Visualização e Análise Quantitativa da Ativação de PARP1/PARP2 induzida por genotoxinas em células usando um repórter baseado em proteína de fusão fluorescente

Summary

Aqui, descrevemos um método para visualização celular, localização subcelular e análise quantitativa de focos enriquecidos com poli(ADP-ribose) (PAR) em células fixas de mamíferos. Este ensaio possibilita a quantificação dos locais de ativação de PARP induzida por danos ao DNA, incluindo aqueles associados à reparação por excisão de bases ou à quebra de fita simples, nos núcleos de células expostas à genotoxina.

Abstract

Poli(ADP-ribose) (PAR) é um polímero de ADP-ribose sintetizado por quatro membros da família de enzimas ADP-ribose polimerase — PARP1, PARP2, PARP5a e PARP5b. No entanto, apenas PARP1 e PARP2 sintetizam PAR em resposta a quebras de DNA. PAR é definida como uma modificação pós-traducional de proteína, mas também é demonstrado que existe como uma modificação de DNA ou RNA. Os níveis de PAR são ainda regulados pelo PARG, uma glicohidrolase PAR que, junto com PARP1 e PARP2, modula o nível celular de PAR induzido por danos ao DNA. A síntese dinâmica e a degradação da PAR são críticas para seu papel regulatório no reparo do DNA e para a resposta ao dano ao DNA, que por sua vez afeta a reorganização, replicação, transcrição e morte celular. A ativação de PARP1/PARP2 e o acúmulo de PARP podem ser considerados locais de reparo contínuo por excisão de bases ou reparo de quebra de fita simples de DNA; no entanto, numerosos ativadores de PARP1/PARP2 também estão associados ao estresse de replicação e a outros processos metabólicos do DNA. Uma vez formadas, as cadeias PAR facilitam o recrutamento de fatores de reparação e resposta ao dano ao DNA (DDR) para locais de dano ao DNA ou insulto genômico por meio de seus domínios de ligação ao PAR (PBDs). Dez PBDs diferentes reconhecem várias regiões da molécula de PAR, incluindo o motivo de ligação ao PAR, o dedo de zinco que se liga ao PAR, o domínio WWE e o macrodomínio, entre outros PBDs. Para facilitar a análise celular da dinâmica do PAR, usamos PBDs fundidos com proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) para otimizar a quantificação celular dos focos de PAR. Descrevemos um ensaio que utiliza um fragmento de RNF146 codificando o domínio PBD/WWE, ligado ao EGFP, para visualizar e quantificar o acúmulo de PAR em locais de insulto genômico e BER ou SSBR em andamento. Descrevemos etapas experimentais, incluindo a produção de partículas lentivirais, transdução da linhagem celular alvo, tratamento de células de mamíferos para induzir danos genômicos ao DNA, aquisição de micrografias de fluorescência confocal e quantificação semi-automatizada dos dados.

Introduction

Este protocolo descreve o ensaio LivePAR, que permite a visualização e análise quantitativa de poli(ADP-ribose) (PAR) em locais de insulto genômico, principalmente associado à reparação por excisão de bases (BER) ou reparação de quebra de fita simples (SSBR), em células^{de mamíferos 1,2,3}. A BER é uma via crucial de reparo do DNA que remove bases danificadas ou modificadas do DNA (para revisões sobre BER e PARilação, veja 4,5,6,7). A BER começa com glicosilases de DNA que reconhecem e excisam bases^{modificadas 4}, deixando um sítio apurínico/apirimidínico (AP), por exemplo, glicosilase de metil-purina (MPG), que excisa as bases metiladas ^8,9, ou 8-oxoxanina glicosilase (OGG1), que excisa 8-oxoG ^9,10. Os sítios AP são então clivados pela endonuclease AP 1 (APE1)11,12,13, criando um corte na espinha dorsal do DNA. Uma polimerase, ou seja, DNA polimerase β (Polβ)^14,15, ajusta e preenche a lacuna usando a fita intacta como modelo e, finalmente, as ligases de DNA selam a fita^{reparada 16,17}, por exemplo, a ligase de DNA I ou a ligase de DNA III.

