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Artigo de método

Um sistema inovador de cultura 2D e 3D sem soro, composto por duas pequenas moléculas para cultivo de células epiteliais da glândula lacrimal de camundongos

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DOI:

10.3791/70438

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10 de fevereiro de 2026

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

Neste artigo

Resumo

Um novo sistema de cultura sem soro, utilizando a combinação de pequenas moléculas 2C (Y27632 e SB431542), é introduzido para expandir eficientemente as células epiteliais das glândulas lacrimais (LGECs) tanto em culturas 2D quanto 3D, permitindo controle preciso de sua proliferação e diferenciação.

Resumo

A disfunção das glândulas lacrimais (LG) é uma das principais causas da doença do olho seco deficiente em água, e terapias celulares e de engenharia de tecidos mostram potencial significativo para essa condição. No entanto, a disponibilidade limitada de células de sementes suficientes cultivadas em condições sem soro dificultou sua ampla aplicação. Neste estudo, desenvolvemos um novo sistema de cultura sem soro usando duas pequenas moléculas, Y27632 e SB431542 (2C), para expandir eficientemente as células epiteliais LG (LGECs). Para a cultura primária 2D de LGECs, as LG foram isoladas de camundongos de 6 a 8 semanas e digeridas enzimaticamente usando Dispase II e Colagenase A. A suspensão celular resultante foi semeada em placas de cultivo com uma densidade de 7.500 células/cm2 e cultivada com 2C por 12 a 14 dias. Quando a confluência celular atingiu 80-90%, a subcultura foi iniciada em uma proporção de 1:2. Para cultura 3D, 10.000 LGECs P1 foram ressuspensos em 10 μL de 2C e 10 μL de gel matricial, depois semeados no centro de uma placa de 24 poços. Após um período de solidificação de 30 minutos a 37 °C, foram adicionados 600 μL de 2C para continuar a cultura. Para diferenciação, os esferoides 3D foram cultivados com 2C por 7 dias, seguidos pela remoção do 2C e continuação da cultura por mais 7 dias. LGECs cultivados com 2C apresentaram alta proliferação, com expressão elevada de caule e marcadores de proliferação (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0,0011, 0,0002, 0,0012, 0,0003, 0,0014, respectivamente]), e mantiveram morfologia e capacidade proliferativa mesmo após dez passagens. Além disso, sob condições 3D, as LGECs formaram esferoides com características de caule/progenitor, que se diferenciaram ainda mais em estruturas microglandulares contendo múltiplos tipos celulares LG (AQP5, K19, α-SMA-positivo) e funções secretoras maduras após a remoção do 2C. Espera-se que essa abordagem forneça uma fonte estável de células semente para engenharia de tecidos e oferece um novo modelo in vitro para estudar a fisiologia LG.

Introdução

A glândula lacrimal (LG) é essencial para a produção da camada aquosa do filme lacrimal, que é crucial para manter a homeostase da superfícieocular 1. A disfunção do LG, causada por lesão ou inflamação, resulta em doença do olho seco deficiente em água (ADDE). Essa condição pode levar a inflamação severa da superfície ocular, doença crônica da córnea e, em casos graves, perda permanentede visão 2. Os tratamentos atuais para ADDE gerenciam principalmente os sintomas, sem tratar a disfunção glandular subjacente, que limita sua eficáciaa longo prazo 1. O desenvolvimento de terapias direcionadas para a disfunção LG apresenta vários desafios, incluindo a falta de modelos in vitro simples e de longo prazo, que limitam a compreensão da fisiopatologia da LG e dificultam o desenvolvimento de terapias eficazes. Embora o transplante celular tenha demonstrado potencial para promover a regeneração LG, a capacidade limitada de expansão das células in vitro e a complexidade dos sistemas de cultura existentes apresentam obstáculos significativos para a aplicaçãoclínica 1,3. Portanto, estabelecer um sistema simples e de cultivo de longo prazo para LGs adultos de camundongos é essencial para avançar o entendimento da fisiologia e patologia dos LG, além de fornecer uma fonte confiável de células-tronco/progenitoras LG para reparo e regeneração de lesões LG.

Os sistemas de cultura in vitro existentes para LG fizeram progressos significativos, mas ainda enfrentam limitações notáveis. Muitos desses métodos dependem de meios suplementados com soro, que introduzem vários problemas, como variabilidade de lote para lote, componentes indefinidos e risco de contaminação por fibroblastos ou célulasmesenquimais 4,5,6,7,8. Além disso, sistemas baseados em soro são inadequados para estudar os mecanismos patogênicos das doenças LG e apresentam desafios para terapias de transplante celular devido aos potenciais riscos de rejeiçãoimunológica 9. Em resposta a essas limitações, vários métodos sem soro foram desenvolvidos para cultivar células epiteliais LG (LGECs) tanto de camundongos quanto de humanos. Por exemplo, Ueda et al. empregaram com sucesso um método sem soro para cultivar LGECs de camundongosrecém-nascidos 10. No entanto, esse método era limitado pela incapacidade de passar as células por subculturas e pela necessidade de um grande número de glândulas neonatais para obter LGECs suficientes. De forma semelhante, Kobayashi et al. desenvolveram um sistema de cultura sem soro com toxina de cólera, mas enfrentaram dificuldades para manter a morfologia celular durante a passagem11. Avanços recentes incluem o desenvolvimento por Zhang et al. de um sistema de cultura 3D para células-tronco LG de camundongos e o sistema de cultura organoide LG de Bannier-Hélaouët et al. para camundongos ehumanos 12,13,14,15. No entanto, esses sistemas dependem de formulações complexas de meio com múltiplas pequenas moléculas, fatores de crescimento e aditivos, complicando o processo de cultivo e limitando a escalabilidade. Esses desafios destacam a necessidade de um sistema de cultura simplificado e eficaz, sem soro, que possa facilitar a expansão eficiente dos LGECs, mantendo suas características proliferativas e de caule/progenitor para futuras aplicações terapêuticas e pesquisas.

