveis e o meio deve parecer turvo. Se ainda houver fragmentos, pode-se considerar uma digestão adicional de 15 minutos.

Lavagem e placagem
Após a digestão, as células foram lavadas adicionando 45 mL de DMEM/F-12 para remover a enzima residual (Figura 1 M). As amostras foram centrifugadas a 150 × g por 12 minutos em temperatura ambiente (25 °C). Após a centrifugação, espera-se um pellet pequeno e compacto com aparência levemente rosada a amarelo-pálida, enquanto o sobrenadante deve permanecer limpo e livre de partículas visíveis. O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado, tomando cuidado para não perturbar a pastilha. O pellet foi ressuspenso em meio de cultura pré-aquecido (37 °C) de acordo com o volume final necessário para o revestimento (veja abaixo). Uma densidade ideal de blindagem de aproximadamente 70% foi mantida para garantir viabilidade e vigor da cultura. O número de células foi estimado usando uma câmara de contagem de Neubauer antes da placagem, e o número de células semeadas foi ajustado de acordo com a área do prato de cultivo para alcançar a confluência desejada. Placar as células da fração externa (OF) enriquecidas com zG com uma densidade de aproximadamente um animal por poço (tipicamente rendendo ~1,5–2,5 × 104 células) e as células da fração interna enriquecida com zF em ~0,63 animais por poço (tipicamente rendendo ~2,5–4,0 × 104 células) em uma placa de 48 poços.

Manutenção de cultura celular
As células foram cultivadas no Meio de Cultura descrito acima e mantidas em condições padrão em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂. Após 24 horas de cultivo, o meio foi substituído para remover detritos e quaisquer células sanguíneas residuais. Essa etapa promove o crescimento ideal. A placa era cuidadosamente aspirada, e um meio pré-aquecido fresco (37 °C) era adicionado. Espere pelo menos 48 horas antes de avaliar as células em experimentos funcionais. Recomenda-se esperar três dias antes de realizar experimentos funcionais para garantir que as culturas estejam bem estabelecidas. Culturas prolongadas além desse período podem exigir tripsinização e passagem, o que pode levar à seleção celular e à perda das características primárias da cultura.

Análise de dados e procedimentos de suporte
Preparação de culturas primárias de células adrenais
Culturas primárias de glândulas suprarrenais inteiras foram estabelecidas seguindo os mesmos procedimentos para coleta de tecidos, digestão, lavagem e placagem, e foram usadas como controles padrão para ensaios moleculares e funcionais.

Análise de expressão gênica
Para purificar o RNA total das células OF e FI, as células cultivadas foram homogeneizadas no TRIReagent usando o kit de RNA, de acordo com o protocolo do fabricante. A integridade e a concentração de RNA foram avaliadas por meio de espectrometria. O processamento adicional do RNA total envolveu transcrição reversa em cDNA usando o kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade. A análise de expressão gênica foi realizada por PCR quantitativa em tempo real (qPCR) usando o termociclador. Duplicados técnicos eram usados para controlar a variabilidade. Foram usados o TaqMan Universal PCR Master Mix e os primers TaqMan para mouse (Tabela 1). Um valor de limiar de ciclo (CT) foi selecionado dentro da faixa de amplificação linear para cada amostra passada em duplicado. Foi normalizado por genes endógenos de controle β-actina e proteína ribossomal 18S (Rps18). Os níveis de expressão relativa foram calculados usando o método 2–ΔΔCt 30. Os dados de três experimentos diferentes são apresentados como média ± desvio padrão (DS). Realizamos três experimentos independentes.

Estimulação da secreção de aldosterona e corticosterona em culturas primárias ZG e ZF
Culturas primárias de células da zona glomerulosa (ZG) e da zona fasciculada (ZF) foram estabelecidas e mantidas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂. Aproximadamente 5 × 104 células foram placadas por poço em uma placa de 48 poços usando meio de crescimento completo. Após quatro dias de cultura contínua, as medições de secreção basal refletiram a produção acumulada de hormônios nesse período. Para ensaios de estimulação, o meio era aspirado e as células lavadas uma vez com soro salino tamponado com fosfato (PBS) para remover fatores residuais. Subsequentemente, 200 μL de meio fresco foram adicionados a cada poço, e os ensaios a seguir representam secreção estimulada aguda dentro de uma janela de tempo definida. Para ensaios de estimulação de aldosterona, o meio de cultivo foi suplementado com angiotensina II (Ang II, 10 nM), potássio (K+), como cloreto de potássio (KCl, 10 mM) e ACTH (10 nM). Cloreto de sódio (NaCl, 10 mM) era usado como controle do veículo. Para ensaios de estimulação com corticosterona, os mesmos procedimentos foram seguidos, mas o meio foi suplementado com ACTH (10 nM), forskolina (10 μM) ou NaCl (10 mM) como controle do veículo. Após 6 horas de incubação a 37 °C e 5% de CO₂, os supernadantes da cultura foram coletados e armazenados a −80 °C para quantificação subsequente dos hormônios, conforme descritoanteriormente, 31. As células aderentes restantes foram lisadas para extração de proteínas, e os níveis hormonais foram normalizados ao teor total de proteína do lisado correspondente.

