Artigo de método

Um método HPLC-QQQ-MS eficiente e rápido para a quantificação de alcaloides tropanos em plantas medicinais

DOI:

10.3791/70510

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12 de junho de 2026

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1College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este estudo desenvolveu uma cromatografia líquida de alta performance combinada com o método de espectrometria de massa tripla quadrupolar (HPLC-QQQ-MS) para identificar e quantificar alcaloides de tropano (hiosciamina, anisodamina, escopolamina) em Anisodus tanguticus. O método provou ser rápido, preciso e confiável para análises de alta produtividade de plantas medicinais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anisodus tanguticus é uma importante planta medicinal tibetana. Os alcaloides tropanos (TAs), como hiosciamina, anisodamina e escopolamina, exibem atividades farmacológicas significativas de analgésicos e sedativos, tornando essa espécie uma fonte natural valiosa para extração desses compostos bioativos. No entanto, a composição química de A. tanguticus é altamente complexa. Inclui um grande número de compostos sem estruturas elucidadas, tornando a identificação sistemática e caracterização estrutural de seus constituintes ativos particularmente importantes. Embora a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) tenha sido amplamente utilizada para a separação de extratos dessa planta, muitos componentes desconhecidos continuam sendo desafiadores de identificar com precisão, mesmo com correspondência de bancos de dados espectrais.

Este estudo estabeleceu um método analítico baseado em cromatografia líquida de alta performance combinada com espectrometria de massa quadrupolar tripla (HPLC-QQQ-MS) para a determinação de alcaloides tropanos em A. tanguticus. O método abrange uma série de procedimentos sistemáticos, incluindo preparação padronizada da amostra, configuração de parâmetros de espectrometria de massa, pré-equilíbrio de LC, estabelecimento do método, aquisição de dados MS, varredura de espectrometria de massa multiestágio (MSⁿ) e interpretação manual de dados. Usando essa estratégia, identificamos com sucesso três alcaloides representativos de tropanos em A. tanguticus: hiosciamina, anisodamina e escopolamina. Além disso, valida a precisão do método estabelecido HPLC-QQQ-MS, confirmando que o método é rápido, sensível, viável e preciso para a determinação quantitativa dos alcaloides de tropanos (TAs) em A. tanguticus. A abordagem estabelecida demonstra boa versatilidade e confiabilidade, sendo adequada para a identificação e quantificação de alto rendimento de alcaloides de tropano em A. tanguticus e outras plantas medicinais.

Introdução

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A eficácia terapêutica da medicina tradicional chinesa (MTC) depende em grande parte de seus metabólitos secundários, como alcaloides, flavonoides, terpenoides e outros constituintesativos 1,2,3. Consequentemente, a análise qualitativa e quantitativa precisa e sensível de metabólitos-alvo específicos nessas misturas complexas é um passo fundamental para garantir a qualidade da MTC, elucidar a base material de sua eficácia e avançar a pesquisamoderna 3. No entanto, a diversidade e complexidade dos componentes da MTC, aliadas às concentrações extremamente baixas de muitos ingredientes ativos-chave, apresentam desafios consideráveis para alcançar uma detecção eficiente e precisa.