Nos últimos anos, o rápido desenvolvimento da reprogramação química mediada por pequenas moléculas introduziu novas estratégias para manter e expandir células adultas primárias invitro 16. Ao regular as vias de sinalização intracelular, as interações célula-matriz e a adesão celular, pequenas moléculas aumentam significativamente a proliferação e plasticidade celular, melhorando a eficiência da expansão celular e o controle dodestino 17. Devido à sua produção controlável, baixa imunogenicidade e integração não genômica, pequenas moléculas são ideais para construir sistemas in vitro para células epiteliais adultasem expansão 16. Combinações de diferentes pequenas moléculas demonstraram manter efetivamente a expansão in vitro de vários tipos celulares primários, incluindo células-tronco epiteliais da pele, córnea econjuntivais 18,19,20. Portanto, desenvolver uma estratégia baseada em pequenas moléculas para expandir as LGECs mostra potencial para aplicações futuras tanto em pesquisas quanto em contextos terapêuticos.

Um sistema simples e eficiente de cultura sem soro foi desenvolvido nesse protocolo usando duas pequenas moléculas, Y27632 e SB431542 (2C), para apoiar a expansão dos LGECs. Ao combinar as vantagens dessas duas moléculas, foi estabelecido um sistema sem soro tanto para culturas 2D quanto 3D. LGECs cultivados com 2C apresentaram alta capacidade proliferativa e características de células-tronco/progenitoras, mantendo a morfologia epitelial típica após pelo menos 10 passagens in vitro. Na cultura 3D, as LGECs não apenas mantiveram características das células-tronco/progenitoras, mas também apresentaram a capacidade de se diferenciar ainda mais em estruturas secretoras após a remoção do 2C, formando estruturas microglandulares com função secretora. Este sistema sem soro é adequado para modelos in vitro da fisiologia e patologia LG, além de fornecer uma fonte substancial de células para engenharia de tecidos LG e aplicações regenerativas. No entanto, o protocolo atual oferece apenas uma exploração preliminar da cultura 3D. A cultura 3D de longo prazo está além do escopo desta pesquisa neste estágio. É importante notar que este método foi desenvolvido especificamente para LGECs adultos de camundongos e pode não ser aplicável a outras espécies sem otimização adicional.

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Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as regulamentações da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) e do Comitê de Ética Experimental de Animais da Universidade de Jilin e da Universidade de Xiamen.

NOTA: Todos os procedimentos de cultura celular foram realizados em um gabinete de biossegurança esterilizado por UV na sala de operações celular.

