Esse protocolo fornece um guia otimizado e detalhado para usar a planária Schmidtea mediterranea como sistema modelo para estudar as interações hospedeiro-patógeno durante infecções fúngicas. O método se baseia no procedimento anterior para infectar planárias com o patógeno fúngico humano Candida albicans, fornecendo orientações detalhadas para aumentar a reprodutibilidade e a consistência experimental.
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Artigo de método
Um Protocolo Otimizado para Infecção por Candida albicans em Schmidtea mediterranea para Estudar a Patogênese Fúngica e a Defesa do Hospedeiro
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Candida albicans é um patógeno fúngico oportunista comum que coloniza assintomaticamente a maioria dos humanos. Embora tipicamente seja benigno, a disbiose causada pelo uso de antibióticos, disfunção imunológica ou rompimento da barreira epitelial pode desencadear crescimento excessivo de fungos e infecção, variando desde doença mucosa superficial até candidíase sistêmica potencialmente fatal. Novos modelos pré-clínicos de infecção são necessários para dissecar a patogênese de C. albicans in vivo em diferentes estágios de infecção e com diferentes desfechos mensuráveis do hospedeiro. O planário Schmidtea mediterranea foi anteriormente estabelecido como hospedeiro invertebrado para estudar as interações hospedeiro-patógeno durante a infecção por C. albicans . S. mediterranea depende inteiramente de mecanismos imunológicos inatos conservados, capazes de superar a infecção por microrganismos patogênicos, incluindo bactérias e fungos. A notável capacidade regenerativa das planárias e as populações acessíveis de células-tronco tornam esse organismo um modelo fácil de analisar respostas imunes precoces, reparação de tecidos e eliminação de patógenos in vivo. Este modelo suporta a análise simultânea da virulência fúngica e das respostas transcricionais do hospedeiro, fornecendo insights valiosos sobre a dinâmica da infecção. Aqui, foi apresentado um protocolo atualizado com modificações detalhadas, procedimentos padronizados e etapas otimizadas para infectar S. mediterranea com C. albicans , projetado para aumentar a reprodutibilidade e permitir estudos sistemáticos de patogênese fúngica e defesa do hospedeiro.
Introdução
Candida albicans é um patógeno fúngico oportunista comum que coloniza assintomaticamente 50-70% dos humanos 1,2,3. Normalmente, um comensal inofensivo, C. albicans, pode crescer demais em condições como desequilíbrio microbiota, uso de antibióticos, imunossupressão, rompimento da barreira epitelial ou presença de dispositivos médicos, levando a doenças que vão desde infecções mucosas superficiais até candidíase sistêmica potencialmentefatais 4,5. Em indivíduos imunoc....
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Protocolo
Este protocolo se baseia nos métodosanteriores 22,23,24 e estabelece procedimentos claros e padronizados para aumentar a reprodutibilidade e permitir a investigação sistemática da patogênese fúngica e das respostas do hospedeiro em S. mediterranea. Os principais aprimoramentos do protocolo incluem critérios pré-especificados de inclusão e exclusão animal, preparação microbiana padronizada e avaliação abrangente dos desfechos do hospedeiro.
Todos os procedimentos devem ser realizados utilizando técnicas ap....
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Resultados
Um protocolo atualizado para infectar planárias com C. albicans (Figura 1) e quantificar sistematicamente os resultados do hospedeiro (Figura 2) é apresentado. Esse fluxo de trabalho refinado apoia uma avaliação robusta de múltiplos parâmetros de infecção, incluindo morbidade (gravidade da doença sintomática), sobrevivência (letalidade), carga fúngica (CFUs) e dinâmica espaço-temporal da colonização de patógenos (imunoc.......
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Discussão
Variar a dose infecciosa do tipo selvagem C. albicans produz diferenças reprodutíveis e dependentes da dose na morbidade em S. mediterranea, ressaltando a sensibilidade do modelo para avaliação quantitativa da virulência fúngica. Este protocolo delineia estratégias para estabelecer doses infecciosas e letais de base dentro de colônias planárias mantidas em laboratório e apresenta critérios para confirmar infecção sistêmica bem-sucedida por meio de imersão, integrando a .......
