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Artigo de investigação

Gastrodin alivia a hiperfosforilação de tau associada às alterações de sinalização AKT/GSK-3β em um modelo celular da doença de Alzheimer

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DOI:

10.3791/70432

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24 de março de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Zhejiang Sci-Tech University Shaoxing Academy of Biomedicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo celular da doença de Alzheimer induzido por ácido okadaico em células SH-SY5Y e avaliar os efeitos neuroprotetores da gastrodina por meio do estresse oxidativo e análise das vias AKT/GSK-3β.

Resumo

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa comum para a qual atualmente existem medicamentos eficazes limitados. Como principal componente bioativo derivado do Gastrodia elata, o Gastrodin (GAS) demonstrou claro potencial terapêutico para o tratamento da Alzheimer; no entanto, o mecanismo molecular de sua ação ainda precisa ser esclarecido. Neste estudo, nosso objetivo é investigar o mecanismo do efeito do SGA nas células-modelo de DA. A farmacologia de redes é empregada para analisar os alvos e vias de sinalização afetados pelo GAS na DA. Um modelo celular de DA é construído induzindo células SH-SY5Y de neuroblastoma humano com ácido Okadaico (OA). A viabilidade celular foi avaliada usando o ensaio CCK-8, enquanto os níveis de SOD, MDA e T-AOC foram medidos. A taxa de apoptose foi determinada por meio de coloração dupla com Annexin V-FITC/PI, e a expressão de fatores relacionados à apoptose, assim como AKT, GSK-3β, p-Tau (Ser396) e p-Tau (Thr181), foi analisada usando técnicas RT-qPCR e Western bloting. A análise de farmacologia em redes sugere que o GAS tem potencial para regular a apoptose celular e as vias de sinalização associadas, incluindo PI3K/AKT. Nossos experimentos demonstram que o GAS pode inibir os níveis de MDA, aumentar a T-AOC e a SOD nas células modelo de AD e reduzir a apoptose celular. Os resultados do Western blot indicam que o GAS mitiga os efeitos inibitórios da OA na expressão de p-AKT (Ser473) e p-GSK-3β (Ser9). Além disso, atenua a superexpressão de p-Tau (Ser396) e p-Tau (Thr181), suprime a expressão de Bax e potencializa a expressão de Bcl-2. O SGA demonstra a capacidade de amenizar a lesão por estresse oxidativo induzida pela OA e mitigar a apoptose. O GAS pode suprimir a hiperfosforilação do Tau, que está associada a alterações na via de sinalização AKT/GSK-3β, exercendo assim potenciais efeitos neuroprotetores.

Introdução

A doença de Alzheimer (DA) é um distúrbio neurodegenerativo progressivo caracterizado principalmente por perda de memória e comprometimento cognitivo, representando a forma mais prevalente de demência no mundo, respondendo aproximadamente de 60% a 80% doscasos 1. A patogênese subjacente da DA permanece complexa e ainda não totalmenteelucidada 2. Principais marcas patológicas observadas em casos clínicos de Alzheimer incluem o acúmulo de placas senis (SP) e emaranhados neurofibrilares (NFTs) nocérebro 3,4. É amplamente reconhecido que os dois principais eventos patológicos na DA: a deposição extracelular da proteína β-amiloide (Aβ) para formar placas senis e a agregação intracelular da proteína Tau hiperfosforilada para formar emaranhadosneurofibrilares 5,6,7. Além disso, o estresse oxidativo e a neuroinflamação são fatores suplementares que podem contribuir para a exacerbação da DA, 8,9,10,11.

À medida que a tendência global de envelhecimento da população se intensifica, o número de pacientes com demência aumentousignificativamente 12,13. No entanto, as opções de tratamento para a DA continuam limitadas, consistindo predominantemente em medicamentos de alvo único como memantina, donepezil egalantamina 14. No entanto, seus efeitos terapêuticos são principalmente paliativos, e não modificadores da doença, e certos efeitos adversos, como distúrbios gastrointestinais, tontura e bradicardia, foram relatados. Portanto, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais seguras e eficazes continua sendo uma prioridade importantede pesquisa 15,16. Medicamentos monoclonais recentemente lançados, como o Lecanemab, trouxeram nova esperança para pacientes com Alzheimer leve. No entanto, seus altos custos e limitações não atendem à demanda terapêutica substancial. A prevenção e o tratamento da DA continuam representando um desafio significativo 17,18. As descobertas de vários estudos demonstraram que plantas medicinais, especialmente as medicinas tradicionais chinesas, exibem efeitos multicomponentes que visam múltiplas vias envolvidas em distúrbios neurodegenerativos como a DA. Estudos mostraram que compostos ativos da Ganoderma lucidum podem aliviar danos oxidativos no tecido cerebral de camundongos com DA, inibir a apoptose, reduzir a necrose dos neurônios do hipocampo e melhorar o comprometimentocognitivo 19. Em pesquisas sobre DA, Bao et al. utilizaram farmacologia em rede para identificar alvos-chave do Astragaloside IV na inflamação relacionada à DA. Seus achados revelaram que o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e a interleucina-1β (IL-1β) são alvos cruciais, fornecendo potenciais candidatos terapêuticos e alvos para doenças para o tratamento clínico de doençasneurodegenerativas 20. Dartigues et al.21 analisaram o extrato de Ginkgo biloba e demonstraram que ele tem efeitos benéficos na redução do risco de demência e mortalidade em idosos. Pacientes tratados com extrato de Ginkgo biloba apresentaram uma taxa de mortalidade menor22.