1. Cultura primária dos LGECs

  1. Isolamento do tecido LG
    1. Eutanasiar camundongos anestesiados C57BL/6J (6-8 semanas de idade) por luxação cervical e desinfetar a região da orelha (ao redor do LG) com etanol a 75% para evitar contaminação.
    2. Faça uma incisão do canto externo até a pele abaixo da orelha para expor o LG. Usando pinças e tesouras lisas e estéreis, separe cuidadosamente o LG do tecido ao redor (glândulas parótidas e tecido conjuntivo) sob um microscópio de dissecação para obter o LG.
    3. Coloque o LG em um meio coletor de tecido pré-resfriado (DMEM com 10% de Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina) em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL, mantendo o tecido no gelo para minimizar a degradação.
  2. Preparação de tecidos
    1. Transfira os LGs para um novo meio de coleta de papel frio em um recipiente de 3,5 cm.
    2. Remova qualquer pelo residual de camundongo, depois retire a cápsula de tecido conjuntivo que envolve os LGs. Isole o tecido glandular usando pinças lisas para remover o tecido conjuntivo entre os lóbulos.
      NOTA: Certifique-se de que a cápsula na superfície do LG e o tecido conjuntivo entre os lóbulos sejam completamente removidos para expor os ductos entre os lóbulos, o que facilitará a penetração da solução digestiva durante o processo digestivo subsequente.
    3. Transfira o tecido para um novo meio coletor e lave por 5-10 minutos para evitar contaminação.
  3. Digestão enzimática
    1. Coloque os LGs em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL contendo solução digestiva (meio sem soro suplementado com 2 mg/mL de Dispase II e 2 mg/mL de Colagenase A). (Tabela Suplementar 1).
      NOTA: 1 mL de solução digestiva é necessário para 4 LGs.
    2. Disseque finamente o tecido LG usando microtesouras em pequenos pedaços (aproximadamente 0,5-1 mm³) dentro do tubo.
    3. Incube o tubo da microcentrífuga a 37 °C com 5% deCO2 por 2,5 a 3 horas. A cada 30-60 minutos, misture suavemente o tecido na solução digestiva para garantir uma digestão enzimática completa.
  4. Isolamento e colheita dos LGECs
    1. Agite o tubo da microcentrífuga várias vezes após concluir o tempo de digestão. Pipete a solução digestiva várias vezes para quebrar o tecido em células únicas ou pequenos aglomerados celulares. Observe ao microscópio para confirmar o progresso da digestão.
      NOTA: Quando não restam partículas visíveis na solução digestiva e grandes números de células individuais, assim como agregados celulares em forma de ducto, são observados ao microscópio, o processo de digestão interrompe.
    2. Centrifuge o tubo a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente, depois descarte o meio digestivo.
    3. Ressuspenda a célula em 1 mL de DPBS estéril e centrifuge novamente a 1000 x g por 3 minutos em temperatura ambiente para remover quaisquer enzimas digestivas restantes.
    4. Repita o passo 1.4.3, remova o sobrenadante e resuspenda a cápsula celular em 500 μL de meio sem soro.
  5. Semeadura e cultura primária dos LGECs
    1. Prepare o meio de cultivo de LGECs suplementando meio sem soro com 1% de penicilina-estreptomicina e 2C (10 μM Y27632 e 10 μM SB431542). (Tabela Suplementar 1)
    2. Semeie as células em placas de cultura padrão, não tratadas, de 24 poços, com uma densidade de 7,5 x 10³ células/cm², utilizando meio 2C sem soro.
    3. Após a semeadura, toque suavemente as bordas da placa de cultura para garantir uma distribuição uniforme da célula. Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C com 5% deCO2.
    4. Mude o meio de cultivo pela primeira vez 72 horas após a semeadura. Depois disso, mude o meio a cada 2-3 dias.
      NOTA: Evite perturbar a cultura durante as primeiras 72 horas. Para a primeira troca de meio, não lave as células com DPBS. Basta remover o meio antigo e adicionar meio fresco.

2. Subcultura de LGECs

NOTA: Subcultura quando a confluência celular atinge 80-90%, o que normalmente ocorre aproximadamente 14 dias após a cultura primária.

  1. Remova o meio de cultivo e lave suavemente as células duas vezes com DPBS estéril.
  2. Adicione 250 μL de 0,25% de Tripsina-EDTA e incube a 37 °C com 5% deCO-2 por 10-15 minutos. Quando as junções apertadas se dissociam e as células arredondam, adicione um volume igual de Solução Inibidora de Tripsina definida para interromper a digestão.
    NOTA: Se células aderentes planas e grandes forem observadas durante a cultura primária, trate a cultura com 0,25% de Tripsina-EDTA por 5 minutos para remover essas células heterogêneas. Depois, trate novamente a cultura com 0,25% de Tripsina-EDTA por mais 5 minutos para digerir melhor e obter uma população mais pura de LGECs para passagem subsequente.
  3. Misture a suspensão da célula pipetando com uma pipeta de 1 mL, depois transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrifuge a 1000 x g por 3 minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernadante.
  4. Lave as células com DPBS estéril e centrifuge novamente para coletar os LGECs.
  5. Resuspenda os LGECs em meio de cultura 2C e sementes em uma proporção 1:2 para subcultura. Misture suavemente as células agitando a placa de cultura e incube a 37 °C com 5% deCO2.
    NOTA: Subcultivar em uma proporção 1:2 significa que, uma vez que a confluência celular atinge 80-90%, os LGECs são digeridos de uma placa de poço e distribuídos uniformemente em duas novas placas de poço.
  6. Mude o substrato no terceiro dia após a semeadura e depois troque o substrato a cada 2-3 dias, dependendo da condição da célula.
  7. Observe a morfologia celular diariamente sob um microscópio de contraste de fase invertido e documente com fotografias.

3. Cultura tridimensional (3D) dos LGECs

NOTA: O experimento de cultura 3D usa LGECs P1. Quando os LGECs P1 atingem 80-90% de confluência após 7 dias de cultura com 2C, eles são usados para cultura 3D.

