Validação da Integração e Expressão Aleatória de Transgenes em Parasitas Eimeria

Resumo

Aqui, apresentamos um método padronizado para validar a integração e expressão de genes estranhos em parasitas transgênicos Eimeria . Ao integrar análises genômicas e em nível proteico, esse fluxo de trabalho confirma a inserção e expressão estável de genes. Essa abordagem facilita o desenvolvimento de Eimeria transgênica para pesquisa e aplicações de vacinas.

Resumo

A validação dos parasitas transgênicos Eimeria é essencial para confirmar a integração genômica estável e a expressão dos genes exógenos. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho abrangente para verificar a inserção de transgenes e a expressão proteica em Eimeria tenella. O procedimento começa com a extração genômica de DNA de oocistos esporulados, seguida de amplificação por PCR para verificar preliminarmente a presença do fragmento alvo. Para confirmar ainda mais a integração genômica, é realizada a resequenciação do genoma completo para identificar locais de inserção e avaliar a estabilidade do construto integrado no genoma do parasita. A expressão proteica é posteriormente examinada por Western blot de lisatos preparados a partir de esporozoítos purificados, permitindo a detecção da proteína recombinante alvo. Além disso, a localização intracelular é visualizada por ensaio indireto de imunofluorescência (IFA) utilizando células hospedeiras infectadas. Juntos, esses ensaios fornecem uma estrutura robusta e reprodutível para validar linhas transgênicas de Eimeria . Esse fluxo de trabalho permite confirmação confiável da integração genômica e expressão proteica, apoiando assim aplicações posteriores em manipulação genética, genômica funcional e desenvolvimento de vacinas direcionadas a parasitas Eimeria .

Introdução

A coccidiose, causada pelas espécies de Eimeria, representa uma das doenças parasitárias mais economicamente significativas em aves, levando a redução no ganho de peso, má conversão de ração e perdas financeiras globais estimadas em bilhões de dólares a cada^{ano 1, 2,3}. A manipulação genética dos parasitas Eimeria tornou-se uma ferramenta poderosa tanto para pesquisas fundamentais quanto para o desenvolvimento de^{vacinas 4,5,6}. A transfecção estável permite a integração e expressão de genes exógenos, como repórteres fluorescentes ou antígenos protetores, possibilitando visualização em tempo real do desenvolvimento de parasitas e avaliação direcionada de candidatos a vacina ^7,8,9.

Uma publicação anterior de Duan et al. forneceu um protocolo padronizado para a nucleofecção e propagação in vivo da Eimeria transgênica, estabelecendo um método eficiente para gerar e enriquecer linhas de parasitas^{recombinantes 10}. No entanto, atualmente não existe um fluxo de trabalho unificado para confirmar a integração genômica estável e a expressão funcional dos transgenes. Essa validação é fundamental para garantir a autenticidade, estabilidade e reprodutibilidade das linhas transgênicas usadas em estudos biológicos posteriores ou aplicações de vacinas.

Este artigo apresenta um protocolo completo e passo a passo para validar a integração e expressão do transgene em Eimeria tenella, utilizando uma linha transgênica de E. tenella que expressa o antígeno VP2 (Et-VP2) vírus infeccioso da doença bursal (IBDV) como modelo¹¹. O plasmídeo de expressão p5′AMic2linkerVP2m3′A, portando o gene VP2 e um repórter mCherry, foi transfectado em esporozoítos selvagens de E. tenella (Et-WT). Oocistos fluorescentes vermelhos foram isolados por triagem celular ativada por fluorescência (FACS) e transmitidos em série em galinhas livres de coccídio. Este fluxo de trabalho demonstra procedimentos para extração genômica de DNA, análise preliminar de integração baseada em PCR, resequenciamento do genoma inteiro para identificar locais de inserção, Western blotting para verificar a expressão proteica e ensaio indireto de imunofluorescência (IFA) para visualizar a localização intracelular da proteína recombinante. Juntos, esses métodos fornecem uma estrutura reprodutível e abrangente para confirmar a autenticidade das linhas transgênicas de Eimeria , permitindo seu uso confiável em pesquisa em genômica funcional e desenvolvimento de vacinas.

Protocolo

Todos os experimentos com animais envolvendo galinhas foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Agrícola da China (número de aprovação: CAU20160628-2). Todos os procedimentos de criação e experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal da Universidade Agrícola da China e em conformidade com os Princípios Orientadores Internacionais para Pesquisa Biomédica envolvendo Animais. Frango Leghorn branco (SPF) macho específico de sete dias de vida foram usados neste estudo. As aves foram mantidas sob condições padrão de gestão, com livre acesso a alimentação e água durante todo o período experimental. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Extração de DNA genômico de oocistos esporulados de espécies de Eimeria.