Os principais atores do BER e SSBR são as poli(ADP-ribose) polimerases 1 e 2 (PARP1/PARP2)18,19,20, enzimas que detectam rapidamente quebras de fitas de DNA durante BER ou SSBR. Ao detectar essas quebras, PARP1/PARP2 catalisa a adição de polímeros de ADP-ribosa a si mesmo e a outras proteínas — um processo chamado PARylation (para revisão,^{veja 6}) — hidrolisando ^NAD+. Isso cria um andaime dinâmico de proteínas (PAR) que recruta outros fatores de reparação de DNA para o local do dano, aumentando a fidelidade do reparo do DNA. Para gerenciar esse andaime dinâmico de PAR, várias proteínas contribuem para a hidrólise e remoção das cadeias de PAR, incluindo a hidrolase aceitadora de ADP-ribose 3 (ARH3), a hidrolase terminal ADP-ribose glicosil 1 (TARG1), a mono-ADP-ribosil hidrolase 1/2 (MacroD1/2) e a poli(ADP-ribose) glicohidrolase (PARG⁾ 6,21,22,23,24,25,26 . No entanto, o PARG é o principal responsável por esse^{processo 21,27} e desempenha um papel crucial na resposta ao dano ao DNA (DDR^)28,29.

Portanto, o PARG está criticamente ligado à função do PARP1 e do PARP2. Enquanto PARP1 e PARP2 criam os polímeros PAR, o PARG atua como uma enzima de "limpeza", hidrolisando esses polímeros e revertendo efetivamente a PARilação^30,31. Esse processo é essencial para completar tanto o BER quanto o SSBR e permitir que PARP1/PARP2 sejam reciclados para responder a novos danos ao DNA. Consequentemente, PARP1, PARP2, PARylation e PARG trabalham de maneira coordenada, garantindo reparo eficiente e reversível do DNA por meio do BER e SSBR ^4,6.

A extensão da PARilação pode ser influenciada por vários fatores e desempenha um papel essencial na resposta geral ao dano ao DNA³². Esses fatores incluem a exposição a genotoxinas que adicionam adutos às bases do DNA, como N-metil-N'-nitro-N-nitro-nitrosoganidina (MNNG), metilmetanassulfonato (MMS), peróxido de hidrogênio (_H2O2) ou tert-butil hidroperóxido (tBuOOH). Além disso, a extensão da PARilação pode ser influenciada por moléculas que modulam o processo de PARilação, como o ribosídeo de diidronicotinamida (NRH), precursor do ^NAD+, que potencializa a ativação do PARP ao aumentar os níveis de ^NAD+, ou o FK866, um inibidor do NAMPT, que pode diminuir os níveis de ^NAD+ e regular negativamente a ativação do^{PARP 3}. Por fim, mutações genéticas ou inibição por pequenas moléculas de enzimas como PARP1/PARP2, PARG ou outras proteínas de reparação de DNA (por exemplo, defeitos na BER ou fatores homólogos de recombinação como BRCA1/BRCA2) podem alterar a ativação do^PARP 33,34,35,36.

O ensaio LivePAR utiliza um fragmento da proteína do dedo anelar 146 (RNF146) que codifica um domínio WWE (aminoácidos 100–182), ligado a uma proteína de fluorescência verde aprimorada (EGFP⁾³. O domínio WWE é um domínio globular nomeado em referência aos resíduos conservados triptofano (W) e glutamato (E) em seu sítio^{de ligação 37}. Os domínios da WWE se ligam à iso-ADP-ribose, a menor unidade estrutural interna dentro das cadeias^{PAR 38,39}. RNF146 é uma ligase de ubiquitina E3 que reconhece iso-ADP-ribose^38,40 e é relatada como alvo de proteínas envolvidas na BER (XRCC1, DNA ligase III e PARP1) para a degradação proteassomal⁴¹. Vincular esse domínio da WWE ao EGFP possibilita a visualização e detecção de sítios de PARilação induzidos por genotoxinas em células de mamíferos. Neste protocolo, descrevemos a geração de linhagens celulares estáveis que expressam o repórter LivePAR (Figura 1A), a indução de danos ao DNA para ativar PARP1/PARP2, a produção de PAR e a aquisição e análise de dados de microscopia de fluorescência confocal (Figura 1).