  1. Etapas de preparação
    1. Transfira o gel matriz (Tabela Suplementar 1) do freezer de -20 °C para uma geladeira de 4 °C para descongelamento durante a noite.
    2. Coloque as ponteiras de pipeta necessárias no freezer a -20 °C para garantir o pré-resfriamento adequado.
    3. Pré-aqueça a placa de cultura de 24 poços colocando-a em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 horas antes de iniciar a cultura 3D.
    4. Prepare uma caixa de gelatina e coloque vários tubos de microcentrífuga de 1,5 mL nela para pré-resfriamento. Esterilize a caixa de gelo em um armário de biossegurança antes do uso.
  2. Cultura 3D dos LGECs
    1. Obtenha LGECs P1, conforme descrito nos passos 2.1 a 2.4.
    2. Ressuspenda o pellet celular em meio de cultivo 2C e ajuste a densidade celular para 1 × 10⁴ células por 10 μL.
    3. Pegue o gel matriz descongelado da geladeira de 4 °C e as pontas da pipeta pré-resfriadas do freezer de -20 °C, e coloque-os na caixa de gelo dentro do armário de biossegurança.
    4. Remova a placa de cultura pré-aquecida de 24 poços da incubadora e coloque-a no armário de biossegurança.
    5. Adicione um volume apropriado da suspensão celular, misturado com gel matricial em proporção 1:1, usando pontas de pipeta pré-resfriadas. Misture delicadamente para garantir uma distribuição uniforme.
    6. Pipete 20 μL da mistura do passo 3.2.5 cuidadosamente no centro de cada poço da placa pré-aquecida de 24 poços.
    7. Inverta a placa e incube-a em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 30 minutos para permitir que o gel da matriz solidifique.
    8. Depois que o gel da matriz solidificar, adicione 600 μL de meio de cultura 2C a cada poço.
    9. Incube a placa de cultura em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 14 dias. Mude o meio no terceiro dia após a semeadura e a cada 2-3 dias depois, dependendo da condição da célula.
    10. Observe diariamente a formação de esferoides 3D sob um microscópio de contraste de fase invertido e capture imagens para documentação.
  3. Diferenciação dos esferoides 3D LGEC
    1. Cultura 3D esferoides LGEC conforme descrito na etapa 3.2.
    2. Após 7 dias de cultura, remova o meio de cultura de 2°C e lave suavemente as células duas vezes com DPBS para remover o resíduo de 2°C. Tenha cuidado para não mexer no gel da matriz.
    3. Adicione um meio sem soro sem 2C (Null) e continue a cultura por mais 7 dias para induzir a diferenciação.
    4. Mude o meio a cada 2-3 dias durante o período de cultivo.
    5. Observe diariamente as mudanças morfológicas dos esferoides 3D induzidos sob um microscópio de contraste de fase invertido e capture imagens para documentação.

4. Embedding e congelamento de esferoides 3D LGEC diferenciados

NOTA: A diferenciação dos esferoides 3D é induzida conforme descrito na seção 3.3. Após 7 dias de diferenciação, siga os passos abaixo para a incorporação ótima da temperatura de corte (OCT) e o congelamento dos esferoides 3D diferenciados.

  1. Aspire o meio de cultura ao longo das bordas do poço. Lave suavemente os esferoides diferenciados três vezes com DPBS estéril.
  2. Adicione 1 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% ao poço em um gabinete de biossegurança ou exaustor de fumaça e fixe os esferoides em temperatura ambiente por 10 minutos.
  3. Lave os esferoides suavemente três vezes com DPBS estéril, cada lavagem durando 10 minutos, para remover o fixador.
  4. Use uma espátula para raspar cuidadosamente a estrutura em forma de cúpula em gel em forma de matriz esferoide 3D e transfira para um tubo microcentrífuga de 5 mL contendo 20% de solução de sacarose.
  5. Incube o tubo durante a noite a 4 °C até que a estrutura da cúpula se estabilize no fundo do tubo.
  6. Remova a estrutura em cúpula da solução de sacarose, remova cuidadosamente qualquer resíduo de sacarose e a insopere no composto OCT. Congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
  7. Antes de tingir, prepare seções de 10 μm de espessura usando um micrótomo congelante.