1. Transfira 1 mL de uma suspensão de oocistos (≥1 × 10⁷/mL) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione um volume igual de contas de vidro de 1 mm correspondente ao pellet de oocisto. Desregule os oocistos usando um homogeneizador de tecidos batendo vigorosamente a 60 Hz por 5 minutos até que as paredes do oocistos estejam completamente quebradas e o conteúdo seja liberado.
2. Recolha a mistura (excluindo as esferas de vidro) em um tubo novo e centrifuge a 12.000 x g por 1 minuto. Descarte o sobrenadante, adicione 500 μL de tampão CTAB e 40 μL de proteinase K, e incube a mistura a 60 °C por 30 minutos.
3. Adicione 500 μL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), o vórtice por 10 s e centrifuge a 12.000 x g por 5 minutos. Transfira a fase aquosa superior para um novo tubo.
   NOTA: Tampe e descarte firmemente o tubo contendo a camada orgânica para evitar a contaminação do ambiente. (Opcional) Se a contaminação por proteínas permanecer alta, repita a etapa 1.3 1–2 vezes adicionais.
4. Adicione 500 μL de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1), vórtice por 10 s e centrifuge a 12.000 x g por 5 min. Transfira a fase aquosa para um novo tubo e adicione um volume igual de isopropanol. Misture por inversão até que apareçam precipitados de DNA.
   NOTA: A precipitação a −20 °C por ≥1 hora ou durante a noite aumenta o rendimento.
5. Centrifuge a 12.000 x g por 10 minutos para pelletar DNA. Lave o pellet com 70% de etanol, centrifuge a 12.000 x g por 5 minutos e descarte o sobrenadante. Remova cuidadosamente o líquido residual com uma bomba de vácuo e seque o pellet ao ar em temperatura ambiente ou 37 °C.
6. Dissolva o pellet de DNA seco em um tampão_{ddH 2O}ou TE contendo RNase. Incube a 37 °C por ≥1 hora ou a 4 °C durante a noite para remover o RNA residual. Armazene o DNA purificado a −20 °C.
   NOTA: Para preservação a longo prazo, pellets de DNA não dissolvido podem ser armazenados diretamente a −20 °C ou −80 °C. Avalie a integridade e concentração do DNA por eletroforese em gel de agarose antes das aplicações posteriores.

2. Verificação por PCR da presença do construto Et-VP2 no genoma do parasita

1. Pares de primers de projeto (Tabela 1) para verificar a integração genômica do construto Et-VP2.
   NOTA: As sequências de primers foram projetadas usando Primer-BLAST, com parâmetros típicos de comprimento de primer de 18–24 pb, temperatura de fusão de aproximadamente 55–60 °C e formação mínima de estruturas secundárias. A especificidade de cada par de primer foi posteriormente verificada em relação ao genoma de Eimeria tenella para evitar amplificação inespecífica.
2. Prepare uma mistura de reação de 50 μL contendo 25 μL de 2× Taq Master Mix, 21 μL de ddH₂O, 1 μL de espoletas diretas e reversas e 2 μL de molde de DNA.
3. Realizar amplificação usando as seguintes condições de ciclo térmico: desnaturação inicial a 95 °C por 5 minutos; 30 ciclos de 95 °C por 30 s, 55 °C por 30 s e 72 °C por 1 min; seguida de uma extensão final a 72 °C por 10 minutos.
   NOTA: Certifique-se de que todos os reagentes estejam bem misturados antes do ciclo térmico. Use modelos de DNA recém-preparados para alcançar a eficiência ideal de amplificação.