Anisodus tanguticus (Maxim.) Pascher representa uma importante fonte botânica de alcaloides de tropanos (TAs)4, conhecida por seu rico conteúdo de compostos do tipo tropano farmacologicamenteativos. Alcaloides características chave incluem anisodamina, escopolamina e hiosciamina, que compartilham um núcleo tropano comum, mas apresentam substituições funcionais distintas (Figura 1), levando a perfis farmacológicosdivergentes 6,7,8. Embora suas semelhanças estruturais compliquem a resolução cromatográfica, eles também oferecem um modelo valioso para investigações fitoquímicas e metabólicas comparativas. Estudos recentes investigaram a composição química e as variações geográficas de A. tanguticus usando metabolômica e abordagens de farmacologiaem redes 9,10. As abordagens analíticas atuais para os metabólitos de A. tanguticus dependem predominantemente da cromatografia líquida de alta performance (HPLC)11. No entanto, os níveis de alcaloides de tropano em mudas de A. tanguticus podem ser tão baixos quanto 0,01% (uma parte por dez mil), e os métodos convencionais de HPLC frequentemente são limitados por resolução, sensibilidade e capacidade analítica limitadas. Essas limitações impedem a separação completa de homólogos alcaloides estruturalmente análogos e dificultam a detecção de constituintes traço, comprometendo assim a precisão analítica e limitando o suporte a aplicações de pesquisa mais avançadas. Nos últimos anos, avanços em HPLC, aliados à espectrometria de massa em tandem, forneceram ferramentas poderosas para enfrentar esses gargalos analíticos. Cromatografia líquida de alto desempenho-espectrometria de massa quadrupolar tripla (HPLC-QQQ-MS), em particular, oferece resolução cromatográfica significativamente aprimorada, eficiência de separação e sensibilidadeexcepcional 12,13,14. Essa tecnologia surgiu como uma plataforma de ponta para a investigação de metabólitos secundários na MTC, permitindo a qualificação e quantificação eficiente e precisa de analitos-alvo traço dentro de intrincadas matrizesbiológicas 11,15,16,17. Como tal, fornece uma base técnica sólida para o perfilamento químico abrangente e avaliação da qualidade de plantas medicinais como A. tanguticus. Neste estudo, abordamos os desafios persistentes na detecção de alcaloides tropanos em A. tanguticus, com ênfase na identificação e quantificação precisas de constituintes em nível traço. Ao otimizar sistematicamente as condições cromatográficas e espectrométricas de massa, desenvolvemos e validamos um novo método HPLC-QQQ-MS para a determinação simultânea de múltiplos alcaloides principais de tropanos. A abordagem otimizada aumenta significativamente a sensibilidade, a seletividade e a robustez metodológica, superando assim limitações comuns associadas aos ensaios convencionais baseados em espectrometria de massa — como sensibilidade inadequada, efeitos matriciais e interferência de co-elução — frequentemente encontrados durante a análise de compostos alcaloides traço.