O plasmídeo pMD2.g(VSVG) fornece a glicoproteína do envelope viral (VSVG), que expande o alcance das células que o vírus pode infectar em comparação com a proteína nativa do envelope do lentivírus. O plasmídeo pRSV-REV fornece a proteína do elemento regulador (REV), que é um transativador crucial que se liga ao RNA viral e ativa a transcrição dos genes virais; É essencial para a replicação viral eficiente. O plasmídeo pMDLg/pRRE fornece vários componentes internos-chave de embalagem, a saber: gag, que codifica as proteínas matriz (MA), capsídeo (CA) e nucleocapsídeo (NC), pol, que codifica as enzimas necessárias para a replicação viral e integração no genoma da célula hospedeira, e o elemento regulador de RNA (RRE), que é um elemento de RNA que aprimora a eficiência da tradução de RNA viral e do embalamento genômico do RNA. O plasmídeo pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (Figura 1A) contém codificação de cDNA para a proteína de fluorescência verde aprimorada (EGFP) que está fundida ao C-terminal do domínio WWE de RNF146 (aminoácidos 100–182), um domínio proteico que se liga às cadeias de poli(ADP-ribose), e o vetor também codifica um cassete de resistência à higromicina. O vírus é isolado do sobrenadante da cultura celular e pode ser armazenado a -80 °C ou usado imediatamente para transdução (Figura 1B).

Protocol

1. Produção de lentivírus

NOTA: Este protocolo utiliza um sistema de embalagem lentiviral^{de terceira geração 42,43} para gerar células que expressam um repórter de PAR geneticamente codificado. Partículas lentivirais são produzidas em células 293FT usando um sistema de quatro plasmídeos que compreende componentes de envelope, regulador e embalagem, juntamente com a construção pLV-EF1A-LivePAR-Hygro que codifica um domínio WWE marcado com EGFP de RNF146, que liga cadeias de poli(ADP-ribose). O vírus resultante é usado para gerar linhagens celulares estáveis para visualização e quantificação do acúmulo de PAR.

1. Cultive células de baixa passagem de 293FT em DMEM contendo 10% de FBS e 1% de Pen/Strep em uma atmosfera umidificada a 37 °C e 5% de_CO2. Certifique-se de que as células 293FT não estejam em cultivo por mais de 3 semanas.
   NOTA: Usamos rotineiramente células de 293FT com números de passagem entre 3 e 10. Células 293FT foram transformadas e imortalizadas pelo grande antígeno T SV40. Essas células possuem alta eficiência de transfecção, essencial para a produção de proteínas recombinantes e estudos de expressão gênica. Eles respondem bem tanto aos métodos de transfecção à base de lipídios quanto a métodos de transdução viral.
2. Placa 1,7 × 10⁵ células de 293FT em um prato de cultura de tecidos de 60 mm em volume final de 5,5 mL de meio de cultura no dia 1. Devolva as células à incubadora por 24 horas.
3. No segundo dia (dia da transfecção), adicione 375 μL de meio DMEM sem FBS e sem caneta/estreptococo a um tubo de microcentruífuga estéril de 1,5 mL. Depois, adicione 10 μL de um reagente de transfecção à base de lipídios, 4 μg do plasmídeo pLV-EF1A-LivePAR-Hygro, 2 μg do plasmídeo pMD2.g(VSVG), 2 μg do plasmídeo pRSV-REV e 2 μg do plasmídeo pMDLg/pRRE. Bata suavemente no tubo de microcentrífuga para misturar o meio, o reagente de transfecção e o DNA plasmídico (evite o vórtice). Incube por 15–30 minutos em temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de DNA/reagente de transfecção.
4. Adicione a mistura plasmídea/reagente de transfecção ao prato de 60 mm contendo as células de 293FT a serem transfectadas sem remover o meio, em gotas em gota. Devolva as células à incubadora por 48 horas.
   NOTA: Esse período permite a produção e liberação das partículas lentivirais no meio de crescimento.
5. No quarto dia, colete o meio de cultivo das células transfectadas de 293FT para isolar as partículas de lentivírus. Filtre através de um filtro estéril de 0,45 μm para separar os detritos celulares das partículas lentivirais.
6. Determine o título do lentivírus com os reagentes disponíveis (opcional).
   NOTA: Este método geralmente gera de 10⁵ a^{10 6} unidades infecciosas por mL (IFU/mL), o que se correlaciona com uma multiplicidade aproximada de infecção (MOI) de ~5 quando usado conforme descrito na etapa de transdução abaixo.
7. Aliquota o meio contendo as partículas de lentivírus em quatro crioviais estéreis (1,0 mL por tubo) e armazenados a -80 °C.