5. Detecção da função de secreção de esferoides 3D diferenciados de LGEC

  1. Coleta de amostras
    1. Induzir diferenciação de esferoides 3D conforme descrito na seção 3.3.
    2. Após 7 dias de diferenciação, remova o meio de cultura e lave os esferoides 3D três vezes com DPBS.
    3. Adicione 500 μL de meio sem soro sem 2C e incube a 37 °C com 5% deCO2 por 2 horas.
    4. Colete o meio de cultivo e transfira-o para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL como amostra de base para medir a concentração de lactoferrina (LTF) antes da estimulação da pilocarpina.
    5. Lave os esferoides 3D suavemente três vezes com DPBS estéril.
    6. Adicione 500 μL de meio sem soro contendo 1 μg/mL de pilocarpina e incube os esferoides 3D a 37 °C com 5% deCO-2 por 24 horas.
    7. Após a incubação, colete o meio de cultivo em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL (para medir a concentração de LTF após estimulação por pilocarpia).
    8. Centrifuge as amostras coletadas do meio de cultivo a 4 °C a 1000 × g por 20 minutos. Colete o sobrenadante e armazene-o a -80 °C para uso posterior.
  2. Diluição da amostra
    1. Pegue as amostras do freezer a -80 °C e deixe-as descongelar completamente em temperatura ambiente.
    2. Retire 5 μL da amostra e dilua-a com 495 μL de tampão de diluição da amostra do kit de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) para preparar uma diluição de 100 vezes.
  3. Preparação do reagente
    1. Leve todos os reagentes do kit ELISA à temperatura ambiente 20 minutos antes do uso.
    2. Prepare o tampão de lavagem: Calcule a quantidade necessária com base no número de amostras e dilua o tampão concentrado de lavagem com água destilada (1:24).
    3. Prepare a solução padrão de funcionamento:
      1. Centrifuge o padrão liofilizado a 10.000 × g por 1 minuto. Adicione 1 mL de Padrão de Referência e Diluente de Amostra, deixe agir por 10 minutos e invirta suavemente várias vezes.
      2. Depois de se dissolver completamente, misture bem com uma pipeta. Essa reconstituição produz uma solução funcional de 2000 pg/mL.
    4. Faça diluições seriadas de acordo com as instruções do kit para preparar o seguinte gradiente padrão de concentração: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg/mL.
    5. Prepare a solução de detecção de anticorpos biotinilados:
      1. Calcule o volume necessário para o ensaio (50 μL/poço). Centrifuge o anticorpo de detecção biotinilado concentrado a 800 × g por 1 minuto, depois dilua o anticorpo de detecção biotinilado concentrado 50× em uma solução funcional de 1× usando diluente de anticorpo biotinilado.
      2. Prepare a solução pouco antes do uso, fazendo um pouco mais do que a quantidade calculada, normalmente adicionando entre 100 e 200 μL a mais do que o necessário.
    6. Prepare a solução conjugada de trabalho de peroxidase de raiz-forte (HRP):
      1. Calcule o volume necessário para o experimento (50 μL/poço). Centrifuge o conjugado concentrado de HRP a 800 × g por 1 minuto, depois dilua até uma concentração de trabalho 1x usando diluente conjugado HRP.
      2. Prepare a solução pouco antes do uso, fazendo um pouco mais do que a quantidade calculada, normalmente adicionando entre 100 e 200 μL a mais do que o necessário.
  4. Procedimento de ensaio ELISA
    1. Determine os poços para o padrão diluído, o branco e as amostras, com 3 réplicas para cada um. Adicione 25 μL da solução de trabalho padrão, solução em branco ou amostra diluída nos poços correspondentes. Cubra a placa com o selante fornecido no kit e incube a 37 °C por 90 minutos.
      NOTA: As soluções devem ser adicionadas na parte inferior do poço da placa micro ELISA. Evite tocar na parede interna e causar espuma o máximo possível.
    2. Decante o líquido dos poços sem lavar. Adicione imediatamente 50 μL da solução ativa de anticorpos biotinilados para detecção em cada poço. Cubra a placa com um novo selante e incube a 37 °C por 60 minutos.
    3. Decante o líquido dos poços e adicione 350 μL de tampão de lavagem preparado a cada poço. Deixe de molho por 1 minuto, depois aspire ou decante o líquido de cada poço e seque com papel absorvente limpo. Repita essa etapa de lavagem 3 vezes.
      NOTA: Não deixe que os poços sequem durante o processo de lavagem.
    4. Adicione 50 μL da solução conjugada HRP preparada a cada poço. Cubra a placa com um novo selante e incube a 37 °C por 30 minutos.
    5. Decante o líquido dos poços e repita o processo de lavagem cinco vezes com tampão de lavagem, conforme descrito no passo 5.4.3.
    6. Adicione 50 μL de reagente substrato a cada poço. Cubra a placa com um novo selante e incube a 37 °C no escuro por 15 minutos.
    7. Adicione 25 μL de solução de parada a cada poço para terminar a reação. Certifique-se de que a solução de parada seja adicionada na mesma ordem da solução substrato.
    8. Determine a densidade óptica (valor OD) de cada poço imediatamente a 450 nm usando um leitor de microplaca.