3. Resequenciamento da linha parasita transgênica (Et-VP2)

1. Submissão de exemplos e construção da biblioteca
   1. Submeta uma suspensão de oocisto de 1 mL (≥1 × 10⁷/mL) para um provedor comercial de serviços de sequenciamento para análise de resequenciamento de próxima geração.
   2. Após avaliação da qualidade do DNA genômico, fragmente-se o DNA por interrupção mecânica usando ultrassom. Purificar o DNA fragmentado, realizar reparos nas extremidades, adicionar uma base de adenina (A) às extremidades 3′ e ligar adaptadores de sequenciamento.
   3. Selecione fragmentos de DNA do tamanho desejado usando eletroforese em gel de agarose e realize amplificação por PCR para construir a biblioteca de sequenciamento.
   4. Submeta a biblioteca construída à inspeção de qualidade. Realize sequenciamento de extremidades pareadas na plataforma Illumina NovaSeq usando um comprimento de leitura de 150 bp. Mantenha uma profundidade de sequenciamento de 100× para garantir a precisão dos dados, gerando pelo menos 6 GB de dados brutos com uma pontuação mínima de qualidade de Q20 >90%.
      NOTA: Manuseie todos os reagentes e amostras de DNA usando técnicas assépticas para evitar contaminação. Verifique se os parâmetros de sequenciamento atendam às métricas de profundidade e qualidade exigidas antes de prosseguir para a análise dos dados.
2. Análise de dados
   1. Filtre os dados brutos de sequenciamento usando o software Fastp (v0.23.2) de acordo com o seguinte^{critério 12}:
      1. Remova as sequências dos adaptadores.
      2. Defina o limite de baixa qualidade para Q20 e remova leituras em que bases de baixa qualidade representam mais de 30% do comprimento total da leitura.
      3. Remova leituras menores que 50 pb.
   2. Alinhe as leituras controladas de qualidade ao genoma de referência de E. tenella (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) usando o software Bowtie2 (v2.4.5)¹³. A aleatoriedade dos dados de sequenciamento de próxima geração é avaliada com base na profundidade e uniformidade da cobertura.
   3. Certifique-se de que as leituras de sequenciamento estejam alinhadas à sequência vetorial transgênica. Remova as leituras que não mapeiam a região do T-DNA para obter leituras quiméricas, nas quais uma extremidade mapeia para o T-DNA e a outra para o genoma de referência de E. tenela .
   4. Com base nas sequências das leituras quiméricas, realize o alinhamento usando o ToxoDB (release 64) para determinar a localização específica dos possíveis sítios de inserção do T-DNA. Analise a profundidade de sequenciamento entre regiões homólogas entre o vetor e o genoma de Eimeria (ou seja, as regiões regulatórias 5′ e 3′) usando o software Mosdepth (v0.3.3)¹⁴.
   5. Identifique os potenciais locais de integração do plasmídeo transgênico dentro do genoma de E. tenella e verifique-os por PCR usando o sistema de reação descrito na etapa 2.1.
      NOTA: Garantir o uso consistente de versões do software e configurações de parâmetros durante toda a análise para manter a precisão e reprodutibilidade dos dados.

4. Manchamento ocidental das proteínas transgênicas de Eimeria

1. Colete uma suspensão PBS contendo pelo menos 5 × 10⁶ esporozoitos em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrifuge a 2500 x g por 5 minutos. Ressuspenda o pellet em um tampão de lise RIPA de 100 μL e incube no gelo por 1 hora. Adicione 20 μL de tampão de carga de proteína de 6× e aqueça a mistura a 100 °C por 10 minutos.
2. Prepare os géis SDS-PAGE usando uma placa de vidro de 1,5 mm. Ajuste a concentração de acrilamida de acordo com o peso molecular da proteína alvo. Durante a polimerização, sobreponha o gel separador com água destilada para garantir uma superfície uniforme antes de adicionar o gel de empilhamento.
3. Centrifuge o lisado a 10.000 x g por 5 minutos e carregue 40 μL de sobrenadante em cada faixa de amostra. Carregue 10 μL de marcador de proteína em uma faixa separada e preencha quaisquer faixas restantes com 40 μL de 1× de buffer de carga como controle.
4. Realize eletroforese em 1× tampão funcionando a 70 V por 20 minutos, seguido por 120 V por 60–90 minutos, até que a frente do corante alcance o fundo do gel.
5. Extraia o gel de acordo com o tamanho esperado da proteína. Pré-ative uma membrana PVDF em metanol por 1 minuto e monte o sanduíche de transferência na seguinte ordem: esponja, papel filtrante, gel (lado do cátodo), membrana PVDF, papel filtrante, esponja. Remova qualquer bolha de ar e transfira proteínas a 70 V por 3 horas em um tampão de transferência.
6. Lave a membrana três vezes com PBST (5 min cada) e bloqueie com leite desnatado a 5% por 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C. Lave a membrana duas vezes com PBST para remover a solução residual bloqueadora.
7. Incubar a membrana com anticorpos primários diluídos em tampão de anticorpos: anti-Flag policlonal de camundongo (1:2000) e anti-GAPDH monoclonal de camundongo (1:2000). Incube por 1 hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C com sacudidas suaves. Colete a solução de anticorpos e lave a membrana cinco vezes com PBST (5 min cada).
8. Incube a membrana com IgG anti-camundongo conjugado com HRP (1:2000) por 1 hora em temperatura ambiente. Lave a membrana cinco vezes com PBST (5 min cada).
9. Prepare um substrato ECL misturando volumes iguais da solução A e B. Aplique o substrato uniformemente à membrana e detecte sinais proteicos usando um sistema de imagem quimioluminescência.
   NOTA: Realize todas as etapas envolvendo amostras de proteína no gelo, salvo indicação em contrário. Manuseie substratos de metanol e ECL em uma capela de fumaça enquanto usa luvas e óculos de proteção.