2. Transdução

NOTA: Esta seção descreve o protocolo de transdução lentiviral usado para introduzir um transgene em linhagens celulares (Figura 1B). Tem sido consistentemente eficaz em nosso laboratório^{1, 3, 33, 37, 44, 45}.

1. Cultive uma linha celular de escolha (número de passagem baixo) no meio apropriado em uma atmosfera umidificada a 37 °C e 5% de_CO2.
   NOTA: Comece com uma passagem inicial do tipo celular necessário. Um novo frasco de células deve ser descongelado e levado pelo menos uma vez antes de ser semeado para transdução.
2. No dia 1, a semente 1 × 10⁵–1,5 × 10^{células de 5} por poço, em cada poço de uma placa de 6 poços em 2 mL de meio de crescimento. Devolva as células à incubadora por 24 horas.
3. No segundo dia (dia da transdução), certifique-se de que as células estejam entre 20% e 40% confluentes. Adicione 1 mL de vírus, 1 mL de meio de crescimento e 2 μL de polibreno (2 mg/mL de estoque) a um tubo cônico de 15 mL e misture suavemente por inversão (evite vórtize).
   NOTA: A polibrena é usada durante a transdução de lentivírus para evitar a repulsão eletrostática entre as partículas virais e a membrana celular. Como a polibrena é carregada positivamente, ela interage com as glicoproteínas virais carregadas negativamente, neutralizando sua carga. Além disso, a polibrena se liga aos glicosaminoglicanos no meio de cultura celular, impedindo sua interação com o vírus. Portanto, a Polybrene aumenta muito a eficiência da transdução.
4. Remova o meio de crescimento da placa de 6 poços e adicione a mistura de vírus/meio/polibrena a cada poço. Coloque as células com a mistura de transdução em uma incubadora contendo uma atmosfera umidificada a 32 ^°C e 5% de_CO2 por 16–18 horas.
   NOTA: Incubar células a 32 °C durante a noite durante a transdução lentiviral é uma prática comum, embora não essencial, que aumenta significativamente a eficácia da infecção viral. Reduzir a temperatura desacelera o metabolismo celular, reduzindo assim as defesas celulares e aumentando a suscetibilidade à infecção viral.
5. No terceiro dia, substitua o meio das células transduzidas pelo vírus por meio novo e move-as para uma incubadora a 37 °C. Incube por 48 horas.
   NOTA: Esses 2 dias são suficientes para que as células produzam o transgene RNF146(100–182)-EGFP e se tornem resistentes à higromicina.
6. Para desenvolver as linhas celulares policlonais estáveis resultantes que expressam o transgene RNF146(100–182)-EGFP, inicie a seleção da higromicina após 2 dias de incubação, conforme indicado no passo 2.5.
   1. Alternativamente, expandir essa população de células transduzidas na ausência de higromicina e usar para análise de PAR ao longo dos próximos 10–14 dias (transdução transitória), como descrito^{anteriormente 1}.
7. Transfira as células para uma placa de 100 mm assim que crescam na presença de higromicina e expanda o quanto necessário.
8. Prepare estoques criogênicos das células transduzidas para uso futuro.
9. Valide a expressão do transgene RNF146(100–182)-EGFP por microscopia confocal conforme descrito na seção 3. O transgene RNF146(100–182)-EGFP será expresso por toda a célula.
10. Validar a expressão do transgene RNF146(100–182)-EGFP por imunobloting, conforme descrito em outro^{lugar 1,37}.