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Divulgações
C.J.N. é cofundador da BioSynesis, Inc., uma empresa que desenvolve diagnósticos e terapêuticos para infecções por biofilme. Todos os outros autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem a todos os membros dos laboratórios Nobile, Oviedo e Hernday por discussões perspicazes sobre o modelo de infecção por S. mediterranea-C. albicans e são gratos à Edelweiss Pfister pelo manejo laboratorial e manutenção planária. Esse trabalho foi apoiado pelos prêmios do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIH) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R35GM156045 e R35GM124594 ao C.J.N., e R35GM158501 e R01GM132753 ao N.J.O. Esse trabalho também foi apoiado pela família Kamangar na forma de uma cátedra dotada para C.J.N. N.M.S. foi apoiado pelas bolsas do Center for Cellular and Biomolec....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL | VWR/Genemate | 490004-436-BOXOF500 | Limpo, caixa de 500 peças |
| Frascos de cintilhão de 20 mL | Fisher Scientific | 12-100-006 | Frascos de vidro transparente para imunocoloração |
| Placas de poliestireno não tratado de 24 poços | Fisher Scientific | 08-772-51 | Imunocoloração |
| Tubos microcentrífugas de 5,0 mL | Eppendorf/Sigma Aldrich | EP0030119487-200EA | Limpo, caixa com 200 peças |
| Placas de poliestireno não tratadas de 6 poços | Fisher Scientific | 08-772-49 | Ensaios de infecção |
| Agar | VWR | 89405-066 | Grau bacteriológico para meio YPD |
| Aplicadores | Thermo Fisher/Puritano | 22-029-491 | C. albicans cultivo |
| BioRender | BioRender Inc. | N/A | Software de design de figuras usado para gerar ilustrações esquemáticas |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Água planária/1x Montjuï C Salts |
| Candida albicans anticorpo policlonal anti-Rabbit, IgG | Thermo Fisher | PA1-27158 | Imunocoloração |
| Tubos centrífugas | VWR | 89039-664 | C. albicans colheita |
| Tubos de cultura vidro borosilicato 18x150mm | VWR | 47729-583 | C. albicans cultivo |
| Cuvetas | Fisher Scientific | 14-955-127 | Para medir a densidade óptica de culturas |
| Dextrose (D-glicose) | Fisher Scientific | D16-3 | Médio do YPD |
| Glicerol | Fisher Scientific | G33-4 | Grau de biologia molecular para suplementar para armazenamento criogênico de C. albicans |
| Ferramenta de gráficos e visualização de dados | GraphPad/Prism | Software estatístico e ferramenta de visualização. Versão 10.6.1. | |
| Ferramenta de gráficos | R | Software estatístico. Versão 4.4.3. | |
| Shaker Incubador | Eppendorf | EPM1282-0004-1EA | New Brunswick Innova 44/44R para C. albicans cultivo |
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | Sigma | M8266-100G | Para água planárias (1x Montjuï c sal) |
| Sulfato de magnésio (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | Para água planárias (1x Montjuï c sal) |
| Lâminas de microscópio | VWR | 16004-368 | |
| Microscópio multizoom | Nikon | Nikon AZ100 | |
| N-Acetil-L-cisteína | Sigma Aldrich | A7250-50G | Reagente mucolítico e sacrificial fixação |
| Paramaldeído, solução 16%, grau de biologia molecular | Ciências da Microscopia Eletrônica | 15710 | Reagente fixador |
| Motor Sem Fio de Pilão a Pellets | Fisher Scientific | 12-141-361 | Homogeneização planária |
| Peptone, grau bacteriológico | HIMEDIA/VWR | 89129-480 | Médio do YPD |
| Pilões | Fisher Scientific | 12-141-368 | Pellet descartável sem RNase para homogeneização planária |
| Placas de Petri, 100 x 15 mm | VWR | 25384-342 | |
| Poliuretano (álcool vinílico) | Sigma-Aldrich | P-8136 | Para Gelvatol |
| Cloreto de potássio (KCl) | Sigma Life Science | P9541-500G | Médio/água planárias/nbsp; (1x Montjuï c sal) |
| Anticorpo secundário anti-coelho de cabra, IgG, Alexa Fluor 568 | Fisher Scientific | A-11011 | Imunocoloração |
| SN250 | Centro de Estoque de Genética Fúngica | Wildtype C. albicans strain (https://www.fgsc.net/) | |
| Azida de Sódio | Fisher Scientific | S227-100 | Para Gelvatol |
| Bicarbonato de sódio (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761-1KG | Médio/água planárias/nbsp; (1x Montjuï c sal) |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Sigma Life Science | S3014-500G | Médio/água planárias/nbsp; (1x Montjuï c sal) |
| Espectrofotômetro | Agilent | 26354 | Microplaca BioTek Epoch 2 para medir densidade óptica |
| Incubadora Estática | Fisher Scientific | 15-015-2634 | C. albicans cultivo |
| Pipetas de transferência | Fisher Scientific | 13-711-9CM | Pippettes graduadas descartáveis estéreis para transferência de planárias |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 252859 | Para Gelvatol |
| Extrato de levedura | Thermo Fisher | 212750 | Médio do YPD |
Referências
- Delavy, M., et al. Unveiling Candida albicans intestinal carriage in healthy volunteers: the role of micro- and mycobiota, diet, host genetics and immune response. Gut Microbes. 15 (2), 2287618(2023).
- Bays, D. J., Savage, H. P.
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Reimpressões e permissões
