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Artigo de método

Geração e Análise Transcriptômica de Célula Única de Organoides de Carcinoma Hepatocelular após Tratamento Medicamentoso

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DOI:

10.3791/70511

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26 de maio de 2026

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1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método simplificado para gerar organoides de carcinoma hepatocelular, aplicar tratamento medicamentoso e realizar sequenciamento de RNA unicelular antes e depois do tratamento para caracterizar alterações transcricionais associadas ao tratamento.

Resumo

O carcinoma hepatocelular é uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo e é caracterizado por uma marcada heterogeneidade intratumoral, que contribui para respostas variáveis ao tratamento, recidiva tumoral e progressão da doença. Um entendimento mais profundo de como as células tumorais mudam no nível transcricional antes e após o tratamento medicamentoso é, portanto, essencial para melhorar as estratégias terapêuticas. No entanto, fluxos de trabalho experimentais práticos que conectam o tratamento medicamentoso baseado em organoides ao perfil transcriptômico de célula única a jusante continuam limitados. Neste estudo, foi desenvolvido um fluxo de trabalho padronizado para geração de organoides do carcinoma hepatocelular, aplicação de tratamentos farmacológicos definidos e realização de sequenciamento de RNA unicelular em amostras coletadas antes e após o tratamento. O protocolo inclui revival e expansão de organoides, avaliação de qualidade pré-tratamento, exposição a medicamentos, preparação de organoides para dissociação de célula única, construção de bibliotecas e análise comparativa básica de dados transcriptômicos de célula única. Precauções técnicas críticas são fornecidas para melhorar a reprodutibilidade e a qualidade da amostra. Esse fluxo de trabalho permite a caracterização lado a lado da composição celular e das alterações transcricionais associadas ao tratamento medicamentoso em organoides do carcinoma hepatocelular. O protocolo é robusto, escalável e adaptável entre diferentes sistemas organoides, fornecendo uma plataforma prática para investigar alterações de expressão gênica associadas ao tratamento em resolução de célula única.

Introdução

O carcinoma hepatocelular (CCH) é o câncer primário de fígado mais comum em adultos e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer no mundo 1,2,3. Seu resultado clínico ruim se deve à significativa heterogeneidade intratumoral, levando à resistência ao tratamento e àrecidiva 4. Um estudo recente indica que a diversidade do desenvolvimento e a plasticidade do estado celular impulsionadas por programas-chave de transcrição, como o eixo FOXM1/CEBPB, contribuem para a resistência terapêutica noHCC 5. Esses achados destacam a necessidade de entender como as populações de células tumorais se adaptam e transitam entre estados sob pressão contínua do tratamento. No entanto, a maioria dos modelos pré-clínicos não captura adequadamente a natureza dinâmica e contínua dessas transições de estado associadas ao tratamento, limitando a investigação mecanicista da adaptação tumoral e da falha terapêutica.

Organoides derivados do paciente (PDOs) fornecem uma plataforma útil para esse propósito, pois preservam alterações genômicas importantes e a heterogeneidade celular do tumororiginal 6. Organoides do HCC podem ser mantidos em cultura de longo prazo enquanto retêm características-chave dotecido, tornando-os particularmente adequados para estudos de resposta ao tratamento. Além disso, estudos baseados em organoides demonstraram a viabilidade do uso de organoides do câncer de fígado para testes de medicamentos e para capturar diferenças interpacientes e intratumorais na sensibilidade terapêutica, apoiando seu valor como modelos pré-clínicos para pesquisas de respostaao tratamento 8,9. No entanto, a maioria dos estudos com fármacos baseados em organoides ainda depende principalmente de medições de viabilidade de desfechos ou foca principalmente em respostas fenotípicas em massa, fornecendo assim apenas informações limitadas sobre respostas celulares heterogêneas e mudanças transcricionais associadas ao tratamento. Paralelamente, o rápido desenvolvimento de estratégias terapêuticas baseadas em RNA para o HCC reforça ainda mais a necessidade de sistemas pré-clínicos capazes de prever e dissecar mecanicamente respostas de tratamento com precisão na resolução10 de célula única.