Extração de proteínas e normalização das medições de aldosterona e corticosterona
A extração de proteínas foi realizada usando lise e tampão de extração RIPA, suplementados com um coquetel inibidor de protease de parada 1x. As células eram ressuspensas pipetando para cima e para baixo 15 vezes usando a ponta de uma pipeta P200 e posteriormente sonicadas usando um sonador sonda. A concentração de proteína foi determinada com o kit de ensaio de proteínas BCA conforme as instruções do fabricante.

Medição de aldosterona por radioimunoensaio (RIA)
A concentração de aldosterona em supernadantes de cultura celular foi determinada seguindo o protocolo do fabricante. Em resumo, 50 μL de sobrenadante e 150 μL de 1% de BSA em PBS, juntamente com 500 μL do rastreador radioativo de aldosterona, foram adicionados aos tubos revestidos por anticorpos de aldosterona. Após a mistura, os tubos foram incubados em temperatura ambiente (25 °C) por 18 horas. Em seguida, a mistura de incubação era decantada e a radioatividade nos tubos era contada usando um contador auto-gamaCobra II 31. Os níveis de aldosterona foram normalizados para proteína total, conforme descrito anteriormente.

Medição com corticosterona
As concentrações de corticosterona em supernadantes em culturas celulares foram medidas usando um kit competitivo de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) específico para corticosterona de camundongos e ratos, seguindo o protocolo do fabricante. Os níveis de corticosterona foram normalizados para proteína total, conforme descrito anteriormente, 32.

Imunocoloração
A imunofluorescência foi realizada tanto em seções adrenais embutidas em parafina quanto em células cultivadas em lâminas de vidro pré-tratadas revestidas com poli-L-lisina. Para todas as amostras, o bloqueio foi realizado com 5% de soro normal de cabra (NGS) em PBS, e núcleos foram contra-coloridos com DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenilindol, 1:1000). As lâminas e coverslips foram lavadas três vezes por 5 minutos cada, com 0,1% Tween-20 em PBS entre as etapas da incubação. Após a coloração, as amostras eram montadas com Antifade Mountant e armazenadas no escuro até a imagem. Trechos de tecido: As seções de parafina adrenal foram desparafinizadas em xileno, depois enxaguadas por uma série graduada de etanol (100%, 95%, 70%) e, finalmente, enxaguadas em PBS. A coleta de antígeno foi realizada no tampão Tris-EDTA (10 mM base Tris, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9,0) aquecendo a 95 °C por 20 minutos. Após resfriar até a temperatura ambiente, as seções foram lavadas em PBS e bloqueadas com 5% de NGS em PBS por 1 hora. As cáreas foram incubadas durante a noite a 4 °C com os seguintes anticorpos primários diluídos 1:100 em 5% de NGS no PBS: anti-Dab2 de camundongo, anti-GFP de galinha e anti-RFP de coelho. Os seguintes anticorpos secundários foram usados (1:300): Alexa Fluor 594 anti-camundongo, Alexa Fluor 594 anti-galinha IgY, e Alexa Fluor 647 anti-coelho de cabra.

Células cultivadas: A imunofluorescência nos coverslips foi realizada quatro dias após o revestimento. As células foram fixadas com paraformaldeído (PFA) pré-aquecido a 4% a 37 °C por 15 minutos e lavadas três vezes em PBS. O bloqueio foi realizado usando 5% de NGS em PBS por 1 hora em temperatura ambiente. Os coverslips foram incubados durante a noite a 4 °C com anti-Dab2 de camundongo (1:100 em 5% de NGS/PBS), seguidos pelo Alexa Fluor 488 anti-camundongo (1:500).

Aquisição de imagens: Imagens em campo claro e fluorescência (mGFP e mTomato) de células cultivadas foram adquiridas usando um sistema de microscópio. A fluorescência mGFP foi capturada usando um conjunto de filtros para fluorescência verde (excitação: 470 nM, emissão: 525 nM), e a fluorescência mTomato foi capturada usando um conjunto de filtros para fluorescência vermelha (excitação: 585 nM, emissão: 624 nM).