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Protocolo

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1. Preparação da amostra

  1. Preparação de soluções padrão
    1. Pese com precisão 10,0 mg de padrões de referência de hiosciamina, hidrobrometo de anisodamina e hidrobrometo de escopolamina usando uma balança analítica de um décimo milésimo, e coloque-os em frascos volumétricos separados de 10 mL, respectivamente.
    2. Adicione metanol de grau cromatográfico à linha marcada e dissolva completamente os padrões usando tratamento ultrassônico para preparar soluções padrão únicas com concentração de 1,0 mg/mL.
    3. Transfira as soluções originais para frascos de reagente marrom, armazene-os a 4 °C no escuro.
      NOTA: Os alcaloides usados são altamente tóxicos. Tome precauções de segurança ao manusear as amostras padrão. Todas as soluções foram preparadas frescas antes da análise e armazenadas a 4 °C no escuro para evitar degradação.
  2. Preparação de soluções de trabalho mistas
    1. Pipete 100 μL de cada solução padrão mencionada em um frasco volumétrico de 10 mL e dilua até a linha marcada com metanol de grau cromatográfico para preparar uma solução intermediária padrão mista de 10 μg/mL.
    2. De acordo com os requisitos de intervalo linear, diluir ainda mais a solução intermediária passo a passo com metanol para obter uma série de soluções de trabalho mistas.
    3. Pegue 50 μL, 200 μL e 500 μL, respectivamente. Obtenha concentrações de 0,5 μg/mL, 2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL. Prepare fresco antes de usar.
    4. Transfira 100 μL da solução intermediária de 10 μg/mL para um frasco volumétrico de 1 mL para preparar uma solução diluída de 1 μg/mL.
    5. Depois, transfere 100 μL da solução de 1 μg/mL para outro frasco volumétrico de 1 mL e dilui-o até o volume com metanol.
  3. Pré-tratamento de amostras
    1. Realize a liofilização dos materiais frescos de Sophora flavescens e, em seguida, pulverize em um pó homogêneo usando um moedor de alta velocidade.
    2. Peneira a pólvora por uma peneira padrão de 0,25 mm. Pese com precisão 20 mg desse pó, transfira-o para um frasco volumétrico de 100 mL e adicione metanol de grau cromatográfico quase na linha marcada.
    3. Realize extração ultrassônica em temperatura ambiente por 30 minutos. Após a extração, retire o frasco volumétrico, deixe esfriar a 25 °C em temperatura ambiente, reabasteça o metanol de grau cromatográfico até a linha marcada de 100 mL e faça a mistura de vórtice por 2 minutos.
    4. Pipete 1 mL do extrato acima em um frasco volumétrico de 100 mL e dilua até a linha marcada com metanol (diluição de 100 vezes). Após sacudir bem, ele serve como solução mãe para a injeção de HPLC (Figura 2).
      NOTA: Ao operar a máquina de moagem de alta velocidade, é essencial usar óculos de proteção e máscara contra poeira; Controle a quantidade e a duração da moagem para evitar superaquecimento.
  4. Filtragem e armazenamento de amostras
    1. Prepare uma seringa descartável sem agulha de 1 mL (especializada em cromatografia, não adsortiva) e uma membrana microporosa em fase orgânica de 0,22 μm.
    2. Aspire 1,2 mL da solução mãe para injeção e pressione lentamente para filtração.
    3. Recolha o filtrado subsequente em um frasco de amostra de 2 mL com um inserto interno e sele firmemente com uma tampo.
      NOTA: A frequência do purificador ultrassônico é fixa em 40 kHz. Evite afrouxar a tampa do frasco volumétrico durante a extração para evitar a volatilização do solvente. Ajuste o fator de diluição de acordo com a resposta do pico da amostra no pré-experimento para garantir que a área do pico alvo esteja dentro da faixa linear da curva padrão. Todas as amostras devem ser armazenadas imediatamente na geladeira a 4 °C.

