Artigo de método

Um Protocolo Otimizado para Infecção por Candida albicans em Schmidtea mediterranea para Estudar a Patogênese Fúngica e a Defesa do Hospedeiro

DOI:

10.3791/70500

⸱

17 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Health Sciences Research Institute, University of California, Merced, 4Center for Cellular and Biomolecular Machines, University of California, Merced

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Esse protocolo fornece um guia otimizado e detalhado para usar a planária Schmidtea mediterranea como sistema modelo para estudar as interações hospedeiro-patógeno durante infecções fúngicas. O método se baseia no procedimento anterior para infectar planárias com o patógeno fúngico humano Candida albicans, fornecendo orientações detalhadas para aumentar a reprodutibilidade e a consistência experimental.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans é um patógeno fúngico oportunista comum que coloniza assintomaticamente a maioria dos humanos. Embora tipicamente seja benigno, a disbiose causada pelo uso de antibióticos, disfunção imunológica ou rompimento da barreira epitelial pode desencadear crescimento excessivo de fungos e infecção, variando desde doença mucosa superficial até candidíase sistêmica potencialmente fatal. Novos modelos pré-clínicos de infecção são necessários para dissecar a patogênese de C. albicans in vivo em diferentes estágios de infecção e com diferentes desfechos mensuráveis do hospedeiro. O planário Schmidtea mediterranea foi anteriormente estabelecido como hospedeiro invertebrado para estudar as interações hospedeiro-patógeno durante a infecção por C. albicans . S. mediterranea depende inteiramente de mecanismos imunológicos inatos conservados, capazes de superar a infecção por microrganismos patogênicos, incluindo bactérias e fungos. A notável capacidade regenerativa das planárias e as populações acessíveis de células-tronco tornam esse organismo um modelo fácil de analisar respostas imunes precoces, reparação de tecidos e eliminação de patógenos in vivo. Este modelo suporta a análise simultânea da virulência fúngica e das respostas transcricionais do hospedeiro, fornecendo insights valiosos sobre a dinâmica da infecção. Aqui, foi apresentado um protocolo atualizado com modificações detalhadas, procedimentos padronizados e etapas otimizadas para infectar S. mediterranea com C. albicans , projetado para aumentar a reprodutibilidade e permitir estudos sistemáticos de patogênese fúngica e defesa do hospedeiro.

Introdução

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Candida albicans é um patógeno fúngico oportunista comum que coloniza assintomaticamente 50-70% dos humanos 1,2,3. Normalmente, um comensal inofensivo, C. albicans, pode crescer demais em condições como desequilíbrio microbiota, uso de antibióticos, imunossupressão, rompimento da barreira epitelial ou presença de dispositivos médicos, levando a doenças que vão desde infecções mucosas superficiais até candidíase sistêmica potencialmentefatais 4,5. Em indivíduos imunocomprometidos – incluindo aqueles com HIV/AIDS, pacientes em quimioterapia ou terapias imunossupressoras, indivíduos com doenças crônicas ou aqueles em unidades de UTI – as taxas de mortalidade podem ultrapassar 70%, ressaltando a significativa carga de saúde pública da candidíaseinvasiva 6,7,8. Globalmente, infecções fúngicas invasivas afetam mais de 6,5 milhões de pessoas anualmente, com custos diretos de saúde apenas nos Estados Unidos ultrapassando US$ 8 bilhões por ano para infecções relacionadas à Candida 9,10. Apesar dos tratamentos antifúngicos disponíveis, as taxas de morbidade e mortalidade associadas às infecções por C. albicans permaneceram amplamente inalteradas por décadas, destacando a necessidade urgente de compreender melhor as interações hospedeiro-patógeno em doenças fúngicas.

C. albicans emprega um repertório diversificado de fatores de virulência que apoiam a colonização, persistência e patogênese em diversos ambientes hospedeiros. Estes incluem adesão aos tecidos do hospedeiro, evasão imunológica, remodelação da parede celular, secreção de enzimas hidrolíticas, plasticidade morfológica e formação debiofilmes 11,12,13,14,15,16. Coletivamente, essas características permitem que C. albicans se adapte a nichos diversos de hospedeiros, modiforme respostas imunes e resista a terapias antifúngicas 16,17,18,19,20,21. Elucidar como esses processos influenciam os desfechos da infecção – incluindo morbidade do hospedeiro, mortalidade e eliminação de patógenos – é essencial para desenvolver estratégias preventivas e terapêuticas mais eficazes.

Para investigar essas dinâmicas hospedeiro-patógeno, estabelecemos um sistema modelo usando o planário Schmidtea mediterranea comohospedeiro 22,23,24. Esse modelo serve como uma plataforma versátil para estudar a resposta multissistémica do hospedeiro à infecção fúngica, aproveitando um método de infecção baseado em imersão que permite a exposição síncrona de animais a C. albicans. A seção a seguir apresenta procedimentos atualizados passo a passo que refinam esse protocolo, melhoram a reprodutibilidade e facilitam a implementação consistente entre os laboratórios.