3. Microscopia e análise confocal

NOTA: Esta seção do protocolo detalha a preparação dos coverslips, a semeadura das células que expressam LivePAR, a exposição a tratamentos (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi e/ou NRH) e a preparação de células fixas em lâminas de microscópio para imagem confocal e análise de focos PAR (Figura 1C). Também descreve o uso do software ImageJ e de uma macro personalizada para a quantificação semi-automatizada dos focos PAR. Esse protocolo pode ser usado para investigar a influência de vários fatores (por exemplo, pequenas moléculas, eliminações da proteína BER) na PARilação dependente de danos ao DNA e tem sido empregado com sucesso em nosso laboratório ^34,37.

1. Preparação do coverslip
   1. Deixe de molho 20 × cobertores de 20 mm por 20 minutos em éter dietílico em um recipiente de vidro dentro de uma exaustor.
      NOTA: Use uma exaustão ao trabalhar com éter dietílico devido à sua inflamabilidade e possíveis riscos.
   2. Remova o éter dietílico e lave as coberturas em concentrações decrescentes de etanol [100%, 70%, 50%, depois 0% (ddH₂O)].
   3. Remova a água e deixe as mantas de molho por 20 minutos em 1 N HCl com uma agitação suave.
   4. Remova o HCl e lave os slips 3x com_{ddH 2}0.
   5. Armazene as coberturas em etanol a 70% a 4 °C até o uso.
2. Revestimento das células
   1. Coloque dois cobertores estéreis de 20 × 20 mm em um prato de cultura celular de 60 mm lado a lado. Prepare quantos pratos forem necessários para o experimento. Certifique-se de que todo o etanol tenha evaporado antes de adicionar qualquer célula ao recipiente que contém os revestimentos. Lave qualquer etanol residual adicionando PBS estéril ao recipiente por 10–15 minutos; remova PBS antes de semear as células.
   2. Semente 200.000 células expressas de LivePAR por prato de cultura celular. Deixe as células aderirem 24–36 horas às coberturas, condicione o meio e comece a se replicar (crescer).
3. Indução de focos de PAR
   1. Expor as células que expressam LivePAR a 100 μM NRH, 10 μM PARGi e 10 μM MNNG ou 40 μM tBuOOH. Além disso, para testar a formação de PAR dependente de PARP1/PARP2, inibir PARP1/PARP2 adicionando 10 μM de PARPi. Adicione compostos diretamente ao meio que contém as células dos coverslips e gire suavemente o meio nos recipientes de cultura celular para distribuir os compostos. Incube as taças de 60 mm a 37 °C por 60–90 minutos.
      NOTA: A NRH é usada para garantir que níveis suficientes de NAD⁺ celular estejam disponíveis para a PARylation ótima mediada por PARP1/^PARP2 33,46,47. O PARGi é usado para evitar que as cadeias PAR sintetizadas por PARP1/PARP2 sejam quebradas pelo PARG. MNNG ou tBuOOH é usado para induzir as modificações da base do DNA para iniciar o BER, o que leva à ativação de PARP1/PARP2. O PARPi é usado para confirmar que o sinal (focos) resulta da ativação do PARP1/PARP2.
4. Fixação das células e montagem das coberturas
   1. Remova o médio e lave com PBS.
      NOTA: Lavar uma ou duas vezes com PBS é importante, pois o meio usado para cultivar células contém alta concentração de proteínas séricas. Lavar com PBS também remove qualquer MNNG ou tBuOOH residual ainda presente no meio.
   2. Prefixe com formaldeído a 4% em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Lave as células 3 vezes com PBS.
   3. Corriga adicionando 3 mL de metanol frio (-20 ^°C): acetona (7:3) às células. Coloque os pratos a -20 ^°C por 9 minutos.
   4. Remova metanol: acetona. Lave 3x com PBS.
   5. Pipeta 15 μL de meio anti-descolorimento contendo DAPI nas lâminas de vidro. Fixe delicadamente as coberturas no ponto do meio de montagem com as células voltadas para dentro, minimizando bolhas.
   6. Centralize, prenda e sele as laterais da capa de cobertura ao lâmina de vidro aplicando uma pequena quantidade de esmalte transparente de pregos nas laterais da capa de cobertura. Coloque os slides no escuro para deixar a camada superior secar o esmalte das unhas (~10 min). Armazene os slides no escuro a 4 °C até estar pronto para imagem.