5. Ensaio de Imunofluorescência Indireta Intracelular (IFA) da Eimeria transgênica

1. Purificação de esporozoítos usando uma coluna de cromatografia
   1. Conecte a coluna de cromatografia a uma bomba peristáltica e ajuste a vazão para 50–60 Hz. Lave a coluna com água destilada e solução de glicina.
   2. Adicione suspensão de celulose DE-52 à coluna enquanto adiciona continuamente solução de glicina até que a camada de celulose atinja aproximadamente 1 cm de altura.
   3. Carregue esporozóitos purificados pelo método Percoll na coluna. Mantenha uma vazão de 30–40 Hz usando solução de glicina e colete o fluxo em um tubo centrífuga de 50 mL.
   4. Monitore o eluado colocando gotas sobre uma lâmina de vidro para observação microscópica. Quando nenhum esporozoíto for detectado, pare a bomba. Centrifuge a fração coletada a 2.500 x g por 5 minutos, descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet em PBS.
      NOTA: Realize todas as etapas em condições estéreis para evitar contaminação microbiana. Descarte glicina e resíduos de Percoll conforme as normas institucionais de biossegurança.
2. Infecção por esporozoíto das células HFF
   1. Semente 1 × 10^{10 6} esporozoítos em placas de 24 poços contendo monocamadas de células HFF. Adicione penicilina-estreptomicina a uma concentração final de 1× (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina), misture delicadamente e incube a 37 °C por 4–6 horas para permitir a invasão. Remova o médio, lave uma vez com 1 mL PBS e descarte o sobrenadante.
   2. Remova cuidadosamente as coberturas de vidro dos poços usando pinças estéreis e transfira-as para uma nova placa de 24 poços. Fixe as amostras em 1 mL de paraformaldeído a 4% por 30 minutos, lave uma vez com 1 mL de PBS e descarte o sobrenadante.
   3. Permeabilize as células com 1 mL de 0,25% de Triton X-100 por 30 minutos. Lave uma vez com 1 mL de PBS e descarte o sobrenadante.
   4. Bloqueie as amostras com 1 mL de 3% de BSA por 30 minutos. Lave uma vez com 1 mL de PBS e descarte o sobrenadante.
   5. Diluir anticorpo monoclonal anti-Flag de camundongo (1:200) em 3% de BSA. Coloque gotas do anticorpo diluído sobre o filme de vedação e inverta as coberturas (lado da célula para baixo) sobre as gotas. Incube as coberturas em uma câmara umidificada a 37 °C por 1 hora. Lave três vezes com 1 mL de PBS (5 min cada).
   6. Diluir IgG anti-camundongo conjugado com FITC (1:200) e Hoechst 33258 (1:100) em 3% de BSA. Coloque gotas da mistura de mancha sobre filme de vedação e inverta as coberturas sobre as gotas. Incube em uma câmara umidificada a 37 °C por 1 hora, depois lave cinco vezes com 1 mL de PBS (5 min cada).
   7. Monte os revestimentos colocando um meio de montagem antifade de 5 μL em uma lâmina de vidro. Inverta o coverslip (lado da célula para baixo) sobre a queda, evitando bolhas de ar, e fele as bordas. Armazene as lâminas montadas em uma câmara umidificada a 4 °C até a imagem.
      NOTA: Manuseie paraformaldeído e Triton X-100 em um exaustor químico enquanto usa luvas e proteção ocular. As formulações de reagentes usadas neste procedimento estão listadas na Tabela 2.

Resultados

A análise genômica por PCR confirmou a presença do fragmento-alvo nos parasitas transgênicos, enquanto nenhuma faixa correspondente foi detectada no controle do tipo selvagem (Figura 1A). O resequenciamento do genoma inteiro demonstrou ainda que o plasmídeo linearizado foi estável integrado ao genoma do parasita, e o local de integração previsto foi validado por amplificação por PCR na região da junção (Figura 1B).

Discussão

Este protocolo estabelece um fluxo de trabalho abrangente para validar a integração genômica, expressão proteica e localização intracelular de genes exógenos em E. tenella transgênica. Em vez de depender de um único ensaio, a abordagem combina evidências genômicas e em nível proteico, garantindo que a inserção do transgene seja tanto estruturalmente confirmada quanto funcionalmente expressa.