2. Pré-run do HPLC, estabelecimento do método e aquisição do MS

  1. Preparação de fases móveis
    1. Prepare a fase móvel A: Meça 1000 mL de água ultrapura, adicione 1,0 mL de ácido fórmico de grau cromatográfico (fração volumétrica: 0,1% v/v) e misture uniformemente usando um agitador magnético por 10 minutos.
    2. Preparar a fase móvel B: Utilizar metanol de grau cromatográfico diretamente sem tratamento adicional.
    3. Despeje as fases móveis A e B em dispositivos de desgaseificação ultrasônica, respectivamente, e realize desgaseificação ultrassônica a 40 kHz por 15 minutos.
    4. Transfira imediatamente as fases móveis desgaseificadas para frascos de solvente após o desgaseificação, sele-as e conecte-as às linhas de solvente A e B correspondentes do sistema HPLC.
      NOTA: Todos os solventes são de grau cromatográfico e devem ser filtrados por uma membrana microporosa de fase orgânica de 0,45 μm antes do uso. Monitore a pressão do sistema regularmente. Se a flutuação de pressão ultrapassar ±±5%, verifique possíveis entupimentos ou bolhas de ar no duto.
  2. Definição das condições do HPLC
    1. Use uma coluna C₁₈ (2,1 mm × 100 mm, 2,7 μm) para separação cromatográfica. Equilibre a coluna com metanol:água = 80:20 (v/v) por 30 minutos antes do uso, com uma vazão de 0,3 mL/min durante o equilíbrio. Ajuste a temperatura do forno de coluna para 30 °C e comece a pré-aquecer com 10 minutos de antecedência.
    2. Otimize um programa de elução de gradiente da seguinte forma: 0–10,0 min, 5% a 10% B; 10,0–15,0 min, 10% a 35% B; 15,0–20,0 min, 35% a 60% B; 20,0–25,0 min, 60% a 95% B. Ajuste a vazão para 0,60 mL/min, o volume de injeção para 2 μL e o comprimento de onda de detecção para 210 nm.
  3. Condições de espectrometria de massa
    1. Realizar detecção por espectrometria de massa (MS) usando um espectrômetro de massa triplo quadrupolo (QQQ) equipado com uma fonte de ionização por eletrospray (ESI) operando em modo de ionização positiva (ESI+).
    2. Defina os parâmetros de operação da seguinte forma: pressão do nebulizador: 15 psi; voltagem capilar: 4000 V; temperatura do gás: 300 °C; e fluxo de gás: 11 L/min.
    3. Otimize sistematicamente os parâmetros MS/MS para cada analito.
      1. Primeiro, identifique íons precursores infundindo diretamente soluções padrão individuais no modo SCAN MS2 .
      2. Otimize a tensão do fragmentador para cada íon precursor até a intensidade máxima do sinal usando o modo SIM MS2.
      3. Em seguida, utilize o modo de Varredura Iônica Produto para determinar os íons produto característicos. Otimize sistematicamente a Energia de Colisão (CE) para o íon precursor para maximizar a intensidade do sinal produto-íon.
      4. Selecione o íon produto mais intenso para quantificação e use o segundo íon mais intenso para confirmação qualitativa.
        NOTA: Identificar íons precursores por meio da infusão direta de soluções padrão individuais no modo SCAN MS2. Certifique-se de que a concentração padrão de solução seja adequada para evitar a saturação do sinal. Calibre o instrumento regularmente para evitar desvio de parâmetros.
  4. Validação de métodos
    1. Especificidade
      1. Injete solvente em branco (metanol), mistura de solução padrão de trabalho e extrato de amostra separadamente, e compare os cromatogramas.
      2. Certifique-se de que os seguintes requisitos sejam atendidos: Nenhum pico interferente no solvente em branco; o tempo de retenção dos componentes-alvo na amostra é consistente com o do padrão (desvio ≤ ±±0,1 min); A razão de área de pico do íon quantificador para o íon qualificador está em conformidade com a do padrão (desvio ≤ ±±10%).
    2. Linearidade
      1. Injetar a série de soluções de trabalho mistas preparadas no passo 1.1 (0,1, 0,5, 2, 5, 10 μg/mL) sequencialmente sob as condições mencionadas HPLC-MS, com 3 injeções por concentração.
      2. Plote a curva padrão com a concentração (x, μg/mL) de cada componente como a abscisa e a área média de pico (y) do íon quantificador como a ordenada. Realize uma análise de regressão linear, exigindo um coeficiente de correlação (R2) ≥ 0,995.
    3. Precisão e exatidão
      1. Precisão intradiária (repetibilidade): Analise 6 réplicas de amostras de controle de qualidade (QC) em três níveis de concentração (2 μg/mL, 5 μg/mL e 10 μg/mL) em um dia e calcule o desvio padrão relativo (RSD%).
      2. Precisão interdia (precisão intermediária): Preparar independentemente amostras de controle de qualidade do mesmo lote de matéria-prima vegetal seca e analisá-las por diferentes operadores em três dias consecutivos. e calcular o RSD%. Garanta RSD% ≤ 10% para ambos.
      3. Avalie a precisão usando um teste de recuperação por pico e expresse como uma taxa de recuperação (%). Garantir que a taxa média de recuperação de concentrações baixas, médias e altas varie de 85% a 115%, com RSD% ≤ 5%.
        NOTA: A faixa linear deve cobrir a faixa esperada de concentração dos componentes-alvo em amostras reais (incluindo níveis baixos, médios e altos) para refletir a aplicabilidade prática. Todos os experimentos de validação foram realizados em triplicado, e os resultados foram expressos como o valor médio.

