Artigo de investigação

Estabelecimento de Culturas Primárias Enriquecidas em Zona a partir do córtex adrenal do camundongo

DOI:

10.3791/70403

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8 de maio de 2026

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1Division of Endocrinology, Boston Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 3Harvard Stem Cell Institute, 4Institute of Biomedical Science, University of São Paulo, 5Broad Institute of MIT and Harvard

Neste artigo

Resumo

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Uma abordagem robusta e reprodutível para estabelecer culturas primárias 2D de células enriquecidas com zona glomerulosa e zona fasciculata foi desenvolvida para o córtex adrenal do camundongo. Esse sistema preserva características moleculares e funcionais chave de cada zona, permitindo uma investigação focada das vias de sinalização, produção de hormônios e comportamento das células corticais adrenais ex vivo.

Resumo

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A glândula adrenal do camundongo é encapsulada por uma camada celular mesenquimal (cápsula) e contém um córtex subjacente organizado em zonas concêntricas distintas com funções endócrinas especializadas: a zona glomerulosa (zG), que produz aldosterona, e a zona fasciculada (zF), que produz corticosterona. A medula adrenal, localizada no centro da glândula, produz catecolaminas. Estudos mecanicistas de células de cada zona adrenocortical têm sido limitados pela ausência de modelos in vitro que preservem suas características moleculares, celulares e funcionais específicas de zona. Para superar essa limitação, foi desenvolvida uma abordagem de fracionamento utilizando microdissecação de glândulas adrenais de camundongos adultos. Esse método separa as células suprarrenais de camundongos machos em uma fração externa enriquecida com zG (OF), contendo células cápsula e células zG, e uma fração interna enriquecida com zF (FI), que contém zF e células medulares. Essas frações foram usadas para gerar culturas primárias bidimensionais (2D) enriquecidas para células zG ou zF. A análise de expressão gênica confirmou que as culturas enriquecidas com zG expressam altos níveis de marcadores de zG (Cyp11b2, Dab2 e Shh), juntamente com aumento dos marcadores das vias Wnt/β-catenina (Wnt4, Lef1). Em contraste, culturas enriquecidas com zF apresentaram maior expressão dos marcadores zF (Cyp11b1 e Akr1b7) e níveis mais baixos de marcadores da via Wnt/β-catenina, consistentes com uma assinatura transcricional zF. A expressão de marcadores esteroidogênicos (Nr5a1, Star) validou a origem adrenocortical de ambas as frações celulares. A tirosina hidroxilase indica a presença de células medulares adrenais em culturas enriquecidas com zF. Funcionalmente, culturas enriquecidas com zG produziram aldosterona em condições basais e mostraram aumento na produção em resposta à angiotensina II, potássio e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH). Por outro lado, culturas enriquecidas com zF produziram corticosterona no início da produção e apresentaram aumento na produção em resposta à estimulação de ACTH. No geral, esse protocolo representa um modelo in vitro robusto, reproduzível e biologicamente relevante para o estudo da biologia do córtex adrenal. Esse sistema permite a investigação específica de zonas de vias de sinalização, mecanismos moleculares e respostas fisiológicas.

Introdução

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Uma cápsula mesenquimatosa fina encapsula a glândula adrenal do camundongo, que consiste em dois compartimentos principais: o córtex externo e a medula interna. O córtex adrenal do camundongo macho adulto é ainda dividido em zonas distintas, a zona glomerulosa (zG) e a zona fasciculada (zF), cada uma com características morfológicas e funcionaisúnicas 1,2,3,4. A principal função do córtex adrenal é a produção de hormônios esteroides, incluindo mineralocorticoides (aldosterona) e glicocorticoides (corticoster....

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Protocolo

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Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais do Hospital Infantil de Boston (IACUC), sob o número de aprovação 00002611. Uma lista completa de todos os materiais usados neste protocolo, incluindo reagentes, consumíveis e equipamentos, é fornecida na Tabela de Materiais, juntamente com os respectivos fabricantes e números de catálogo para garantir a reprodutibilidade.

Culturas primárias de células da zona adrenal de camundongos na zona glomerulosa e zona fasciculada
Os métodos usados para e....

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Resultados

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Estabelecimento e caracterização de culturas celulares adrenais primárias enriquecidas em zonas
Culturas primárias de células adrenais foram estabelecidas com sucesso a partir da OF, enriquecida para células zG, e da FI, enriquecida para células zF. Imagens representativas das células cultivadas são mostradas na Figura 2A (OF–zG) e na Figura 2B (IF–zF). Para avaliar o enriquecimento de células zG e não-zG nes.......