Gastrodia elata, pertencente à família Orchidaceae, é uma erva tradicional chinesa, comestível e medicinal. O rizoma de Gastrodia elata é abundante em Gastrodin (GAS), polissacarídeos de Gastrodia e alcaloides. Pesquisas farmacológicas recentes demonstraram que esses compostos ativos possuem efeitos de aprimoramento da memória e cognição, além de propriedades neuroprotetoras e eficácia no tratamento da insônia etontura 23. O principal composto bioativo da Gastrodia elata é o GAS, extraído do tubérculo e possui propriedades medicinais. O GAS, também conhecido como álcool 4-hidroxibenzílico 4-O-β-d-glicosídeo, pertence à classe dos glicosídeosfenólicos 24. A estrutura química do GAS é ilustrada na Figura 1, exibindo um peso molecular de 286,278. A massa molecular relativamente baixa dos glicosídeos e monoglicosídeos facilita sua penetração eficiente através da barreira hematoencefálica, servindo assim como base fundamental para o papel neuroprotetor doGAS 25. Além disso, sua alta absorção aumenta ainda mais suaeficácia 26. Nos últimos anos, inúmeros estudos demonstraram o potencial do SGA no tratamento de vários distúrbios cerebrais, incluindo AD 27,28,29,30, doença de Parkinson (DP)31 e isquemiacerebral 32. O GAS apresenta uma ampla gama de propriedades farmacológicas, incluindo efeitos antioxidantes, hipolipidêmicos, anti-inflamatórios e anti-envelhecimento33,34. Seu mecanismo de ação envolve múltiplas vias de sinalização como Nrf2, NF-κB e AMPK35. O GAS exerce efeitos neuroprotetores em um modelo murino de lesão neurológica induzida por Pb ao modular a viaWnt/Nrf2 36, e também exibe efeito antiapoptótico no tratamento de distúrbios neurodegenerativos por meio da regulação da via de sinalizaçãoNrf2 37. O GAS também exerceu um efeito benéfico sobre a DA ao suprimir a expressão hipocampal de BACE1 por meio da via de sinalização38 da proteína quinase/fator de iniciação eucariótica (PKR/eIF2α). Além disso, o GAS apresentou efeitos inibitórios na ativação da sinalização NF-κB induzida por TCDD, atenuando assim a apoptose dos neurônios PC12 e a ativaçãodos astrócitos 39.

figure-introduction-1
Figura 1: Fórmula estrutural química do GAS. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A OA, derivada da esponja preta do gênero Halichondria, pertence a uma classe de ácidos graxos de cadeia longa e serve como o principal componente do Veneno Diarreístico de Mariscos (DSP). Ela inibe efetivamente as atividades das fosfatases proteicas, particularmente PP1A e PP2A, levando à hiperfosforilação celular e à perturbação da homeostasecelular 40,41. Essa característica o torna uma ferramenta valiosa para investigar doenças associadas à fosforilação de proteínas. Portanto, a utilização da OA permite a construção de modelos celulares de AD que apresentam alterações na fosforilação da proteína Tau. Este estudo tem como objetivo investigar o impacto e o mecanismo do GAS, o principal componente ativo da Gastrodia elata, no modelo de células de DA induzido por OA, e esclarecer seu efeito neuroprotetor nas células modelo de DA direcionando a via de sinalização AKT/GSK-3β.

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Protocolo

Todas as operações de farmacologia em rede foram conduzidas de acordo com as Diretrizes para Métodos de Avaliação de Farmacologia em Rede. Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com as regulamentações de gestão laboratorial da Universidade Sci-Tech de Zhejiang.