Planárias são invertebrados de vida livre com excepcional capacidade regenerativa, capazes de substituir rapidamente tecidos perdidos por lesão ouinfecção 25. Eles carecem de um sistema imunológico adaptativo e dependem inteiramente de defesas inatas conservadas – incluindo receptores de reconhecimento de padrões, peptídeos antimicrobianos, secreção de muco e células fagocíticas – para eliminar patógenos bacterianos e fúngicos emdias 26, 27, 28 e 29. Como a imunidade inata representa a primeira linha de defesa entre eucariotos e ainda é pouco estudada fora dos sistemasmamíferos 27, as planárias oferecem uma oportunidade de examinar esses processos in vivo com resolução celular e molecular. Sua capacidade regenerativa é impulsionada por células-tronco pluripotentes adultas, conhecidas como neoblastos, que constituem aproximadamente 30% das células adultas e contribuem para a recuperação após a infecção23,30. Essas características tornam S. mediterranea um modelo poderoso para dissecar a virulência de patógenos e a defesa do hospedeiro em escalas genética, celular, de tecidos e organismos, permitindo que abordemos questões que muitas vezes são difíceis de estudar usando sistemas mamíferos tradicionais.

Além disso, o tamanho pequeno dos planários (tipicamente alguns milímetros de comprimento), baixo custo e facilidade de manutenção31 apoiam experimentos em grande escala, evitando as restrições financeiras, éticas e regulatórias inerentes aos modelos de vertebrados. Assim como C. albicans, S. mediterranea é genômicamente tratável, com um genoma totalmente sequenciado e anotado, e suporta técnicas avançadas de desenvolvimento molecular e celular – incluindo perfilamento transcricional, imunohistoquímica e histologia de alta resolução, e interferência robusta de RNA (RNAi)32,33,34,35,36,37,38. Essas ferramentas permitem a análise paralela das respostas do hospedeiro e do patógeno durante a infecção.

Vários modelos pré-clínicos alternativos foram usados para estudar infecções fúngicas. Hospedeiros invertebrados como Galleria mellonella (mariposa-cera), Caenorhabditis elegans (verme redondo) e Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta), assim como o vertebrado Danio rerio (peixe-zebra), cada um oferece vantagens experimentais distintas, mas também possui limitações notáveis. Esses sistemas frequentemente dependem da sobrevivência como ponto final principal porque as infecções rapidamente induzem a morte do hospedeiro, impedindo a avaliação detalhada da morbidade, recuperação e respostas multissistêmicas – características que o modelo planário captura facilmente.

Modelos mamíferos como Mus musculus (rato), Rattus norvegicus (rato), Oryctolagus cuniculus (coelho) e Cavia porcellus (porquinho-da-índia) recapitulam mais de perto a fisiologia humana, mas são limitados por altos custos, tamanhos de coorte pequenos, exigências éticas e regulatórias, e o desafio de distinguir respostas imunes inatas de adaptativas. Além disso, décadas de pesquisa sobre patogênese fúngica em camundongos têm focado predominantemente em infecções sistêmicas em estágio avançado, frequentemente negligenciando eventos iniciais, como a ruptura da barreira epitelial e o crescimento excessivo da mucosa – as rotas mais comuns de início de doenças fúngicasem humanos 44,45,46.

Estudar as interações hospedeiro-patógeno é, portanto, essencial para entender os processos biológicos que sustentam a virulência fúngica, a defesa do hospedeiro e a progressão da doença. Infecções fúngicas invasoras representam uma ameaça global crescente, com múltiplas espécies agora apresentando resistência a todas as principais classes de medicamentos antifúngicos. Estima-se que mais de 1 bilhão de pessoas sejam afetadas por infecções fúngicas, e fatores como mudanças climáticas, uso generalizado de antimicrobianos e o número crescente de indivíduos imunocomprometidos estão acelerando o surgimento de patógenos resistentes aantifúngicos 47,48,49,50. Compreender como fungos patogênicos colonizam e interagem com seus hospedeiros é fundamental para desenvolver novas estratégias preventivas e terapêuticas.

A seguir descreve um protocolo revisado e padronizado de infecção sistêmica para as interações S. mediterranea-C. albicans, projetado para promover a reprodutibilidade e permitir a investigação sistemática da patogênese fúngica e dos mecanismos de defesa do hospedeiro. O protocolo original foi seguido em publicaçõesanteriores 22, 23, 24. A Tabela 1 resume as principais atualizações incorporadas nesta versão revisada, incluindo melhorias nos procedimentos de inoculação fúngica, redução do volume de poços, critérios definidos de inclusão animal, determinação de doses infecciosas e letais e recomendações atualizadas para a criação animal. Esse fluxo de trabalho fornece orientações detalhadas para o cultivo de C. albicans, infectação de planárias por exposição por imersão e avaliação da virulência fúngica e respostas do hospedeiro usando leituras qualitativas e quantitativas sob condições sintomáticas e de dose letal (Figura 1). Os procedimentos otimizados apresentados aqui incorporam variáveis identificadas empiricamente como determinantes-chave da dinâmica da infecção e dos resultados do hospedeiro, melhorando assim a reprodutibilidade e permitindo a avaliação sistemática das interações hospedeiro-patógeno.