6. Isolamento de RNA

  1. Coleta de amostras
    1. Para tecido LG
      1. Isole o tecido LG extraorbital de camundongos adultos conforme descrito na seção 1.1.2-1.1.2.
      2. Imerga o tecido LG recém-isolado em PBS para lavar qualquer sangue.
      3. Enxugue a umidade superficial do LG com papel de filtro e coloque o tecido em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de Reagente de Extração de RNA (Tabela Suplementar 1), mantendo o tubo no gelo.
        NOTA: Realize etapas de moagem antes da extração de RNA para garantir a lise completa do tecido.
      4. Adicione duas esferas de moagem de aço limpas ao tubo da microcentrífuga e depois coloque o tubo em um moedor pré-resfriado, de alta velocidade e baixa temperatura.
      5. Defina os parâmetros do moedor: frequência 70 Hz, tempo de moagem 45 s, tempo de pausa 15 s e repita por 10 ciclos. Aperte a alça da tampa do moedor e comece a moer.
      6. Coloque o tubo sobre gelo ou armazene-o a -80 °C para extração subsequente de RNA após o processo de moagem.
    2. Para LGECs
      1. Remova o meio de cultura e lave as células três vezes com DPBS estéril quando as LGECs atingirem 80-90% de confluência.
      2. Adicione 600 μL de reagente de extração de RNA a cada poço (para uma placa de 24 poços) e incube em temperatura ambiente por 5-10 minutos.
      3. Use uma pipeta de 1 mL para pipetear repetidamente a solução do reagente de extração de RNA em cada poço para garantir a lise celular completa.
      4. Transfira a solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      5. Coloque o tubo sobre gelo ou armazene-o a -80 °C para a extração subsequente de RNA.
    3. Para esferoides LGEC 3D
      1. Colete esferoides 3D LGEC indiferenciados e diferenciados cultivados por 14 dias, conforme descrito nos passos 3.2-3.3. Adicione 1 mL de solução digestiva (meio sem soro contendo 1 mg/mL Dispase II) em cada poço, garantindo que a estrutura em forma de cúpula em gel em forma de matriz esferoide 3D esteja totalmente coberta. Incube a 37 °C com 5% deCO2 por 30 minutos.
      2. Transfira a solução digestiva contendo os esferoides 3D para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL usando uma pipeta de 1 mL. Centrifuge a 1000 × g por 3 minutos para coletar o pellet esferoide.
      3. Lave o pellet com 1 mL de DPBS e centrifuge a 1000 × g por 3 minutos para coletar o pellet novamente.
      4. Adicione 600 μL de reagente de extração de RNA (por 20 μL de gel matricial) e incube em temperatura ambiente por 5-10 minutos.
      5. Misture cuidadosamente usando uma pipeta de 1 mL para garantir a lise completa dos esferoides 3D.
      6. Coloque o tubo sobre gelo ou armazene-o a -80 °C para a extração subsequente de RNA.
  2. Extração de RNA
    NOTA: Use equipamentos de proteção individual apropriados (jaleco, luvas, máscara) e realize todos os procedimentos envolvendo clorofórmio e isopropanol em uma exaustora exaustiva. Descarte os fluxos de resíduos químicos em recipientes designados para resíduos perigosos, rotulados para geração de resíduos perigosos, seguindo protocolos institucionais de descarte de resíduos.
    1. Adicione clorofórmio (volume de 1/5 do reagente de extração de RNA) ao tubo da centrífuga contendo a amostra de RNA no Reagente de Extração de RNA (do passo 6.1).
      NOTA: Realize o procedimento em uma exaustão de fumo.
    2. Misture bem usando um vórtice e incube em temperatura ambiente por 10 minutos até a separação de fase.
    3. Centrifuge a 14.000 x g por 10 minutos a 4 °C.
      NOTA: Após a centrifugação, o líquido se separa em três camadas, com o RNA na fase aquosa mais superior transparente.
    4. Prepare um novo tubo de centrífuga livre de RNase de 1,5 mL e adicione isopropanol (metade do volume do reagente de extração de RNA) em uma exaustora exausteira.
    5. Pipete cuidadosamente a fase aquosa superior transparente (metade do volume do reagente de extração de RNA) cuidadosamente no novo tubo livre de RNase.
      NOTA: Tenha cuidado para não contaminar a camada do meio ao pipetar.
    6. Inverta o tubo várias vezes para misturar e incubar em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois, centrifuge novamente a 14.000 x g por 10 minutos a 4 °C.
    7. Descarte o sobrenadante e adicione 500 μL de etanol a 75% para lavar o pellet invertendo o tubo. Centrifuge novamente a 14.000 x g por 5 minutos a 4 °C.
    8. Repita o passo 6.2.7. Descarte o sobrenadante e realize uma centrifugação rápida para remover qualquer líquido residual.
    9. Coloque o tubo sobre gelo na exaustor, abra a tampa e deixe secar ao ar por 10-20 minutos até que o pellet branco fique semitransparente.
    10. Adicione 20 μL de água sem RNase para dissolver o pellet. Meça a concentração e pureza do RNA usando um espectrofotômetro.
      NOTA: Se a concentração de RNA for muito alta, dilua com uma quantidade adequada de água livre de RNase.
    11. Coloque a solução de RNA sobre gelo ou armazene-a a -80 °C para o processo subsequente de transcrição reversa.

7. RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)

  1. Transcrição reversa
    1. Adicione os seguintes componentes em sequência ao tubo de reação PCR conforme as instruções do fabricante: 800 ng de RNA total (calcule o volume com base na concentração), 4 μL de 5x All-in-One SuperMix para q-PCR, 1 μL de removedor de gDNA e água sem RNase para elevar o volume total a 20 μL.
    2. Misture os componentes com cuidado. Ajuste a máquina de PCR para as seguintes condições: 55 °C por 6 minutos, 80 °C por 1 minuto e depois 12 °C indefinidamente.
    3. Armazene o cDNA a -20 °C ou mantenha-o no gelo para o processo qRT-PCR após a reação de transcrição reversa ser concluída.
  2. qRT-PCR
    1. Prepare a solução pré-mix qRT-PCR para direcionar diferentes genes da seguinte forma: 5 μL de 2x Green qPCR SuperMix, 0,2 μL de Primer Direto (10 μM), 0,2 μL de Primer Reverso (10 μM) e 3,6 μL de água sem nuclease. Misture delicadamente e coloque no gelo.
    2. Adicione 9 μL da pré-mistura qRT-PCR (preparada no passo 7.2.1) e 1 μL de cDNA (preparado no passo 7.1) nos tubos qRT-PCR conforme o desenho experimental.
    3. Centrifuge os tubos a 1000 × g em temperatura ambiente por 2 minutos.
    4. Coloque os tubos na máquina de PCR quantitativa de fluorescência para detecção.
      NOTA: Use um método em três etapas com o seguinte programa conforme as instruções do fabricante do reagente: 94 °C para 30 s, 94 °C para 5 s, 60 °C para 15 s e 72 °C para 10 s. Comece a pedalar a partir do passo 2 por 40-45 ciclos.
    5. Realize análise quantitativa usando o método comparativo CT (2-ΔΔCt).
      NOTA: Cada conjunto de dados deve ser repetido pelo menos três vezes independentes para garantir a confiabilidade dos resultados.