Farmacologia de redes
Previsão de potenciais alvos do GAS: O SMILES canônico do GAS (PubChem CID: 1150) foi retirado do banco de dadosPubChem 42. A estrutura SMILES foi enviada para o banco de dados SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)43. O parâmetro da espécie foi definido para Homo sapiens. Alvos previstos com valor de probabilidade > 0,1 foram mantidos para reduzir as previsões falso-positivas. Todos os alvos proteicos previstos foram padronizados para símbolos genéticos oficiais usando o banco de dadosUniProt 43 (espécies limitadas a Homo sapiens), e entradas duplicadas foram removidas.

Genes relacionados à Alzheimer foram coletados do banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org/)44,45 e do banco de dados OMIM (https://www.omim.org/)46, usando "doença de Alzheimer" como termo de busca. Nos GeneCards, genes com Pontuação de Relevância > 10 foram selecionados. Alvos obtidos a partir de GeneCards e OMIM foram fundidos, duplicatas removidas e nomes de genes padronizados usando UniProt.

Os alvos previstos para GAS e genes relacionados à DA foram importados para a plataforma online Venny 2.1 para obter alvos sobrepostos. Um total de 52 genes intersectantes (Veja Tabela Suplementar 1) foram identificados como potenciais alvos terapêuticos do GAS na EA.

Os 52 alvos que se cruzavam foram enviados para o banco de dados STRING (https://string-db.org/)47 para análise de PPI. A espécie foi definida para Homo sapiens, e a pontuação mínima exigida de interação foi definida para 0,4 (confiança média). Nós desconectados ficaram ocultos. Os dados de interação resultantes foram exportados e visualizados usando o software Cytoscape (versão 3.9.1).

Análise de enriquecimento GO e KEGG: Os 52 alvos que se cruzam foram enviados para o banco de dados Metascape (https://metascape.org/)48 para análises de enriquecimento Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). A espécie foi definida para Homo sapiens. Os critérios de enriquecimento foram definidos como valor-p < 0,01, sobreposição mínima ≥ 3 e fator de enriquecimento > 1,5. As vias KEGG foram classificadas de acordo com o valor p, e as 20 vias mais significativamente enriquecidas foram selecionadas para visualização. Os resultados do enriquecimento foram visualizados usando uma plataforma online de bioinformática.

O arquivo de estrutura proteica do GSK-3β foi obtido do banco de dados RCSB PDB. O arquivo de estrutura do GAS no formato SDF foi baixado do banco de dados PubChem e posteriormente convertido para o formato Mol2 usando o software Open Babel GUI. Os arquivos mencionados acima foram processados usando o software AutoDock para adicionar átomos de hidrogênio, remover moléculas de água e atribuir cargas. Os arquivos processados foram posteriormente salvos no formato PDBQT. Após detectar e processar ligações de torção nas moléculas de ligante, os arquivos eram então armazenados no formato PDBQT. A menor energia de ligação entre as duas moléculas foi obtida realizando acoplamento molecular usando o software AutoDock Vina. Posteriormente, os resultados do acoplamento foram visualizados e analisados utilizando o PyMOL.

Preparação da solução de estoque
O pó de OA (25 μg) foi completamente dissolvido em 1200 μL de 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) preparado com soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) para gerar uma solução de estoque de 25 μM. A solução de estoque foi alicotada e armazenada a -80 °C. Antes de cada experimento, a OA era recém-diluída com o Meio Eagle Modificado (DMEM) completo de Dulbecco (veja Tabela de Materiais) até as concentrações de trabalho desejadas. O pó de GAS (20 mg) foi dissolvido em 1,4 mL de PBS estéril, filtrado por uma membrana de 0,22 μm para esterilização e preparado como solução de estoque de 50 mM, que foi armazenada a -20 °C. Antes do uso, a solução padrão era diluída com DMEM completo até as concentrações de trabalho indicadas.

Construção do modelo de célula AD
Células SH-SY5Y do neuroblastoma humano foram obtidas e utilizadas neste estudo (veja Tabela de Materiais). Células SH-SY5Y foram induzidas com concentrações gradientes de OA (0, 10, 20, 40, 80, 160 nM) por durações de 12, 24 e 36 horas, respectivamente, para estabelecer o modelo de célula DA.