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Protocolo

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Este protocolo se baseia nos métodosanteriores 22,23,24 e estabelece procedimentos claros e padronizados para aumentar a reprodutibilidade e permitir a investigação sistemática da patogênese fúngica e das respostas do hospedeiro em S. mediterranea. Os principais aprimoramentos do protocolo incluem critérios pré-especificados de inclusão e exclusão animal, preparação microbiana padronizada e avaliação abrangente dos desfechos do hospedeiro.

Todos os procedimentos devem ser realizados utilizando técnicas apropriadas de biossegurança estéreis e assépticas de nível 2. Equipamentos de proteção individual (EPI) padrão de laboratório, incluindo luvas, jaleco e sapatos fechados, devem ser usados o tempo todo. Os procedimentos envolvendo a planária S. mediterranea foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais para o uso ético de invertebrados.

Todos os aprimoramentos de protocolo são resumidos na Tabela 1. Todos os reagentes, equipamentos críticos e receitas de meio, tampões e imunocoloração estão listados na Tabela de Materiais e na Tabela 2.
NOTA: Todos os procedimentos envolvendo o modelo animal invertebrado S. mediterranea devem ser realizados para garantir os mais altos padrões de bem-estar animal. S. mediterranea deve ser alojada em condições otimizadas que simulem habitats naturais. Os experimentos devem ser projetados para minimizar a dor ou o sofrimento potencial, garantindo um tratamento ético ao longo do estudo.

1. Cultivo fúngico

  1. Informações sobre a cepa de C. albicans
    1. A cepa padrão de laboratório de C. albicans SN25051 foi usada como cepa do tipo selvagem para todos os experimentos, e está disponível publicamente no Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/). O SN250 é derivado do isolado clínico SC5314, originalmente coletado de uma hemocultura de um paciente com candidíasedisseminada 52.
    2. As cepas de C. albicans são mantidas em estoques de glicerol de 25% a −80°C.
  2. Cultivo de cepas de C. albicans para infecção
    1. Estrias de estoque criogênico
      1. Usando um aplicador estéril, estire a cepa desejada do estoque de −80°C sobre as placas de ágar do extrato de peptona de levedura (YPD) (extrato de levedura 1%, 2% peptona, 2% glicose; pH 6,8).
      2. Incubar estaticamente a 30°C por 72 horas.
  3. Preparando culturas durante a noite
    1. Inocule uma colônia única em 4 mL de YPD líquido em tubos de cultura vidro borosilicato estéreis (18 mm × 150 mm) usando um aplicador estéril.
    2. Inclua um tubo controle negativo contendo YPD não inoculado sob condições idênticas.
    3. Tape frouxamente os tubos para permitir a aeração e incube durante a noite (16 h) a 30 °C, com agitação a 220 rpm (orbital) em uma incubadora agitada.
      NOTA: Se ocorrer crescimento microbiano no controle negativo, aborte o experimento e reinicie com nova mídia e técnica estéril.
  4. Colheita e lavagem de células
    1. Utilizando a técnica asséptica, transfira culturas para tubos centrífugos de 15 mL rotulados.
    2. Cultive em centrífuga por 5 minutos a ~3.000 × g para pelletar as células.
    3. Remova cuidadosamente o sobrenadante do YPD sem mexer no pellet.
    4. Ressuspenda o pellet em água planária (veja a Tabela 2 para composição) em um volume igual ao do YPD utilizado.
    5. Misture bem por meio de vórtice.
    6. Repita os passos 1.4.2-1.4.4 mais duas vezes para remover completamente o meio de cultivo.
    7. Após a lavagem final, ressuspenda o pellet celular em água planária fresca por meio de vórtice.
  5. Quantificação da concentração celular de C. albicans
    1. Diluição para medição de OD
      1. Prepare três tubos microcentrífugas estéreis de 1,7 mL com diluição 1:20 (cultura de 50 μL + 950 μL de água planária) ou um fator de diluição alternativo escolhido. Misture bem.
      2. Prepare um tubo em branco contendo 1000 μL de água planária.
    2. Espectrofotometria
      1. Ajuste o espectrofotômetro para medir a densidade óptica em 600 nm (OD600).
      2. Apague o espectrofotômetro com água planária.
      3. Meça OD600 para cada amostra diluída e registre os valores.
      4. Faça a média das três leituras e multiplique pelo fator de diluição para determinar o OD600 da cultura de estoques. Converta OD600 para a concentração da célula.
        NOTA: O fator de conversão de densidade óptica deve ser determinado empiricamente para cada espectrofotômetro. Com base na instrumentação específica utilizada, um OD600 de 1 corresponde aproximadamente a 2 ×10 célulasde C. albicans/mL53.
  6. Determinação das concentrações experimentais de inoculo
    1. Prepare a concentração desejada no inoculo para cada condição experimental.
      NOTA: Realize pelo menos três réplicas biológicas para determinar a dose efetiva para a colônia planária, especialmente para desfechos infecciosos ou letais. Um cálculo representativo para preparar concentrações de inoculo infeccioso e letais é fornecido no Arquivo Suplementar 1.