Várias etapas críticas desse protocolo influenciam fortement...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Antifade Mounting Medium	MCE	HYK1042	Fluorescent mounting medium to prevent photobleaching
BSA (3%)	Beyotime	ST023	Blocking buffer and antibody dilution buffer for IFA; block at room temperature for 30 min
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)	Sigma	C0549	Reagent for removing residual phenol during genomic DNA extraction
Coccidia-Free Chickens	Boehringer-Ingelheim	SPF	Used for in vivo passage and amplification of transgenic strains; approved by the Ethics Committee (approval number: CAU20160628-2)
CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide)	Merck KGaA	H5882	Component of genomic DNA extraction buffer; formulation: 3 g CTAB + 12.27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0.5 mol/L EDTA, adjusted to a final volume of 150 mL with ddH2O
DE-52 Cellulose	Solarbio	C8350	Ion exchange chromatography medium for sporozoite purification; sequentially treated with NaOH, HCl, and distilled water, then equilibrated with glycine solution
ECL Substrate (Solution A + Solution B)	thermofisher	32106	Chemiluminescent detection reagent; mix equal volumes of Solution A and B before use
FITC-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG	Sigma	AP124F	Fluorescent secondary antibody for IFA, dilution ratio 1:200
Glass beads	Sigma	Z250473-1PAK
Glycine Solution	Sigma	67419	Equilibration and elution buffer for chromatography columns; formulation: 0.75 g glycine + 7.9 g NaCl dissolved in 500 mL distilled water, pH adjusted to 7.4-7.6, autoclaved
Hoechst 33258	Sigma	94403	Nuclear staining reagent, dilution ratio 1:100; used for IFA localization
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG	Sigma	12-349	Secondary antibody for Western blotting, dilution ratio 1:2000
Illumina NovaSeq Sequencing Platform	Personalbio Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China)		Next-generation sequencing platform; paired-end sequencing (150 bp read length), sequencing depth 100×, generating ≥6 GB raw data (Q20>90%)
Low Speed Centrifuge	BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE	DT5-2
Mouse Monoclonal Anti-Flag Antibody	Sigma	F1804	Primary antibody, dilution ratio 1:200; used for IFA detection of Flag-tagged fusion protein
Mouse Monoclonal Anti-GAPDH Antibody	Sigma	G8795	Primary antibody, dilution ratio 1:2000; used as a loading control for Western blotting
Nonfat Milk (5%)	Beyotime	P0216	Blocking buffer for Western blotting; block at room temperature for 1 h or 4°C overnight
Paraformaldehyde (4%)	Merck KGaA	30525	Cell fixation solution; fix at room temperature for 30 min
PBS	Solarbio	P1010
Penicillin-Streptomycin (100×)	Yeasen	60162ES76	Antibiotic for cell culture; inhibits microbial contamination
Percoll (DG gradient stock	GE Healthcare	17-0891-09
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)	Merck KGaA	77617	Reagent for protein removal during genomic DNA extraction
Protein Loading Buffer (6×)	Beyotime	P0015F	Protein electrophoresis loading buffer; formulation: 100 mM Tris (pH 6.8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% glycerol, 6 M urea; mix with 50 μL 2 M DTT and 50 μL 5% bromophenol blue before use
Proteinase K	Merck KGaA	39450-01-6	200 mg dissolved in 10 mL ddH2O, used for protein digestion during genomic DNA extraction
PVDF Membrane	thermofisher	88518	Protein transfer membrane; activated with methanol for 1 min before use
RIPA Lysis Buffer	Yeasen	20101	Lysis buffer for sporozoite protein extraction
RNase A	Merck KGaA	9001-99-4	25 mg dissolved in 2.5 mL 0.01 mol/L NaAc, heated at 100°C for 10-15 min, pH adjusted to 7.4 with 1 mol/L Tris-HCl; used for RNA removal from DNA samples
SDS-PAGE Gel Reagents (Acrylamide, Bis-acrylamide, Tris, SDS, APS, TEMED)	Bio	101	Reagents for SDS-PAGE gel preparation; acrylamide concentration adjusted according to the molecular weight of the target protein
Sodium taurodeoxycholate hydrate	Sigma	T0875
solution)
Taq Master Mix (2×)	Vazyme	P112-01/02/03	PCR amplification premix containing Taq polymerase, dNTPs, etc.
Triton X-100 (0.25%)	Merck KGaA	9036	Cell permeabilization solution; incubate at room temperature for 30 min
Trypsin	Solarbio	T8150
Vortex Mixer	Beijing North TZ-Biotech	HQ-60-II
Water Bath Thermostat	Grant Instruments (Cambridge)	GD120,GM0815010