Geração e Análise Transcriptômica de Célula Única de Organoides de Carcinoma Hepatocelular após Tratamento Medicamentoso

Summary

Este protocolo descreve um método simplificado para gerar organoides de carcinoma hepatocelular, aplicar tratamento medicamentoso e realizar sequenciamento de RNA unicelular antes e depois do tratamento para caracterizar alterações transcricionais associadas ao tratamento.

Abstract

O carcinoma hepatocelular é uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo e é caracterizado por uma marcada heterogeneidade intratumoral, que contribui para respostas variáveis ao tratamento, recidiva tumoral e progressão da doença. Um entendimento mais profundo de como as células tumorais mudam no nível transcricional antes e após o tratamento medicamentoso é, portanto, essencial para melhorar as estratégias terapêuticas. No entanto, fluxos de trabalho experimentais práticos que conectam o tratamento medicamentoso baseado em organoides ao perfil transcriptômico de célula única a jusante continuam limitados. Neste estudo, foi desenvolvido um fluxo de trabalho padronizado para geração de organoides do carcinoma hepatocelular, aplicação de tratamentos farmacológicos definidos e realização de sequenciamento de RNA unicelular em amostras coletadas antes e após o tratamento. O protocolo inclui revival e expansão de organoides, avaliação de qualidade pré-tratamento, exposição a medicamentos, preparação de organoides para dissociação de célula única, construção de bibliotecas e análise comparativa básica de dados transcriptômicos de célula única. Precauções técnicas críticas são fornecidas para melhorar a reprodutibilidade e a qualidade da amostra. Esse fluxo de trabalho permite a caracterização lado a lado da composição celular e das alterações transcricionais associadas ao tratamento medicamentoso em organoides do carcinoma hepatocelular. O protocolo é robusto, escalável e adaptável entre diferentes sistemas organoides, fornecendo uma plataforma prática para investigar alterações de expressão gênica associadas ao tratamento em resolução de célula única.

Introduction

O carcinoma hepatocelular (CCH) é o câncer primário de fígado mais comum em adultos e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer no mundo ^1,2,3. Seu resultado clínico ruim se deve à significativa heterogeneidade intratumoral, levando à resistência ao tratamento e à^{recidiva 4}. Um estudo recente indica que a diversidade do desenvolvimento e a plasticidade do estado celular impulsionadas por programas-chave de transcrição, como o eixo FOXM1/CEBPB, contribuem para a resistência terapêutica no

Protocol

Estudos usando tecidos humanos foram revisados e aprovados pelos Comitês de Revisão Ética da Pesquisa da Universidade Médica de Guangzhou (aprovação nº GYZL-2024-KY31). Todos os procedimentos envolvendo espéramos humanos foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais para pesquisa em humanos. Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os pacientes para o uso de suas amostras clínicas em pesquisas médicas. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

Esse fluxo de trabalho inclui a recuperação e expansão de organoides criopreservados....

Results

A Figura 1 descreve a geração e caracterização dos organoides do carcinoma hepatocelular (CCS). Na Figura 1A, tecidos tumorais derivados do paciente foram usados para estabelecer culturas organoides para análise histológica e estudos de tratamento. A Figura 1B mostra imagens em campo claro dos organoides nos dias 1 e 6 após a recuperação, demonstrando sobrevivência e expansão sob condições padrão de.......

Discussion

Para garantir reprodutibilidade, eficiência e análise transcriptômica de célula única de alta qualidade, várias etapas técnicas desse fluxo de trabalho exigem controle cuidadoso. A consistência durante a reativação e expansão dos organoides HCC derivados do paciente é essencial, pois variações na densidade de semeadura, composição da matriz da membrana basal e tempo de cultura podem influenciar a morfologia dos organoides, o crescimento e as respostas de tratamento a^jus.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrina I humana	Merck	G9145
Microtubos de 1,5 mL	Merck	AXYMCT150LC
1X Buffer de Lise de Glóbulos Vermelhos	Thermo Fisher Scientific	00-4333-57
Frascos criogênicos de 2,0ml com fio interno	Nest	607001
A8301 (inibidor de TGFb)	Tocris Biociências	2939
Anticorpo policlonal AFP	Proteintech	14550-1-AP
Anticorpo anti-albumina [ALB/2144]	Abcam	ab236492
Anticorpo anti-HNF-4-alfa [EPR16885] - Grau ChIP	Abcam	ab181604
Anticorpo anti-pré-albumina [EPR3219]	Abcam	ab92469
Anticorpo anti-SOX9 [EPR14335-78]	Abcam	ab185966
Suplemento de B27 (503), sem vitamina A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Solução de Recuperação Celular, 100 mL	Corning	354253	Reagente usado para dissolver a matriz de membrana basal e recuperar organoides antes do re-placagem ou processamento a jusante
CellTiter-Glo®   Ensaio de Viabilidade de Células 3D	Promega	G9681
CHIR99021	Merck	SML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Biblioteca & Biblioteca Kit de Esferas de Gel v3.1	10x Genômica	CG000227
Filtro de Células de Corning, 40 e mu; m, Blue, S, IND, 1/50	Corning	431750
Placas de fixação múltipla de poço Costar transparente de 24 poços e fundo plano, ultra-baixo, enroladas individualmente, estéreis	Corning	3473
Cultrex Redução do Fator de Crescimento BME, Tipo 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02	Matriz extracelular usada para apoiar a cultura organoide tridimensional e a formação de cúpulas
DMSO	Merck	C6164	Solvente usado para preparar soluções para medicamentos e controle de veículos
Eagle Medium Modificado de Dulbecco/F-12 de Ham	Thermo Fisher Scientific	12634028	DMEM/F-12 Avançado
E7080 (Lenvatinib)	Selleck	S1164	Inibidor da tirosina quinase usado para tratamento de organoides e perturbação terapêutica
FBS do Valor do Soro Fetal Bovino	Gibco	A5256701
Forskolin	Tocris Biociências	1099
Suplemento GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Kit de Coloração de Hematoxilina e Eosina	Beyotime	C0105S
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Microscópio Motorizado de Fluorescência Leica DM6 B	Leica	N/A
Suplemento N2 (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetilcisteína	Merck	A0737-5MG
Nicotinamida	Merck	N0636
Tubos centrífugos de polipropileno cônico estéreis Nunc 15 mL	Thermo Fisher Scientific	339651
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Soro Tamponado com Fosfato	GENOM BIO	GNM20012	Tampão usado para lavar organoides e preparar amostras para processamento a jusante
EGF humano recombinante	Peprotech	AF-100-15
FGF10 humano recombinante	Peprotech	100-26
HGF humano recombinante	Peprotech	100-39
Noggin humano recombinante	Peprotech	120-10C
Inibidor de rho quinase Y-27632 dihidrocloreto	Merck	Y0503	Inibidor de ROCK usado para melhorar a sobrevivência dos organoides após descongelamento ou passagem
Meio condicionado R-spodin1	(Broutier et al.)	N/A	Secreção de linhas celulares
Trypan Blue Stain, filtrado por membrana a 0,4% Preparado em soro salino a 0,85%	Gibco	15250061
TrypLE Express Enzima (1x), sem fenol vermelho	Thermo Fisher Scientific	12604013	Substituto da tripsina
Meio condicionado Wnt-3a	(Broutier et al.)	N/A	Secreção de linhas celulares