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Discussão

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Neste estudo, foi apresentado um protocolo refinado que gera culturas primárias de células adrenais de camundongos enriquecidas para células zG (OF) e zF (IF), que recapitulam fielmente a identidade zonal e a função esteroidogênica de cada zona. Esse protocolo deve permitir uma investigação detalhada da biologia celular e molecular do córtex adrenal em um contexto específico de zona, apoiando o estudo de proteínas, vias de sinalização e mecanismos envolvidos no desenvolvimento, diferenci.......

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes relacionados a este estudo.

Agradecimentos

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Esse trabalho foi apoiado pela FAPESP (Fundação de Pesquisa de São Paulo, Brasil), projeto número 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), e apoio da 2R01DK123694 (para DTB) e fundos da Divisão de Endocrinologia do Hospital Infantil de Boston (DTB).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Conical Tube (50 mL )Corning (Corning, NY, USA)352070Sterile
0.22 µm Syringe FilterMilliporeSigma (Burlington, MA, USA)SLGV033RSFiltração da solução de digestão
10 mL Disposable SyringeBD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)300912Sterile
5 mL Serological PipetteCorning (Corning, NY, USA)4487Sterile
10 mL Serological PipetteCorning (Corning, NY, USA)4488Sterile
Filtered Pipette Tips (P200)Axygen (Union City, CA, USA)TF-200-R-SSterile
Filtered Pipette Tips (P1000)Axygen (Union City, CA, USA)TF-1000-R-SSterile
P60 Culture DishCorning (Corning, NY, USA)430166Tratamento para cultura de tecidos
48-well PlateCorning (Corning, NY, USA)3527Tratamento para cultura de tecidos
Sterile Filter PaperN/AN/ARemoção de gordura e suporte para dissecação
DMEM/F-12 MediumGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)11320033Formulação 1:1
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10082147Inativado por calor
ITS SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)41400045100X
GlutaMAX SupplementGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)35050061100X
Penicillin-Streptomycin (100X)Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)15140122Antibiótico
PBS 1XGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)10010023pH 7,4
Collagenase Type IGibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)17100-017Digestão de tecidos
DNase ISigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)DN25-1Digestão de tecidos
Angiotensin II (Ang II)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A9525Estimulação hormonal
Adrenocorticotropic Hormone (ACTH)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)A0298Estimulação hormonal
ForskolinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)F6886Estimulação de cAMP
Potassium Chloride (KCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)P9541Estimulação de aldosterona
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)S7653Controle do veículo
Small Surgical ScissorsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)14060-09Dissecação
Scalpel with Disposable BladeFine Science Tools (Foster City, CA, USA)10003-12Microdissecação
Fine ForcepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11252-00Dissecação
Curved ForcepsFine Science Tools (Foster City, CA, USA)11251-10Dissecação
Laminar Flow HoodThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/AProcessamento estéril de tecidos
IncubatorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/ACultivo de células
CentrifugeEppendorf (Hamburg, Germany)N/APelletagem de células
Neubauer Counting ChamberHausser Scientific (Horsham, PA, USA)1490Contagem de células
RIPA Lysis and Extraction BufferThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)89901Extração de proteínas
Halt Protease Inhibitor CocktailThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)87786Extração de proteínas
Fisherbrand Model 120 Sonic DismembratorThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)FB120Sonicação
RIA SystemTecan (Männedorf, Switzerland)MG13051Quantificação hormonal
Cobra II Auto-Gamma CounterBerthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)N/AMedição de radioatividade
Corticosterone ELISA Kit (96-well)Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)55-CORMS-E01Medição hormonal
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)P36930Meio de montagem
Mouse anti-Dab2BD Biosciences (San Jose, CA, USA)610464Anticorpo primário
Chicken anti-GFPAves Labs (Tigard, OR, USA)GFP-1020Anticorpo primário
Rabbit anti-RFPRockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)600-401-379Anticorpo primário
Alexa Fluor 594 Goat anti-MouseInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11005Anticorpo secundário
Alexa Fluor 594 Goat anti-ChickenInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-11042Anticorpo secundário
Alexa Fluor 647 Goat anti-RabbitInvitrogen (Carlsbad, CA, USA)A-21244Anticorpo secundário
Alexa Fluor 488 Goat anti-MouseThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)A-11001Anticorpo secundário
EVOS Microscope SystemThermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)N/AImageamento
TRI ReagentSigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)T9424Extração de RNA
Direct-zol RNA KitZymo Research (Irvine, CA, USA)R2050Purificação de RNA
NanoDrop ND-1000Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)ND-1000Quantificação de RNA
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems (Foster City, CA, USA)4304437qPCR
QuantStudio 6 Flex ThermocyclerLife Technologies (Carlsbad, CA, USA)N/AqPCR

Referências

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  1. Zelander, T. The ultrastructure of the adrenal cortex of the mouse. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 46 (6), 710-716 (1957).
  2. Nishimoto, K., et al. Adrenocortical zonation in humans under normal and pathological conditions. J. Clin. Endocrinol. Me....

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