3. Aquisição de dados

  1. Realize a aquisição de dados no modo de monitoramento de reações múltiplas (MRM). Consulte a Tabela 1 para os parâmetros otimizados do MRM — incluindo íons precursores, transições iônicas de produto, tensão do fragmentador e energia de colisão (CE) — para cada analito.
  2. Calcule o tempo de permanência para garantir um número adequado de pontos de dados em cada pico cromatográfico para cada transição, mantendo um tempo de ciclo apropriado.

4. Análise de dados

  1. Inicie o software de análise qualitativa, clique em Arquivo > Importar Dados e importe todos os arquivos de dados coletados (formato .d).
  2. Extração dos cromatogramas iônicos extraídos (EICs): No módulo de Quantificação , selecione Transição MRM, insira os pares iônicos iônico-produto precursores de cada componente e extraia os EICs correspondentes.
  3. Validação e integração de picos: Verifique a simetria de pico e a consistência do tempo de retenção (desvio ≤ ±±0,1 min em comparação com o padrão) dos picos alvo em cada EIC.
  4. O software realiza integração automática por padrão; Se existirem derivações de linha de base ou picos de interferência, ajuste manualmente os parâmetros de integração (pontos de início e fim da integração) para garantir uma integração precisa.
  5. Calcule a concentração de cada componente em amostras desconhecidas usando a curva padrão. Clique em Relatório > Gerar Relatório, selecione o formato Excel para exportar o relatório. O relatório inclui o nome do composto, tempo de retenção, área de pico, concentração, RSD%, etc.

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Resultados

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Separação cromatográfica e identificação de TAs HPLC-QQQ-MS
Um cromatograma típico de MRM obtido da análise de uma mistura padrão e um extrato de raiz de A. tanguticus é apresentado nas Figuras 3 e 4. Sob as condições otimizadas do HPLC, os três alcaloides tropanos-alvo: hiosciamina, anisodamina e escopolamina, foram separados com sucesso em 20 minutos, demonstrando a alta eficiência do método desenv...

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Discussão

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Com o crescente interesse em metabólitos secundários de plantas, técnicas analíticas para detecção de alcaloides têm recebido atenção significativa. Embora um sistema cromatográfico fundamental para análise de alcaloides tropanos (TAs) tenha sidoestabelecido 18, avanços recentes, como a adoção da eletroforese capilar (CE), o aprimoramento do desempenho instrumental em GC–MS e HPLC–MS, e a identificação de novos compostos estruturais, incluindo toxinas semelhantes ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado pela Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan (Nº 2024MS562) e pelo Programa de Talentos Xinglin da Universidade de Chengdu da MTC (Nº MPRC2022035). Agradecemos muito o apoio do Instituto Inovador de Medicina e Farmácia Chinesa, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agilent MassHunter softwareAgilent Technologies
Agilent ZORBAX SB-C18 columnAgilent Technologies880975-902C18 reversed-phase column, 4.6 × 250 mm, 5 μm
Anisodamine hydrobromideChengdu glip Biotechnology Co., Ltd101-31-5HPLC>98%
Formic AcidSigma-Aldrich5.33002
freeze dryerEYELA, Tokyo, JapanFDU-2110
High-speed universal grinderTaisite Instrument Co., Ltd., Tianjin, China6010210100FW-100,24,000 rpm, 100 g capacity, 80 mesh
HyoscyamineChengdu glip Biotechnology Co., Ltd55449-49-5HPLC>98%
MethanolThermo Fisher Scientific022909.K2
Microporous Membrane 0.22μmMilliporeSLGV033RB
Milli-Q Direct 8 water systemMilliporeSigma, Burlington, MA, USAZRQSVP0JP
Scopolamine hydrobromideChengdu glip Biotechnology Co., Ltd114-49-8HPLC>98%

Referências

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