Ensaio de viabilidade celular
Para determinar a concentração ótima e a duração de indução da AO para estabelecer o modelo de células de DA, as células SH-SY5Y foram tratadas com concentrações gradientes de OA (0, 10, 20, 40, 80 e 160 nM) por diferentes períodos de tempo (12, 24 e 36 h), e a viabilidade celular foi avaliada usando o ensaioCCK-8 49. Células SH-SY5Y foram semeadas em placas de 96 poços com densidade de 7,5 × 10células 3 por poço em 100 μL de DMEM completo. As placas foram incubadas a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ por 24 horas para permitir a fixação celular. Após 24 horas de fixação, 100 μL de solução de trabalho OA foram adicionados a cada poço para alcançar concentrações finais de 0, 10, 20, 40, 80 e 160 nM em um volume total de 200 μL por poço. O grupo controle (CON) recebeu volume igual de DMEM completo sem OA, enquanto o grupo OA recebeu OA nas concentrações indicadas. As células foram incubadas por 12 horas, 24 horas ou 36 horas sob condições padrão de cultura. Cada concentração e ponto de tempo era definido com seis poços replicados. Três poços em branco (apenas meio) foram incluídos para correção de fundo.

Determinação do índice de estresse oxidativo celular
As células SH-SY5Y na fase de crescimento logarítmico foram semeadas em uma placa de 6 poços. Após o tratamento celular, o meio anterior foi descartado dos poços. Posteriormente, os poços foram lavados três vezes com PBS pré-resfriado a 4 °C. Depois disso, foi adicionado um buffer de lise celular, e as células foram lisadas em gelo usando o método apropriado, conforme instruído pelo kit. O teor proteico das amostras foi quantificado usando o kit de ensaio de proteínas BCA (veja a Tabela de Materiais). As atividades do T-AOC, SOD e MDA foram determinadas de acordo com as instruções fornecidas com os respectivos kits de ensaio (ver Tabela de Materiais).

Detecção de apoptose celular
A apoptose celular foi avaliada usando um kit de coloração dupla Annexin V-FITC/PI (veja Tabela de Materiais) conforme as instruções do fabricante. Brevemente, foram coletadas células flutuantes e aderentes. Células aderentes foram digeridas usando tripsina sem EDTA para evitar danos à membrana artificial e combinadas com células flutuantes. As células foram lavadas duas vezes com PBS frio e ressuspensas em 500 μL de Tampão de Ligação 1× com densidade de 0,5–1 × 10,6 células.

Posteriormente, 5 μL de Annexin V-FITC e 5 μL de Iodeto de Propídio (PI) foram adicionados a cada amostra, misturados suavemente e incubados em temperatura ambiente no escuro por 10 a 20 minutos. As amostras foram colocadas no gelo e analisadas em até 1 hora usando um citômetro de fluxo.

Para análise citométrica de fluxo, controles não corados e controles de coloração única (apenas Annexin V-FITC e apenas PI) foram usados para definir parâmetros de compensação e portas de quadrante. A barreira por espalhamento frontal e lateral (FSC/SSC) foi aplicada pela primeira vez para excluir detritos e agregados celulares. Foi adquirido um mínimo de 10.000 eventos por amostra. Os dados foram analisados usando o software FlowJo.

Análise quantitativa de PCR em tempo real (RT-qPCR)
De acordo com as instruções fornecidas pelo kit de transcrição reversa AG, o RNA extraído foi submetido à transcrição reversa para gerar DNA complementar (cDNA), que foi posteriormente diluído 10 vezes com água estéril para servir como mole. O sistema de reação RT-qPCR foi preparado seguindo o protocolo do kit Green Master Mix (No Rox), e a análise foi realizada usando um instrumento de PCR quantitativa fluorescente (ver Tabela de Materiais). Os valores de Ct obtidos foram processados e analisados, e os níveis de expressão dos genes-alvo foram calculados usando o método 2-ΔΔCt, onde ΔCt representa a diferença entre os valores de Ct no grupo de tratamento e GAPDH, e ΔΔCt representa a diferença entre os valores de ΔCt no grupo de tratamento e no grupo controle. A lista de primers pode ser encontrada na Tabela Suplementar 2.

Análise de Western blotting
O tampão de lise celular, junto com um inibidor de protease e um inibidor de fosfatase, foi combinado em uma proporção de 100:1:1. As células foram lisadas para extrair proteínas celulares. A concentração de proteína foi determinada usando o kit de ensaio BCA. Proteínas (20–30 μg por pista) foram separadas em géis SDS-PAGE a 10% a 80 V para o gel de empilhamento e 120 V para o gel de resolução. As proteínas foram transferidas para as membranas PVDF (0,45 μm) a 300 mA por 90 min usando transferência úmida. A membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5% em temperatura ambiente por 2 horas, seguida de incubação noturna com anticorpo primário (ver Tabela de Materiais) a 4 °C. Após incubação com o anticorpo secundário em temperatura ambiente por 1 hora, a membrana foi lavada quatro vezes com TBST por 5 minutos cada. As bandas foram visualizadas usando reagentes de detecção de quimioluminescência aprimorada (ECL) (veja Tabela de Materiais), e a detecção foi realizada com um sistema de imagem em gel. Os valores em escala de cinza foram analisados usando o software ImageJ para obter insights de dados.