8. Coloração por imunofluorescência

NOTA: A coloração por imunofluorescência é realizada em LGECs cultivados em placas de 24 poços com taxas de confluência de 70-80% ou em seções congeladas de estruturas 3D diferenciadas de LGECs.

  1. Para LGECs
    1. Remova o meio de cultivo dos poços e lave as células três vezes com PBS.
    2. Adicione 500 μL de PFA a 4% em cada poço em um gabinete de biossegurança ou exaustor de fumaça e incube em temperatura ambiente por 15 minutos para fixar as células.
    3. Lave as células três vezes com PBS, cada lavagem durando 5 minutos.
    4. Adicione 500 μL de 0,2% de Triton X-100 para cobrir as células e incube em temperatura ambiente por 20 minutos para permeabilizar a membrana celular.
    5. Lave as células três vezes com PBS, cada lavagem durando 10 minutos.
    6. Remova o PBS e use um marcador de imunohistoquímica para desenhar um círculo ao redor de cada poço da placa de 24 poços. Adicione 50 μL de 2% de BSA a cada poço para cobrir as células. Incube em temperatura ambiente por 1 hora para bloquear.
    7. Remova o BSA e adicione 50 μL do anticorpo primário diluído (Tabela Suplementar 1) para cobrir os LGECs. Incube a 4 °C por 16-18 horas.
    8. Remova o anticorpo primário e repita o passo 8.1.5.
    9. Adicione 50 μL de anticorpos secundários fluorescentes a cada poço para cobrir os LGECs. Incube em temperatura ambiente no escuro por 1 hora.
    10. Repita o passo 8.1.5, evitando exposição à luz.
    11. Adicione 50 μL de solução 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para cobrir os LGECs e observe a coloração sob um microscópio de fluorescência.
  2. Para esferoides LGEC 3D
    1. Prepare as seções congeladas do esferoide 3D LGEC conforme descrito no passo 4. Realize a coloração por imunofluorescência conforme descrito nos passos 8.1.2-8.1.11.

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Resultados

Estabeleça um sistema de cultura LGECs livre de soro usando 2C
Nesse protocolo, o objetivo era estabelecer um sistema de cultura mais simples e eficiente para expandir os LGECs primários de camundongos. Após extensa triagem, uma combinação 2C sem soro, composta exclusivamente por Y27632 e SB431542, foi desenvolvida com sucesso, permitindo a expansão in vitro de longo prazo dos LGECs. Após digestão de enzimas mistas, as LGECs primárias começaram a aderir e for...