2. Espécies planárias e manutenção

  1. Espécies planárias e manutenção
    1. Use a linha clonal assexuada CIW4 da planária S. mediterranea para todos os experimentos.
    2. Mantenha colônias planárias em recipientes plásticos transparentes de grau alimentício contendo 1.500–2.000 mL de 1× água planária.
    3. Mantenha os recipientes no escuro a 20 °C com tampas frouxamente fechadas para permitir a troca de gás.
    4. Não trate planárias com antibióticos.
  2. Manutenção e alimentação da colônia
    1. Alimente as colônias com purê de fígado de boi coado fresco uma vez por semana.
    2. Limpe os recipientes duas vezes por semana.
    3. Mantenha a densidade planária entre 200 e 400 animais por recipiente. Trabalhos anteriores demonstram procedimentos detalhados sobre preparação de colônias e manutençãode longo prazo 31.
  3. Condicionamento pré-experimento
    1. Antes da infecção experimental, deixe as planárias de fome por 7 a 12 dias para padronizar condições metabólicas e de tamanho.
    2. Use grupos de 5 a 10 animais por poço para cada condição experimental. Garanta o número igual de animais em todas as condições, incluindo controles positivos e negativos.
  4. Seleção do tamanho dos animais
    1. Selecionem planárias com aproximadamente 5 mm de comprimento, correspondendo a ~5 × 10 5células hospedeiras por animal54.
    2. Evite usar planárias menores que 5 mm, pois animais desse tamanho podem incluir indivíduos com blastemas ou desenvolvimento incompleto que pode produzir resultados inconsistentes.
    3. Evite usar planárias maiores que 5 mm, pois animais maiores são menos adequados para imunocoloração por fluorescência.
    4. Use planárias com aproximadamente 5 mm de comprimento ao estabelecer condições de dose infecciosa (ID50) e dose letal (DL50).
      NOTA: Para facilitar a seleção consistente do tamanho, imprima uma grade de referência de 5 mm × 5 mm e coloque-a dentro de uma capa plástica sob o recipiente planário transparente. Certifique-se de que as planárias estejam totalmente estendidas antes de medir o comprimento.
  5. Saúde e critérios de inclusão
    1. PASSO CRÍTICO: Examine todas as planárias sob um estereoscópio antes do uso.
    2. Exclua animais com danos ou ferimentos visíveis, incluindo as seguintes condições:
      1. Presença de blastemas (tecido sem pigmentação) ou desenvolvimento de pigmentação incompleto.
      2. Pigmentação anormal, como regiões significativamente mais escuras.
      3. Tecido faltando ou danificado.
      4. Lesões ou cicatrizes.
      5. Feridas abertas.
      6. Anomalias ou deformidades morfológicas.
      7. Qualquer condição crônica ou que não cicatriza.
    3. Exclua animais com anormalidades do desenvolvimento.
      1. Regiões da cabeça ou cauda bifurcadas ou duplicadas.
      2. Morfologia corporal deformada ou assimétrica.
      3. Número incorreto de fotorreceptores (apenas um par bilateral é aceitável).
      4. Faringe posicionada de forma anormal.
      5. Ciliação defeituosa resultando em motilidade prejudicada ou comportamento de deslizamento irregular.
    4. Inclua apenas animais com aproximadamente 5 mm de comprimento, totalmente desenvolvidos e livres de lesões ou anomalias visíveis.
  6. Preparação de placas
    1. Transfira planárias saudáveis que atendam a todos os critérios de inclusão para 2 mL de água planária fresca por poço em uma placa de poliestireno de 6 poços sem cultivo de tecidos.
      NOTA: Transfira os animais um dia antes da infecção para permitir a adaptação ao novo ambiente e densidade populacional.
    2. Atribua poços para as seguintes condições experimentais:
      1. Controles negativos: animais não infectados ou tratados de forma simulada.
      2. Controles positivos: animais infectados com C. albicans do tipo selvagem.
    3. Remova e substitua toda a água por 2 mL de água planária fresca para garantir uniformidade entre os poços.