Software e análise estatística
Resumos visuais, diagramas esquemáticos e figuras foram criados usando Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) e BioRender (https://www.biorender.com), acessados em maio de 2025. Os dados foram analisados usando o GraphPad Prism versão 10.0. Disponível em: https://www.graphpad.com. Todos os experimentos foram realizados pelo menos em triplicado e repetidos independentemente para garantir a reprodutibilidade dos resultados. Para comparações entre dois grupos, foi utilizado o teste t de Student (pareado ou não, conforme apropriado). Para comparações envolvendo três ou mais grupos, foi realizada a análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste post hoc apropriado para identificar diferenças significativas entre os grupos. Os resultados são apresentados como média ± DS. Um valor-p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

Estabelecimento e caracterização de culturas celulares adrenais primárias enriquecidas em zonas
Culturas primárias de células adrenais foram estabelecidas com sucesso a partir da OF, enriquecida para células zG, e da FI, enriquecida para células zF. Imagens representativas das células cultivadas são mostradas na Figura 2A (OF–zG) e na Figura 2B (IF–zF). Para avaliar o enriquecimento de células zG e não-zG nes...

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Discussão

Neste estudo, foi apresentado um protocolo refinado que gera culturas primárias de células adrenais de camundongos enriquecidas para células zG (OF) e zF (IF), que recapitulam fielmente a identidade zonal e a função esteroidogênica de cada zona. Esse protocolo deve permitir uma investigação detalhada da biologia celular e molecular do córtex adrenal em um contexto específico de zona, apoiando o estudo de proteínas, vias de sinalização e mecanismos envolvidos no desenvolvimento, diferenci...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes relacionados a este estudo.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pela FAPESP (Fundação de Pesquisa de São Paulo, Brasil), projeto número 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), e apoio da 2R01DK123694 (para DTB) e fundos da Divisão de Endocrinologia do Hospital Infantil de Boston (DTB).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Conical Tube (50 mL )Corning (Corning, NY, USA)352070Sterile
0.22 µm Syringe FilterMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)SLGV033RSFiltração da solução de digestão
10 mL Disposable SyringeBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)300912Sterile
5 mL Serological PipetteCorning (Corning, NY, USA)4487Sterile
10 mL Serological PipetteCorning (Corning, NY, USA)4488Sterile
Filtered Pipette Tips (P200)Axygen (Union City, CA, USA)TF-200-R-SSterile
Filtered Pipette Tips (P1000)Axygen (Union City, CA, USA)TF-1000-R-SSterile
P60 Culture DishCorning (Corning, NY, USA)430166Tratamento para cultura de tecidos
48-well PlateCorning (Corning, NY, USA)3527Tratamento para cultura de tecidos
Sterile Filter PaperN/AN/ARemoção de gordura e suporte para dissecação
DMEM/F-12 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)11320033Formulação 1:1
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10082147Inativado por calor
ITS SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)41400045100X
GlutaMAX SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)35050061100X
Penicillin-Streptomycin (100X)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)15140122Antibiótico
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10010023pH 7,4
Collagenase Type IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)17100-017Digestão de tecidos
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)DN25-1Digestão de tecidos
Angiotensin II (Ang II)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A9525Estimulação hormonal
Adrenocorticotropic Hormone (ACTH)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A0298Estimulação hormonal
ForskolinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)F6886Estimulação de cAMP
Potassium Chloride (KCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)P9541Estimulação de aldosterona
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)S7653Controle do veículo
Small Surgical ScissorsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)14060-09Dissecação
Scalpel with Disposable BladeFine Science Tools (Foster City, CA, USA)10003-12Microdissecação
Fine ForcepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11252-00Dissecação
Curved ForcepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11251-10Dissecação
Laminar Flow HoodThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/AProcessamento estéril de tecidos
IncubatorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/ACultivo de células
CentrifugeEppendorf (Hamburg, Germany)N/APelletagem de células
Neubauer Counting ChamberHausser Scientific (Horsham, PA, USA)1490Contagem de células
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)89901Extração de proteínas
Halt Protease Inhibitor CocktailThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)87786Extração de proteínas
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)FB120Sonicação
RIA SystemTecan (Männedorf, Switzerland)MG13051Quantificação hormonal
Cobra II Auto-Gamma CounterBerthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)N/AMedição de radioatividade
Corticosterone ELISA Kit (96-well)Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)55-CORMS-E01Medição hormonal
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)P36930Meio de montagem
Mouse anti-Dab2BD Biosciences (San Jose, CA, USA)610464Anticorpo primário
Chicken anti-GFPAves Labs (Tigard, OR, USA)GFP-1020Anticorpo primário
Rabbit anti-RFPRockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)600-401-379Anticorpo primário
Alexa Fluor 594 Goat anti-MouseInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11005Anticorpo secundário
Alexa Fluor 594 Goat anti-ChickenInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11042Anticorpo secundário
Alexa Fluor 647 Goat anti-RabbitInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-21244Anticorpo secundário
Alexa Fluor 488 Goat anti-MouseThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)A-11001Anticorpo secundário
EVOS Microscope SystemThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/AImageamento
TRI ReagentSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)T9424Extração de RNA
Direct-zol RNA KitZymo Research (Irvine, CA, USA)R2050Purificação de RNA
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)ND-1000Quantificação de RNA
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4304437qPCR
QuantStudio 6 Flex ThermocyclerLife Technologies (Carlsbad, CA, USA)N/AqPCR