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Discussão

Como descrito na Introdução, vários sistemas de cultura sem soro para células LG foram desenvolvidos nos últimosanos 10, 11, 12, 13. No entanto, muitos desses métodos apresentam limitações, incluindo a baixa proliferação celular e a incapacidade de alcançar uma expansão em larga escala in vitro10,11<...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82471048, 82271045); o Programa de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (JCYJ20240813145510014); o Projeto Especial de Talentos em Pesquisa em Saúde da Província de Jilin (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); e o Projeto de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia da Província de Jilin (YDZJ202601ZYTS389).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
 -20° C Geladeira de ultra baixa temperaturaHaier
 -80° C Geladeira de ultra baixa temperaturaHaier
0,25% Tripsina-EDTAGibco25200056
Tubo microcentrífuga de 1,5 mL  KirgenKG2211Livre de Rnase
Prato de cultura celular de 35mmLABSELECT12111
4 & deg; C GeladeiraHaier
4% de paraformaldeído (PFA)ServicebioG1101
4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Yeasen708939ES03Armazene a -20 ° C, estoque a 1 mg/mL, 500x, diluir para 1x com 1x PBS
Tubo centrífugo de 5 mL  ACMECAC17457
Tubo centrífuga de 50mL  LABSELECTCT-002-50-SS
Anticorpo anti-alfa músculo liso actina do coelhoAbcamab5694Diluir com o buffer de diluição de anticorpos em 1:100 
Anticorpo anti-AQP5 do coelho  ABclonalA9927Diluir com o buffer de diluição de anticorpos em 1:100 
Anticorpo anti-citoqueratina 14 do coelhoAbcamab181595Dilua com o buffer de diluição de anticorpos em 1:200 
Anti-Citoqueratina 19  Anticorpo de coelhoAbcamab52625Dilua com o buffer de diluição de anticorpos em 1:400 
Anticorpo anti-Ki67 do coelhoAbcamab16667Dilua com o buffer de diluição de anticorpos em 1:200 
Gabinete de biossegurançaSterilGARD
Albumina sérica bovina (BSA) & nbsp;Yeasen36101ES60Loja na 4° C
Camundongos C57BL/6JCentro de Animais de Laboratório da Universidade de Xiamen
Placa de cultura celularLABSELECT1131224-poço
Incubadora celularEppendorf
CentrífugaEppendorf
ClorofórmioHUSHI10006818ATENÇÃO, Realizando operações em uma exaustão
CO2  Incubadora de temperatura constanteEppendorf
Colagênase ARoche10103586001Armazene a -20 ° C, estoque a 200 mg/mL, 100x
Solução definida de inibidor da tripsina (DTI)GibcoR007100
Kit Completo DermaLife K Keratinocyte Medium (Médio sem soro) Linha da VidaLL-0007Coloque na 4 & deg; C
D-HanksBiosharpBL559A & nbsp;Usado para diluir a Dispase II
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD4540Usado para diluir Y27632 e SB431542
Dispase IISigmaD4693Armazene a -20 ° C, estoque a 200 mg/mL, 100x
DMEM básico (1X)GibcoC11995500BT
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorvido Cruzado, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Dilua com o buffer de diluição de anticorpos em 1:300
Soro Fosfatado Tamponado de Dulbecco (DPBS)ServicebioG4200
Absoluto do etanolHUSHI10009218CUIDADO, Use para preparar outras diluições de etanol  
Microtomo de congelamentoLeica
Moedor de alta velocidade e baixa temperaturaServicebio
Microscópio de fluorescência invertidaLeica
Microscópio invertidoOlympus
Isopropanol HUSHI80109270
Microscópio Confocal de Varredura a Laser FV3000OLYMPUS
Centrífuga de baixa temperatura e alta velocidadeEppendorf
kit de ensaio imunossorvente ligado à enzima LTF (ELISA)  ElabscienceE-MSEL-M0047Armazene a -20 ° C
Gel matricial (Matrigel)82703MogengelAliquot e armazene em -20 & deg; C
MicropipetadorEppendorf
Leitor de microplacasThermo Fisher Scientific
Água livre de nucleaseBiosharpBL510B
Composto OCTScigen4586
PBS,1 e horários; (pH7.4)ServicebioG4202
Amplificador de PCRBIO-RAD
Penicilina-EstreptomicinaBiosharpBL505A
Penicilina-Estreptomicina-AnfotericinaBiosharpBL142A
Kit PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601-01-V2Armazene a -20 ° C
PerfectStart Uni RT& Kit qPCRTransGen BiotechAUQ-01Armazene a -20 ° C
Pilocarpina AladdinP424663Armazene a -20 ° C, 2500x
Primer AQP5  sequência:
Forward:CATGAACCCAGCCCGATC
TT
Reverse:CTTCTGCTCCCATCCCAT
CC		Sangon Biotech
Primer K14  sequência:
Frente:CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
Reverso: AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		Sangon Biotech
Primer K15  sequência:
Frente:GAGGTGGCGTCTAACACA
GA
Reverso:TCTGAGCCTCCATCCATCAC
AG		Sangon Biotech
Primer K19  sequência:
Frente:ATTACTGCCCTGAGGAGC
CA
Reverso:TTCAGCTCCTCAATCCGA
GC		Sangon Biotech
Primer K5  sequência:
Frente:CTCAGAGCTGAGGAACAT
GC
Reverso:AGCTCCGCATCAAAGAAC
AT		Sangon Biotech
Primer Ki67  sequência:
Frente:ACCATCATTGACCGCTCC
TT
Reverso:TTGACCTTCCCCATCAGG
GT		Sangon Biotech
Primer LTF  sequência:
Frente:CAGGAGCCAACAAATGTG
CC
Reverso:TTGTACTGGTCCCTTTCG
GC		Sangon Biotech
Primer P63  sequência:
Frente: ATGTCACCGAGGTTGTG
AAA
Reverso: GAATTCAGTGCCAACCTGTG		Sangon Biotech
Primer SOX10  sequência:
Frente:ATCAGCCACGAGGTAATG
TCCAAC
Reverso:ACTGCCCAGCCCGTAGCC		Sangon Biotech
Primer α-SMA  sequência:
Frente:CTCCCTGGAGAAGAGCTA
CG
Reverso:CGCTGACTCCATCCCAAT
GA		Sangon Biotech
Instrumento de PCR quantitativa de fluorescência em tempo realRoche
Reagente de Extração Total de RNA do isolador de RNAVazymeR401-01ATENÇÃO, Realizando operações em uma exaustão
SB431542 ApexbioA8249Armazene a -20 ° C, estoque em 20 mM, 2000x
Espectrofotômetro NanoDrop 1000Thermo Fisher ScientificMede a concentração de RNA
SacaroseMacklinS818046Dissolva com água destilada
Triton X-100SolarbioT8200
Sistema de purificação de água ultra puraMillipore
Buffer universal de diluição de anticorposEpizimaPS119Coloque na 4 & deg; C
Y27632 ApexbioB1293Armazene a -20 ° C, estoque em 20 mM, 2000x

Referências

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