5. Células de imagem
   1. Imagine todas as lâminas pelo menos 10x com ampliação de 63×, usando um microscópio confocal. Detectar focos PAR usando o laser de 488 nm e coloração nuclear (DAPI) usando o laser de 405 nm (por exemplo, veja a Figura 2).
6. Análise de imagens confocais
   1. Crie um arquivo de texto contendo o texto a seguir e nomeie-o como "LivePAR_Macro". Esse macro facilita a quantificação "automática" dos focos de PAR nos núcleos das células que expressam LivePAR:
      macro "DAPI positive staining [1]" {
      tit=getTitle();
      run("Duplicate...", "title=DAPI duplicate");
      WindowSelect("DAPI")
      run("8-bit");
      run("Split Channels")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      fechar();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run("Gaussian Blur...", "Sigma=3");
      setAutoThreshold("Default");
      run("Make Binary");
      run("Inverter")
      corre ("Preencher Buracos")
      run("Bacia hidrográfica")
      run("Analisar Partículas...", "size=50.00-Infinity circularity=0.00-1.00 mostrar=Esboços adicionar excluir incluir in_situ");
      renome("DAPI_"+tit);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      fechar();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode(true);
      run("8-bit");
      t=obtémTítulo();
      run("Duplicate...", "title=GB1 duplicate");
      run("Duplicate...", "title=GB20 duplicate");
      selectWindow("GB20")
      run("Gaussian Blur...", "radius=20 stack");
      selectWindow("GB1");
      run("Gaussian Blur...", "radius=1 stack");
      imageCalculator("Subtrair criar pilha", "GB1", "GB20");
      selectWindow("GB1");
      fechar();
      selectWindow("GB20");
      fechar();
      selectWindow("Resultado de GB1");
      renome("Blank_GB1-GB20_"+t);
      título = getTitle();
      run("Split Channels")
      selectWindow("C1-"+título);
      fechar();
      selectWindow("C2-"+título);
      setThreshold(90,255) //o valor 90 pode ser alterado para considerar a variabilidade experimental
      run("Analisar Partículas...", "tamanho=0,00-200 circularidade=0,00-1,00 mostrar=Máscaras resumir");
      close ("C2-"+título);
      selectWindow("Máscara de C2-"+título);
      fechar ();
      setBatchMode(falso);
      }
   2. Baixe e instale o ImageJ no computador (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. Abra o ImageJ e instale a macro (arquivo de texto: LivePAR_Macro) clicando em Plugins | Macros | Instalar.
   4. Abra todos os arquivos confocais no ImageJ e salve-os como arquivos *.tif para preservar os arquivos originais.
   5. Abra um documento de planilha e salve-o como [data]_[Linha Celular]_Foci Análise.
   6. Analise um arquivo *.tif por vez. Pressione 1 para encontrar os núcleos; quando uma janela chamada Gerente de ROI se abrir, selecione todas as entradas na janela e pressione adicionar para sobrepor a área do núcleo sobre a imagem original. Exclua núcleos identificados incorretamente. Desenhe o núcleo usando a ferramenta de seleção à mão livre e pressione 2 para quantificar os focos de PAR.
      NOTA: Não inclua núcleos que não estejam totalmente dentro do referencial.
   7. Selecione cada núcleo no gerenciador de ROI um por um e pressione 2. Uma contagem aparecerá indicando o número de focos dentro do núcleo selecionado. Depois que os focos em todos os núcleos do arquivo forem pontuados, copie e cole as informações no documento da planilha aberta.
   8. Repita os passos 3.6.6 e 3.6.7 com todos os arquivos *.tif.
   9. Plote focos PAR por núcleo no software escolhido (por exemplo, veja a Figura 3).

Results

Células que expressam a sonda LivePAR podem ser geradas produzindo um lentivírus que codifica a proteína de fusão RNF146(100-182)-EGFP (Figura 1A). As células podem ser avaliadas após a expressão transitória por até duas semanas após a transdução ou como linhas celulares estáveis após a seleção na higromicina (Figura 1B)¹. Após o tratamento com genotoxina, focos de PAR induzidos por danos ao DNA podem ser...