3. Configuração da infecção

  1. Preparar a inoculação (veja Arquivo Suplementar 1 para cálculo da amostra)
    1. Usando a técnica asséptica, remova suavemente toda a água da placa de 6 poços inclinando-a em direção ao usuário.
    2. Adicione o volume calculado de água planária a cada poço.
      NOTA: Proceda um poço de cada vez para evitar que os animais sequem.
    3. Adicione o volume calculado da cultura de C. albicans a cada poço.
      NOTA: Evite expor animais ao ar por períodos prolongados, pois a secagem pode causar estresse e alterar os resultados da infecção.
  2. Condições experimentais de incubação de placas
    1. Coloque a placa inoculada de 6 poços em um local escuro e estático em temperatura ambiente.
    2. Mantenha placas experimentais em uma área separada das colônias planárias não infectadas para evitar contaminação cruzada.
    3. Registre a data e hora da inoculação (designadas como hora 0 h).
      NOTA: Evite áreas de muito movimento ou propensas a vibrações (por exemplo, gavetas, superfícies de instrumentos ou bancadas movimentadas), pois o movimento pode estressar animais e confundir os resultados.
    4. Incube planárias com C. albicans por até 72 horas, dependendo do ponto final desejado.
  3. Resuspensão de células fúngicas
    1. Em cada ponto temporal, ressuspenda suavemente as células estabilizadas de C. albicans sem perturbar as planárias.
      NOTA: Tempo (horas [h] ou dias [d] após a infecção) refere-se ao tempo decorrido desde a exposição inicial (tempo 0).
    2. Às 24 horas pós-infecção (HPI)
      1. Usando uma pipeta de transferência estéril de 3 mL, incline a placa levemente em direção ao usuário.
      2. Aspire a água planária e dispense-a suavemente em uma área do poço livre de animais para misturar a camada fúngica sedimentada.
      3. Repita essa etapa de 5 a 10 vezes por poço para quebrar a camada fúngica sedimentada, evitando contato direto com planárias.
      4. Observe o assentamento fúngico contra um fundo escuro para melhor visibilidade antes e depois dos passos de suspensão.
      5. Ressuspenda poços de controle não infectados sob condições idênticas.
    3. Com 48 hpi
      1. Repita o procedimento de ressuspensão descrito acima.
      2. Realize todas as etapas de resuspensão dentro de ± 1 hora a partir do ponto de tempo designado.
  4. Fim da exposição (72 hpi)
    1. Com 72 hpi, transfira suavemente planárias para uma nova placa de 6 poços contendo 2 mL de água planária fresca por poço.
    2. Minimize a transferência de cultura fúngica usando o menor volume possível de líquido.
    3. Depois que os animais forem transferidos, remova toda a água e substitua-a por água planária fresca.
      NOTA: Manuseie animais e quaisquer fragmentos de tecido com cuidado para evitar lesões mecânicas ou estresse adicional.

4. Avaliação do ponto final do host

  1. Registro dos resultados do hospedeiro
    1. Comece a avaliar os desfechos do hospedeiro 1 dia após a infecção (dpi) e continue diariamente até o desfecho experimental desejado.
    2. Quantifique o dano ao hospedeiro usando o sistema padronizado de pontuação 0–3 (Figura 2).
      Nota 0: Sem mudança em relação aos controles não infectados (saudáveis, assintomáticos).
      Nota 1: Sintoma leve.
      Nota 2: Sintomas graves.
      Placar 3: Morte.
  2. Critérios para avaliação dos sintomas do hospedeiro
    1. Pontuação 0 (Assintomático):
      1. Identifique animais que apresentam morfologia, pigmentação, comportamento e resposta normais, sem alterações observáveis em relação aos controles não infectados.
    2. Placar 1 (Leve):
      Atribua uma pontuação leve quando pelo menos um dos seguintes sintomas for observado em relação aos controles assintomáticos.
      1. Redução da velocidade de movimento ou comportamento anormal de planagem.
      2. Perda parcial ou total da resposta fototáxica.
      3. Contrações corporais prolongadas ou repetitivas.
      4. Pigmentação anormal ou não uniforme (regiões mais claras ou escuras).
      5. Regressão do tecido da cabeça ou cauda.
    3. Pontuação 2 (Severa):
      Atribua uma pontuação severa quando um ou mais dos seguintes sintomas estiverem presentes enquanto os animais permanecem vivos.
      1. Filme ocular ou perda de um ou ambos os olhos.
      2. Perda total de cabeça ou dano notável no tecido anterior.
      3. Grande perda de tecido na região pré-faríngea.
      4. Fragmentação em múltiplas regiões do corpo (cefálicos, faríngeos ou posteriores).
      5. Feridas abertas com ou sem secreção de muco ou vazamento interno.
      6. Lise parcial do tecido resultando em perda de integridade estrutural.
      7. Postura corporal em "C", paralisia ou comprometimento severo da motilidade.
    4. Pontuação 3 (Morte):
      Identifique a morte com base em um ou mais dos seguintes critérios.
      1. Lisé de tecido completo ou de animais inteiros.
      2. Perda total de resposta aos estímulos.
      3. Falha em se recuperar ou regenerar.
        NOTA: A Figura 2 fornece imagens representativas e características definidoras para cada pontuação para garantir uma classificação consistente do fenótipo do hospedeiro.