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Resultados

Rastreamento alvo relacionado a GAS para tratamento de DA
A identificação dos alvos do GAS para o tratamento da DA envolveu buscas em bancos de dados e análise de software. O banco de dados suíço de Previsão de Alvos forneceu 100 alvos potenciais, enquanto OMIM e GeneCards (com pontuação de Relevância > 10) foram consultados para alvos relacionados à DA, resultando em um total de 2376 alvos potenciais. Posteriormente, o uso da plataforma online Venny 2.1 permitiu a id...

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Discussão

Nos últimos anos, houve um aumento global na prevalência da DA. Essa condição é caracterizada por um curso crônico, natureza irreversível, incapacidade e taxas elevadas de mortalidade, tornando-se um desafio significativo no contexto do envelhecimento da população global. Apesar de sua proeminência, a etiologia da DA é intrincada, e sua patogênese permanece incompletamentecompreendida 51.

A medicina tradicional chinesa oferece vantagens...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Essa pesquisa foi apoiada pelo Fundo Aberto da Universidade de Ciência e Tecnologia de Zhejiang, Academia de Biomedicina de Shaoxing (SXAB202007).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de PCR em Tempo Real 7500APExBIO S0080Usado para detectar células apoptóticas
Instrumento de marcação enzimática A450Proteintech 50599-2-IGBranco de branco, diluição 1:1000
Kit de detecção de apoptose Annexin V-FITCProteintech 60178-1-IGBranco de branco, diluição 1:1000
Anticorpo Anti-BaxProteintech 10494-1-APBranco de branco, diluição 1:1000
Anticorpo anti-Bcl-2Abcam ab32057Branco de branco, diluição 1:1000
Anticorpo anti-GAPDHProteintech 28866-1-APBranco de branco, diluição 1:1000
Anticorpo anti-p-Tau (Ser396)Biofroxx 1172Buffer de bloqueio para WB
Anticorpo anti-p-Tau (Thr181)Vazyme Biotech 
A311-01/02		Usado para ensaio de viabilidade celular
Leite em pó desnatado BiofroxxSolarbio Science & Tecnologia D8371Solvente para compostos
Kit CCK-8Wisent Biotecnologia319-105-CLPara cultura celular
Dimetil sulfóxido (DMSO)APExBIO (EUA)K1231Reagente de detecção de WB
Meio de alta glicose DMEMTecnologia Bioquímica Aladdin  G111309Composto ativo
Reagente quimioluminescente ECLPromega   A6101Para amplificação qPCR
Citômetro de fluxoSolarbio Science & Tecnologia BC6410Ensaio de peroxidação lipídica
Gastrodin (GAS) em pó, pureza & ge; 98%MedChemExpressHY-N6785Indutor da hiperfosforilação de tau
Sistema de imagem em gelBeyotime BiotecnologiaC0221ALave as células
GoTaq qPCR Master MixProteintech SA00001-1Branco branco, diluição 1:5000
Kit de ensaio MDA (malondialdeído)Proteintech SA00001-2Branco branco, diluição 1:5000
Ácido Okadaico (OA)ATCCCRL-2266Célula
PBSBeyotime BiotecnologiaS0101MPara ensaio de estresse oxidativo
Anticorpo secundário (IgG anti-camundongo de cabra, conjugado com HRP)Solarbio Science & Tecnologia BC1315Detecção da capacidade antioxidante
Anticorpo secundário (IgG anti-coelho de cabra, conjugado com HRP)Beyotime Biotechnology R0016Extração de RNA
SH-SY5YSigma-Aldrich 
9002-07-7		Digestão celular
Kit de ensaio SOD (dismutase total de superóxido)Thermo Fisher ScientificA45072Leitor de microplacas multifuncional para detecção de absorção
Kit de capacidade antioxidante total (T-AOC)Becton, Dickinson e Companhia661310Para análise multiparâmetro de célula única e ordenação de células.
Reagente TrizolThermo Fisher Scientific4351104Análise de expressão gênica
TripsinaBio Rad1708195Imagens de gel de DNA/RNA/proteínas

Referências

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