Discussion

O ensaio LivePAR foi desenvolvido para detectar locais de dano genômico nuclear ao DNA onde o PARP1/PARP2 sintetiza ativamente cadeias de PAR. Para isso, um fragmento de RNF146 codificando o domínio WWE (aminoácidos 100–182) foi fundido ao EGFP 1,2,3,37. Sondas PAR adicionais que descrevemos codificam EGFP fundidas aos resíduos de aminoácidos 1 a 166 de DTX4, r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentes, Químicos e Peptídeos
0,45 & micro; Filtros steriflip m Durapore	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
Coberturas de microscópio 20 x 20 mm	Thermo Fisher Scientific	Cat# 22-170-371
Acetona	Thermo Fisher Scientific	Cat# A18-1
Placas de cultura celular, 100 mm	VWR	Cat# 25382-166
Placas de cultura celular, 60 mm	Fisher Scientific	Cat# 430166
Placas de cultura celular, 6 poços	VWR	Cat# 62406-161
Cryoviais, 2 mL	VWR	Cat# 89499-722
Éter dietílico	Thermo Fisher Scientific	Cat# 60-29-7
Dimetil sulfóxido	Thermo Fisher Scientific	Cat# BP231-1
Filtros estéreis descartáveis, 0,45 & micro; m	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
DMEM	Corning	Cat# 15-017-CV
Etanol, 200 proof	Laboratórios de Descontaminação	Cat# 2701
Lâminas de microscópio de vidro	Thermo Fisher Scientific	Cat# 12-544-4
Soro fetal bovino inativado por calor	Atlanta Biologics	Cat# S11150
Ácido clorídrico	Thermo Fisher Scientific	Cat# A144-212
Higromicina	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10687010
Lenços Kim grandes	Kimberly-Clark	Cat# 34256
Lenti-X GoStix Plus Kit	Takara	Cat# 631280
Metanol	Thermo Fisher Scientific	Cat# A452SK-4
MNNG	Molport	Cat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihidroxi-5-(hidroximetil) tetrahidrofurano-2-il]-4H-piridina-3-carboxamida)	Marie Migaud ou  NuChem Sciences Inc
Inibidor de PARG (PDD00017273)	Sigma-Aldrich	Cat# SML1781
Inibidor de PARPi (Veliparib, ABT-888)	MedChemExpress	Cat# HY-10129
Penicilina/estreptomicina	Gibco	Cat# 15140-122
Polybrene	Sigma-Aldrich	Cat# TR-1003-G
tBuOOH	Thermo Fisher Scientific	Cat# 180345000
TransIT-x2 (Reagente de transfecção)	Mirus	Cat# MIR-6006
Triton-X100	VWR	Cat# 0694
Tripsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25200-056
Vectashield (H-1000) meio de montagem anti-descoloração	Thermo Fisher Scientific	Cat# NC1695563
Linhas celulares
293-FT	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
(derivado de células renais embrionárias humanas transformadas com o antígeno T grande SV40)	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
LN428	Doação generosa de	N/A
(Linha celular de tumor de glioblastoma humano)	Dr. Ian Pollack (Universidade de Pittsburgh)	N/A
RPE-1	ATCC	Cat# CRL-4000
(células epiteliais do pigmento retiniano imortalizado por hTERT)	ATCC	Cat# CRL-4000
U2OS	ATCC	Cat# HTB-96
(Linha celular de osteossarcoma humano)	ATCC	Cat# HTB-96
DNA recombinante
pMDLg/pRRE	Ação de laboratório # 253	Addgene, Cat# 12251
pRSV-Rev	Ação de laboratório # 254	Addgene, Cat# 12253
pMD2.G	Estoque de laboratório # 252	Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR é o domínio WWE do RNF146, resíduos de aminoácidos 100-182, fundido a EGFP; contém uma fita cassete de resistência à higromicina)	Ações de laboratório # 1727	Addgene, Cat# 176063
Software and Algorithms
Adobe Illustrator (para preparação de figuras)	Adobe Systems	Versão 2024
GraphPad Prisma	GraphPad	Versão 10.5.0  (Mac OS X)
ImageJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html