O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) permite a caracterização de alta resolução da composição celular e dos estados transcricionais dentro dos modelosorganoides 11. Quando aplicado a organoides coletados antes e depois do tratamento, o scRNA-seq pode revelar alterações na expressão gênica, mudanças nas populações celulares e respostas heterogêneas que não são capturadas por ensaios em massa. Essa abordagem, portanto, representa uma estratégia prática e poderosa para investigar a remodelação transcricional associada ao tratamento em organoides de HCC. No entanto, ainda falta um fluxo de trabalho prático e reprodutível que integre cultura organoide de HCC, tratamento medicamentoso e sequenciamento de RNA unicelular pré e pós-tratamento. Esse fluxo de trabalho é mais eficaz quando a integridade dos organoides é mantida durante a exposição ao medicamento e células viáveis suficientes são recuperadas para o perfil de célula única a jusante. Como em outras abordagens baseadas em organoides, limitações importantes incluem a representação incompleta dos componentes estromal, vascular e imune do microambiente tumoral, bem como o potencial viés de seleção durante a cultura in vitro prolongada.

Um fluxo de trabalho experimental integrado é descrito para gerar organoides HCC, aplicar tratamentos medicamentosos definidos e processar amostras de organoides para sequenciamento de RNA unicelular antes e após o tratamento. Esse fluxo de trabalho abrange a revivificação e expansão dos organoides, avaliação pré-tratamento da qualidade, exposição controlada a medicamentos e sequenciamento de RNA unicelular a jusante de amostras combinadas. A abordagem fornece uma estrutura prática para comparar, com resolução de célula única, mudanças associadas ao tratamento na composição celular e nos programas de expressão gênica em organoides do HCC.

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Protocolo

Estudos usando tecidos humanos foram revisados e aprovados pelos Comitês de Revisão Ética da Pesquisa da Universidade Médica de Guangzhou (aprovação nº GYZL-2024-KY31). Todos os procedimentos envolvendo espéramos humanos foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais para pesquisa em humanos. Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os pacientes para o uso de suas amostras clínicas em pesquisas médicas. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

Esse fluxo de trabalho inclui a recuperação e expansão de organoides criopreservados do carcinoma hepatocelular, com pequenas adaptações para perturbação terapêutica a jusante e sequenciamento de RNA unicelular. O objetivo é gerar culturas organoides de qualidade e consistência suficientes para os experimentos subsequentes de tratamentomedicamentoso.