Referências

  1. Zelander, T. The ultrastructure of the adrenal cortex of the mouse. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 46 (6), 710-716 (1957).
  2. Nishimoto, K., et al. Adrenocortical zonation in humans under normal and pathological conditions. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (5), 2296-2305 (2010).
  3. Freedman, B. D., et al. Adrenocortical zonation results from lineage conversion of differentiated zona glomerulosa cells. Dev. Cell. 26 (6), 666-673 (2013).
  4. Leng, S., Carlone, D. L., Guagliardo, N. A., Barrett, P. Q., Breault, D. T. Rosette morphology in zona glomerulosa formation and function. Mol. Cell. Endocrinol. 530, 111287(2021).
  5. Gwynne, J. T., Strauss, J. F. The role of lipoproteins in steroidogenesis and cholesterol metabolism in steroidogenic glands. Endocr. Rev. 3 (3), 299-329 (1982).
  6. Zhu, Y., Zhang, X., Hu, C. Structure of rosettes in the zona glomerulosa of human adrenal cortex. J. Anat. 243 (4), 684-689 (2023).
  7. Leng, S., et al. β-Catenin and FGFR2 regulate postnatal rosette-based adrenocortical morphogenesis. Nat. Commun. 11 (1), 1680(2020).
  8. Rainey, W. E. Adrenal zonation: clues from 11β-hydroxylase and aldosterone synthase. Mol. Cell. Endocrinol. 151 (1-2), 151-160 (1999).
  9. Rebuffé-Scrive, M., Krotkiewski, M., Elfversson, J., Björntorp, P. Muscle and adipose tissue morphology and metabolism in Cushing’s syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab. 67 (6), 1122-1128 (1988).
  10. Luo, X., Ikeda, Y., Parker, K. L. A cell-specific nuclear receptor is essential for adrenal and gonadal development and sexual differentiation. Cel. l. 77 (4), 481-490 (1994).
  11. Huang, C. C. J., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. C. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by Sonic Hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
  12. King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 106 (50), 21185-21190 (2009).
  13. Ching, S., Vilain, E. Targeted disruption of Sonic Hedgehog in the mouse adrenal leads to adrenocortical hypoplasia. Genesis. 47 (9), 628-637 (2009).
  14. Kim, A. C., et al. Targeted disruption of β-catenin in Sf1-expressing cells impairs development and maintenance of the adrenal cortex. Development. 135 (15), 2593-2602 (2008).
  15. Berthon, A., et al. Constitutive β-catenin activation induces adrenal hyperplasia and promotes adrenal cancer development. Hum. Mol. Genet. 19 (8), 1561-1576 (2010).
  16. Basham, K. J., et al. A ZNRF3-dependent Wnt/β-catenin signaling gradient is required for adrenal homeostasis. Genes Dev. 33 (3-4), 209-220 (2019).
  17. Finco, I., Lerario, A. M., Hammer, G. D. Sonic Hedgehog and WNT signaling promote adrenal gland regeneration in male mice. Endocrinology. 159 (2), 579-596 (2018).
  18. Heikkilä, M., et al. Wnt-4 deficiency alters mouse adrenal cortex function, reducing aldosterone production. Endocrinology. 143 (11), 4358-4365 (2002).
  19. Drelon, C., et al. PKA inhibits WNT signalling in adrenal cortex zonation and prevents malignant tumour development. Nat. Commun. 7 (1), 12751(2016).
  20. Heaton, J. H., et al. Progression to adrenocortical tumorigenesis in mice and humans through insulin-like growth factor 2 and β-catenin. Am. J. Pathol. 181 (3), 1017-1033 (2012).
  21. Borges, K. S., et al. Wnt/β-catenin activation cooperates with loss of p53 to cause adrenocortical carcinoma in mice. Oncogene. 39 (30), 5282-5291 (2020).
  22. Borges, K. S., et al. Non-canonical Wnt signaling triggered by WNT2B drives adrenal aldosterone production. bioRxiv. , (2024).
  23. Sasano, H. Cell proliferation and apoptosis in normal and pathologic human adrenal. Mod. Pathol. 8 (1), 11-17 (1995).