5. Determinação da sobrevivência do hospedeiro após exposição a fungos

  1. A 3 dpi, transfira suavemente planárias para uma nova placa de 6 poços contendo 2 mL de água planária fresca por poço, evitando a transferência da cultura fúngica residual.
  2. Observe animais usando microscopia óptica (≥ objetivo 10x).
  3. Registre os resultados do hospedeiro usando a folha padronizada de pontuação fornecida no Arquivo Suplementar 2.
  4. Determinação de animais vivos
    1. Identifique animais vivos com base em um ou mais dos seguintes critérios.
      1. Fototaxia negativa.
      2. Resposta à perturbação suave da pipeta de transferência.
      3. Estrutura corporal intacta.
      4. Fixação estável à placa.
  5. Determinando animais mortos
    1. Identifique animais mortos com base em um ou mais dos seguintes critérios.
      1. Lise ou desintegração completa (apenas detritos residuais).
      2. Corpo transparente ou eviscerado.
      3. Ausência de movimento ou resposta a estímulos.
      4. Falha em regeneração (ausência de formação de blastemas).
  6. Remoção de animais mortos
    1. Remova animais mortos e detritos somente após confirmar a não viabilidade sob microscopia.
    2. PASSO CRÍTICO: Remover imediatamente os animais mortos para evitar contaminação cruzada ou alterações nas medições de sobrevivência.
    3. Se remantiver detritos ou resíduos fúngicos, transfira novamente os animais sobreviventes para uma placa nova contendo água planária limpa para evitar a resemeadura de C. albicans ou a formação de biofilmes.
      NOTA: Coloque placas de 6 poços sobre um fundo escuro durante a inspeção visual para melhorar o contraste e facilitar a avaliação do fenótipo.

6. Avaliação da carga fúngica

  1. Quantificação da unidade formadora de colônias (CFU)
    1. Nos momentos desejados para a infecção, colete planárias (5–10 animais por condição por dia). Inclua controles não infectados/simulados e controles infectados do tipo selvagem.
    2. Enxague suavemente os poços duas vezes com 2 mL de água planária fresca para remover as células de fundo de C. albicans .
    3. Transfira planárias para tubos de microcentrífuga estéreis e rotulados de 1,7 mL ou 5,0 mL e remova toda a água residual.
    4. Adicione 300 μL de água planária fresca a cada tubo.
    5. Homogeneize os animais usando um pilão estéril até que não restem grandes fragmentos (aproximadamente 30–45 s).
    6. Realize diluições seriadas do homogeneado (por exemplo, 1:10, 1:100, 1:1000).
    7. Placa de 100–200 μL de cada diluição sobre placas de ágar YPD suplementadas com 50 μg/mL de ampicilina, rifampicina, estreptomicina e neomicina. Espalhe uniformemente usando contas de vidro estéreis ou um espalhador de células estéril.
    8. Deixe os pratos permanecerem em pé na bancada por 5 a 10 minutos após o banhamento para permitir a absorção do líquido no ágar.
    9. Prepare placas triplicadas para cada diluição e condição.
    10. Incube as placas a 30 °C por 48 horas.
    11. Conte as CFUs e multiplique pelo fator de diluição.
    12. Normalize os valores de CFU ao número de planárias para calcular a média das CFUs por planária por condição. Por exemplo, se 100 colônias forem observadas com diluição de 10× a partir de um homogeneado de 5 animais, o valor calculado é 200 CFUs por animal.