1. Estabelecimento e expansão de organoides derivados de pacientes com HCC

  1. Descongelamento e recuperação de organoides criopreservados
    1. Preparação antes do descongelamento
      1. Pré-aqueça um banho-maria a 37 °C. Pré-equilibre uma placa de 24 poços em uma incubadora de 37 °C por pelo menos 1 hora antes do revestimento.
      2. Prepare um meio completo de cultura organoide com antecedência e mantenha o extrato da membrana basal (BME) no gelo até o uso. A composição do meio completo de cultura organoide é fornecida na Tabela Suplementar 1.
    2. Descongelamento de organoides
      1. Retire os crioviais contendo organoides HCC congelados do armazenamento de nitrogênio líquido e coloque-os imediatamente em um banho-maria a 37 °C.
      2. Agite suavemente o frasco e pare de descongelar quando restar apenas um pequeno cristal de gelo.
    3. Remoção do crioprotetor
      1. Pipete suavemente a suspensão descongelada uma vez para resuspender o conteúdo.
      2. Transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL contendo 3–5 mL de meio completo de cultivo organoide.
      3. Centrifuge a 300 × g por 5 minutos a 4 °C. Aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante sem perturbar a pelota.
  2. Embedding e Replacagem de Organoides
    1. Preparação da mistura de recuperação
      1. Resuspenda o pellet organoide em meio completo de cultura organoide. A composição do meio completo de cultura organoide é fornecida na Tabela Suplementar 1.
      2. Misture suavemente com um volume igual de BME gelado para gerar a mistura de placas.
        NOTA: Mantenha a mistura no gelo para evitar polimerização prematura.
    2. Revestimento das cúpulas organoides
      1. Dispense 50 μL da mistura organoide-matriz em cada poço de uma placa pré-aquecida de 24 poços.
      2. Incube a 37 °C por 30 minutos para permitir a solidificação da matriz.
      3. Adicione 500 μL de meio completo de cultura organoide, suplementado com 20 μM Y-27632, a cada poço ao longo da parede do poço.
        NOTA: Limite o uso do Y-27632 aos primeiros 2–3 dias após o descongelamento ou passagem. Certifique-se de que cada cúpula permaneça compacta e fixada ao fundo do poço, sem se espalhar para fora.
  3. Cultura e expansão dos organoides
    1. Condições da cultura de recuperação
      1. Manter os organoides em 37 °C com 5% deCO2.
      2. Use meio contendo 20 μM Y-27632 durante os primeiros 2–3 dias após o descongelamento.
    2. Substituição média
      1. Substitua o substrato de cultura a cada 3–4 dias usando aspiração suave.
      2. Adicione meio fresco ao longo da parede de cada poço para evitar perturbar as cúpulas da matriz.
      3. Mantenha o mesmo cronograma de substituição de meio em todos os poços dentro do mesmo experimento.
    3. Monitoramento do crescimento
      1. Monitore a recuperação e expansão dos organoides usando um microscópio de campo claro com configurações de imagem consistentes.
      2. Grave imagens representativas em pontos de tempo definidos durante a recuperação e expansão.
      3. Confirme a recuperação bem-sucedida quando a maioria das estruturas permanece intacta, os organoides apresentam morfologia arredondada a oval com bordas lisas, o aumento progressivo é observado ao longo do tempo e há detritos mínimos ou estruturas colapsadas.
      4. Exclua poços contendo menos de 10 organoides intactos da análise quantitativa posterior.
    4. Critérios de aprovação e expansão
      1. Organoides de passagem após expansão estável são observados.
      2. Confirme a expansão estável por aumentos reprodutíveis no tamanho do organoide ou na área total com morfologia preservada.
      3. Use critérios consistentes de intervalo de imagem, ampliação e inclusão entre os experimentos.
      4. Gerar curvas de crescimento representativas baseadas na área do organoide ou nas contagens para confirmar a estabilidade.
    5. Critérios para experimentos posteriores
      1. Use linhas organoides que exibam crescimento tridimensional estável, não apresentem contaminação ou colapso extenso, e proporcionem rendimento suficiente para condições experimentais paralelas.
      2. Mantenha as culturas por pelo menos 7 a 10 dias após o descongelamento ou até a conclusão da recuperação e um ciclo de expansão.
      3. Avance apenas linhas organoides que mostrem morfologia consistente entre poços replicados.

2. Preparação de organoides para perturbação terapêutica

  1. Avaliação da qualidade pré-tratamento
    1. Avaliação baseada em morfologia
      1. Confirme que os organoides são arredondados a ovais em morfologia.
      2. Confirme que os organoides apresentam bordas suaves e bem definidas.
      3. Confirme a presença mínima de detritos celulares dentro da cúpula.
      4. Exclua culturas com fragmentação extensa, lúmens escurecidos, colapso generalizado ou contaminação óbvia.
    2. Avaliação do estado de expansão
      1. Use apenas culturas organoides que tenham concluído a recuperação e entrado em expansão estável.
      2. Confirme o aumento progressivo ao longo do tempo.
      3. Confirme a morfologia consistente entre poços replicados.
  2. Replacagem de organoides para tratamento medicamentoso
    1. Recuperação de organoides a partir da matriz
      1. Dissolva cúpulas organoides no gelo usando 1 mL de solução de recuperação de células geladas por poço por 15–20 minutos.
      2. Pipete suavemente a cada 5 minutos durante a incubação.
      3. Centrifuge a suspensão recuperada a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
      4. Resuspenda o pellet em meio completo de cultivo organoide.
    2. Padronização antes do rebanhamento
      1. Padronize a carga inicial de organoides entre poços antes do tratamento medicamentoso.
      2. Determinar o número de células viáveis após dissociação parcial quando possível.
      3. Normalize as amostras para o mesmo número de células de entrada por poço.
      4. Placam aproximadamente 1.000–5.000 células viáveis por poço em um formato de 24 poços.
      5. Se a contagem direta das células não for realizada, normalize garantindo um número comparável de organoides morfologicamente intactos por poço e uma distribuição de tamanho semelhante entre os grupos.
      6. Registre o número inicial de organoides e a morfologia de base para cada um bem antes do tratamento.
      7. Use critérios de inclusão idênticos e estratégia de chapa em todos os poços dentro do mesmo experimento.
    3. Replacagem para tratamento de drogas
      1. Misture organoides recuperados com matriz de membrana basal gelada em concentração final de 30% a 50%.
      2. Dispense cúpulas de 50 μL em cada poço de uma placa de 24 poços.
      3. Incube a 37 °C por 30 minutos para permitir a polimerização.
      4. Adicione 500 μL de cultura organoide completa por poço ao longo da parede do poço.
        NOTA: Certifique-se de que cada cúpula permaneça compacta e fixada ao fundo do poço, sem se espalhar para fora. Use o mesmo volume de cúpula e concentração de matriz em todos os poços dentro do mesmo experimento.
  3. Recuperação antes do tratamento medicamentoso
    1. Recuperação após o re-revestimento
      1. Permitir que os organoides se recuperem durante a noite sob condições padrão de cultura.
      2. Inicie o tratamento somente após a morfologia intacta ser restabeleceda dentro das cúpulas replacadas.
    2. Critérios de entrada para tratamento de drogas
      1. Inicie o tratamento medicamentoso apenas quando os organoides permanecem intactos após a replacagem, não houver colapso generalizado ou detritos excessivos, e a carga dos organoides for comparável entre os poços.
      2. Registre imagens de campo claro de base para todos os grupos experimentais antes do tratamento.
      3. Mantenha a mesma carga inicial de organoides, tempo de recuperação após a reposição e início do tratamento em todos os poços controle e tratados.
  4. Considerações de segurança
    1. Realizar todos os procedimentos envolvendo organoides de origem humana utilizando equipamentos de proteção individual adequados e práticas de biossegurança.
    2. Manuseie cuidadosamente os reagentes enzimáticos de dissociação para evitar exposição à pele ou aos olhos.
    3. Descartar resíduos biológicos líquidos e sólidos conforme as regulamentações institucionais de biossegurança.