  24. Chang, S. P., Morrison, H. D., Nilsson, F., Kenyon, C. J., West, J. D., et al. Cell proliferation, movement, and differentiation during maintenance of the adult mouse adrenal cortex. PLoS One. 8 (12), e81865(2013).
  25. Mitani, F. Functional zonation of the rat adrenal cortex: the development and maintenance. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, 90 (5), 163-183 (2014).
  26. Dinh, H. A., Volkert, M., Secener, A. K., Scholl, U. I., Stölting, G. T- and L-type calcium channels maintain calcium oscillations in the murine zona glomerulosa. Hypertension. 81 (4), 811-822 (2024).
  27. Penton, D., et al. Task3 potassium channel gene invalidation causes low renin and salt-sensitive arterial hypertension. Endocrinology. 153 (10), 4740-4748 (2012).
  28. Mattos, G. E., Lotfi, C. F. P. Differences between the growth regulatory pathways in primary rat adrenal cells and mouse tumor cell line. Mol. Cell. Endocrinol. 245 (1-2), 31-42 (2005).
  29. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  30. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  31. Berber, M., et al. Rho/ROCK signaling and α-catenin mediate β-catenin-driven hyperplasia in the adrenal cortex via adherens junctions. J. Clin. Invest. , (2026).
  32. Smith, T. T. G., et al. Forced treadmill running reduces systemic inflammation yet worsens upper limb discomfort in a rat model of work-related musculoskeletal disorders. BMC Musculoskelet. Disord. 21 (1), 57(2020).
  33. Kremer, J. L., et al. Extracellular matrix protein signatures of the outer and inner zones of the rat adrenal cortex. J. Proteome Res. 23 (8), 3418-3432 (2024).
  34. Pignatti, E., Leng, S., Carlone, D. L., Breault, D. T. Regulation of zonation and homeostasis in the adrenal cortex. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 146-155 (2017).
  35. Pignatti, E., et al. Beta-catenin causes adrenal hyperplasia by blocking zonal transdifferentiation. Cell Rep. 31 (3), 107524(2020).
  36. Romero, D. G., et al. Disabled-2 is expressed in the adrenal zona glomerulosa and is involved in aldosterone secretion. Endocrinology. 148 (6), 2644-2652 (2007).
  37. Sahut-Barnola, I., Lefrancois-Martinez, A. M., Jean, C., Veyssiere, G., Martinez, A. Adrenal tumorigenesis targeted by the corticotropin-regulated promoter of the aldo-keto reductase AKR1B7 gene in transgenic mice. Endocr. Res. 26 (4), 885-898 (2000).
  38. Vidal, V., et al. The adrenal capsule is a signaling center controlling cell renewal and zonation through Rspo3. Genes Dev. 30 (12), 1389-1394 (2016).
  39. Dörner, J., et al. GLI1+ progenitor cells in the adrenal capsule of the adult mouse give rise to heterotopic gonadal-like tissue. Mol. Cell. Endocrinol. 441, 164-175 (2017).
  40. Guo, Y., et al. 3D culture system for human adrenal glands that uses a sequential processing medium to facilitate cortical-medullary cell development. Clin. Lab. 70 (12), (2024).
  41. Friedrich, L., Schuster, M., Rubin de Celis, M. F., Berger, I., Bornstein, S. R., et al. Isolation and in vitro cultivation of adrenal cells from mice. STAR Protoc. 2 (4), 100999(2021).
  42. Mattos, G. E., Jacysyn, J. F., Amarante-Mendes, G. P., Lotfi, C. F. P. Comparative effect of FGF2, synthetic peptides 1–28 N-POMC and ACTH on proliferation in rat adrenal cell primary cultures. Cell Tissue Res. 345 (3), 343-356 (2011).
  43. Gazdar, A. F., et al. Establishment and characterization of a human adrenocortical carcinoma cell line that expresses multiple pathways of steroid biosynthesis. Cancer Res. 50 (17), 5488-5496 (1990).
  44. Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Mol. Cell. Endocrinol. 351 (1), 58-65 (2012).

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