7. Coloração anti-Candida por imunofluorescência

  1. Considerações gerais sobre coloração
    1. Execute todos os passos com suave balanço orbital (100–140 rpm) em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para detalhes sobre anticorpos e fontes de reagentes.
      ATENÇÃO: Formaldeído, dodecilo sulfato de sódio (SDS) e peróxido de hidrogênio são substâncias químicas perigosas e devem ser manuseadas de acordo com as regulamentações institucionais de segurança. O formaldeído é tóxico e classificado como carcinógeno; SDS é um irritante; E o peróxido de hidrogênio é um oxidante forte que pode causar queimaduras. Use equipamentos de proteção individual adequados (jaleco, luvas de nitrilo, sapatos fechados e óculos de proteção). Realizar procedimentos envolvendo reagentes voláteis em uma exaustão química certificada e descartar resíduos de acordo com as diretrizes institucionais de Saúde e Segurança Ambiental.
  2. Coleta de amostras
    1. Colete animais de cada condição experimental e ponto de tempo.
    2. Transfira os animais para frascos de cintilação marcados de 20 mL contendo 2 mL de água planária.
    3. Remova todo o líquido, enxágue uma vez com 2 mL de água planária fresca e depois todo líquido novamente.
  3. Fixação e permeabilização
    1. Sacrifique animais em 7,5% de N-acetilcisteína (NAC) em 1× PBS por 3 minutos.
    2. Remova a solução e fixe os animais em formaldeído a 4% e 0,3% PBSTx por 15 minutos.
    3. Enxágue as amostras duas vezes com 1× PBS.
    4. Permeabilize amostras em SDS de 1% por 15 minutos.
    5. Enxague as amostras três vezes com 1× PBS.
  4. Descolorimento
    1. Amostre água sanitária em peróxido de hidrogênio a 6% em 1× PBS sob uma luz LED forte por 4–12 horas.
      NOTA: Se a clareação não puder prosseguir imediatamente, armazene amostras fixas em 1× PBS a 4 °C por até 1 semana ou desidrate amostras em metanol 100% para armazenamento a longo prazo.
  5. Bloqueio e incubação de anticorpos
    1. Transfira os animais para placas de 24 poços contendo 1× PBS.
    2. Bloqueie a ligação inespecífica em 2,5% de PBS-TB (PBS contendo Triton X-100 e albumina sérica bovina) por 4 horas em temperatura ambiente ou 8 horas a 4 °C.
    3. Incubar amostras com anticorpo anti-Candida primário (1:500 em PBS-TB) por 4 horas em temperatura ambiente ou 8 horas a 4 °C.
    4. Remova as amostras primárias de anticorpos e lave oito vezes a cada 20 minutos com 0,3% de PBSTx (total ~2,5 horas).
    5. Incube amostras com anticorpo secundário anti-coelho conjugado com Alexa-568 (1:800 em PBS-TB) por 4 horas em temperatura ambiente ou 8 horas a 4 °C.
      NOTA: Proteja as amostras da luz para evitar o descolorimento fotográfico. Soluções de anticorpos podem ser reutilizadas.
    6. Remova amostras secundárias de anticorpos e lave as amostras oito vezes a cada 20 minutos com PBSTx 0,3%.
  6. Montagem opcional do ferrolho
    1. Coloque os animais sobre uma lâmina de microscópio com todos os animais orientados para a parte anterior para cima.
    2. Remova o excesso de água usando uma pipeta de transferência.
    3. Absorva cuidadosamente o líquido restante das bordas usando a borda de um papel toalha.
    4. Adicione 150–175 μL de meio de montagem com Gelvatol (Tabela 2 para composição) em gotas até que os animais estejam totalmente cobertos.
    5. Coloque cuidadosamente uma capa sobre a amostra, evitando bolhas de ar.
    6. Deixe o Gelvatol solidificar por pelo menos 2 horas antes da imagem.
    7. Armazene os slides em um local fresco e escuro para preservação a longo prazo.
  7. Imagem
    1. Amostre imagens usando excitação amarelo-esverdeada (~578 nm) e observe emissão laranja-avermelhada (~603 nm).
    2. Use uma lente objetiva 2x para visualizar padrões de mancha de animais inteiros.

8. Solução de problemas

  1. Se os desfechos da infecção forem inconsistentes, realize uma curva dose-titulação usando SN250 do tipo selvagem ou outra cepa de base em incrementos de 5–10 × 107 células/mL.
  2. Realize pelo menos três réplicas biológicas contendo de 5 a 10 animais por grupo.
  3. Inclua grupos de controle negativos e positivos para identificar possíveis problemas, como contaminação cruzada, falha na técnica asséptica, problemas de viabilidade da cepa ou má saúde animal de base.
  4. Após concluir o experimento de dose-titulação, o pool replica para determinar a sobrevivência mediana por grupo.
  5. Analise as diferenças de sobrevivência usando a análise logarítmica de Mantel–Cox por pares.
  6. Use a análise de sobrevivência de Kaplan–Meier para avaliar diferenças de tempo até a morte entre cepas ou tratamentos.
  7. Para condições de dose subletal ou infecciosa, analise os resultados sintomáticos do hospedeiro (por exemplo, fenótipos leves ou graves ou colonização fúngica) em vez da sobrevivência.
  8. Compare as respostas do hospedeiro entre grupos de dose para determinar a faixa de dose infecciosa ou letal adequada para experimentos subsequentes.

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Resultados

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Um protocolo atualizado para infectar planárias com C. albicans (Figura 1) e quantificar sistematicamente os resultados do hospedeiro (Figura 2) é apresentado. Esse fluxo de trabalho refinado apoia uma avaliação robusta de múltiplos parâmetros de infecção, incluindo morbidade (gravidade da doença sintomática), sobrevivência (letalidade), carga fúngica (CFUs) e dinâmica espaço-temporal da colonização de patógenos (imunoc...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Variar a dose infecciosa do tipo selvagem C. albicans produz diferenças reprodutíveis e dependentes da dose na morbidade em S. mediterranea, ressaltando a sensibilidade do modelo para avaliação quantitativa da virulência fúngica. Este protocolo delineia estratégias para estabelecer doses infecciosas e letais de base dentro de colônias planárias mantidas em laboratório e apresenta critérios para confirmar infecção sistêmica bem-sucedida por meio de imersão, integrando a ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.J.N. é cofundador da BioSynesis, Inc., uma empresa que desenvolve diagnósticos e terapêuticos para infecções por biofilme. Todos os outros autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem a todos os membros dos laboratórios Nobile, Oviedo e Hernday por discussões perspicazes sobre o modelo de infecção por S. mediterranea-C. albicans e são gratos à Edelweiss Pfister pelo manejo laboratorial e manutenção planária. Esse trabalho foi apoiado pelos prêmios do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIH) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R35GM156045 e R35GM124594 ao C.J.N., e R35GM158501 e R01GM132753 ao N.J.O. Esse trabalho também foi apoiado pela família Kamangar na forma de uma cátedra dotada para C.J.N. N.M.S. foi apoiado pelas bolsas do Center for Cellular and Biomolecular Machines (CCBM) do Centro de Excelência em Pesquisa em Ciência e Tecnologia (CREST) do Centro de Excelência em Pesquisa (NSF) sob os prêmios NSF-HRD-1547848 e NSF-EES-2112675.

Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, interpretação dos dados, redação do manuscrito ou decisão de publicar os resultados. O N.M.S. reconhece o uso do ChatGPT para ajudar na edição do manuscrito (verificando ortografia, gramática, formatação e estrutura das frases).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL  VWR/Genemate490004-436-BOXOF500Limpo, caixa de 500 peças
Frascos de cintilhão de 20 mLFisher Scientific12-100-006Frascos de vidro transparente para imunocoloração
Placas de poliestireno não tratado de 24 poçosFisher Scientific08-772-51Imunocoloração
Tubos microcentrífugas de 5,0 mL  Eppendorf/Sigma AldrichEP0030119487-200EALimpo, caixa com 200 peças
Placas de poliestireno não tratadas de 6 poçosFisher Scientific08-772-49Ensaios de infecção
AgarVWR89405-066Grau bacteriológico para meio YPD
AplicadoresThermo Fisher/Puritano22-029-491C. albicans cultivo
BioRenderBioRender Inc.N/ASoftware de design de figuras usado para gerar ilustrações esquemáticas
Cloreto de cálcio (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GÁgua planária/1x Montjuï C Salts
Candida albicans anticorpo policlonal anti-Rabbit, IgGThermo FisherPA1-27158Imunocoloração
Tubos centrífugasVWR89039-664C. albicans colheita
Tubos de cultura vidro borosilicato 18x150mmVWR47729-583C. albicans cultivo
CuvetasFisher Scientific14-955-127Para medir a densidade óptica de culturas
Dextrose (D-glicose)Fisher ScientificD16-3Médio do YPD
GlicerolFisher ScientificG33-4Grau de biologia molecular para suplementar para armazenamento criogênico de C. albicans 
Ferramenta de gráficos e visualização de dadosGraphPad/PrismSoftware estatístico e ferramenta de visualização. Versão 10.6.1.
Ferramenta de gráficosRSoftware estatístico. Versão 4.4.3.
Shaker IncubadorEppendorfEPM1282-0004-1EANew Brunswick Innova 44/44R para C. albicans cultivo
Cloreto de magnésio (MgCl2)SigmaM8266-100GPara água planárias  (1x Montjuï c sal)
Sulfato de magnésio (MgSO4)Sigma-AldrichM7506-500GPara água planárias  (1x Montjuï c sal)
Lâminas de microscópioVWR16004-368
Microscópio multizoomNikonNikon AZ100 
N-Acetil-L-cisteínaSigma AldrichA7250-50GReagente mucolítico e sacrificial  fixação
Paramaldeído, solução 16%, grau de biologia molecularCiências da Microscopia Eletrônica15710Reagente fixador
Motor Sem Fio de Pilão a PelletsFisher Scientific12-141-361Homogeneização planária
Peptone, grau bacteriológicoHIMEDIA/VWR89129-480Médio do YPD
PilõesFisher Scientific12-141-368Pellet descartável sem RNase para homogeneização planária
Placas de Petri, 100 x 15 mmVWR25384-342
Poliuretano (álcool vinílico)Sigma-AldrichP-8136 Para Gelvatol
Cloreto de potássio (KCl)Sigma Life ScienceP9541-500GMédio/água planárias/nbsp; (1x Montjuï c sal)
Anticorpo secundário anti-coelho de cabra, IgG, Alexa Fluor 568Fisher ScientificA-11011Imunocoloração
SN250Centro de Estoque de Genética FúngicaWildtype C. albicans strain (https://www.fgsc.net/)
Azida de SódioFisher ScientificS227-100Para Gelvatol
Bicarbonato de sódio (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KGMédio/água planárias/nbsp; (1x Montjuï c sal)
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma Life ScienceS3014-500GMédio/água planárias/nbsp; (1x Montjuï c sal)
EspectrofotômetroAgilent26354Microplaca BioTek Epoch 2 para medir densidade óptica
Incubadora EstáticaFisher Scientific15-015-2634C. albicans cultivo
Pipetas de transferênciaFisher Scientific13-711-9CMPippettes graduadas descartáveis estéreis para transferência de planárias
Tris BaseSigma-Aldrich252859Para Gelvatol
Extrato de leveduraThermo Fisher212750Médio do YPD

Referências

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