3. Tratamento medicamentoso dos organoides do HCC

  1. Preparação e tratamento de medicamentos
    1. Preparação de medicamentos
      1. Prepare a solução de estoque de lenvatibe em DMSO conforme as instruções do fabricante.
      2. Dilua a solução de estoque em meio de cultura pré-aquecido imediatamente antes do uso, até a concentração de trabalho pré-definida.
      3. Mantenha a mesma concentração final de DMSO em todos os poços (≤ 0,1%).
      4. Prepare volume suficiente para garantir o mesmo volume final de tratamento em cada poço.
    2. Tratamento com drogas
      1. Adicione um meio contendo lenvatinibe (20 μM) ao longo da parede de cada poço para evitar perturbar as cúpulas da matriz.
      2. Inclua um controle de veículo com a mesma concentração final de DMSO.
      3. Incubar organoides sob condições padrão de cultura durante o período de tratamento pré-definido.
      4. Substitua o meio contendo medicamento a cada 48–72 horas para durações de tratamento superiores a 72 horas.
      5. Use o mesmo cronograma de substituição de meio em todos os poços dentro do experimento.
      6. Registre imagens de campo claro de base antes do tratamento.
      7. Adquira imagens em intervalos fixos durante o tratamento usando configurações idênticas de microscópio, ampliação e posições de campo.
  2. Avaliação da resposta ao tratamento
    1. Avaliação baseada em morfologia
      1. Avalie a resposta ao tratamento usando as seguintes leituras baseadas em imagens: curva de crescimento da área organoide, diâmetro médio dos organoides e contagem de organoides sobreviventes.
      2. Use configurações de exposição, ampliação e limiares de análise idênticos para todas as imagens.
      3. Meça a curva de crescimento da área organoide calculando a área total de organoides por poço ou campo em cada ponto de tempo e normalizando para a linha de base.
      4. Meça o diâmetro médio dos organoides determinando o diâmetro de organoides individuais intactos e calculando o valor médio por poço.
      5. Determinar a contagem de organoides sobreviventes contando organoides intactos morfologicamente identificáveis e excluindo detritos e fragmentos colapsados.
    2. Medição opcional de viabilidade
      1. Realize um ensaio tridimensional de viabilidade de luminescência no ponto final do tratamento se for necessária uma avaliação adicional de viabilidade em massa.
      2. Siga as instruções do fabricante para a execução do ensaio.
  3. Análise de dados
    1. Plote curvas de crescimento da área organoide ao longo do tempo.
    2. Compare o diâmetro médio dos organoides entre grupos tratados por veículo e com lenvatinibe.
    3. Compare as contagens de organoides sobreviventes entre os grupos de tratamento.
    4. Aplicar cronogramas idênticos de aquisição de imagens, critérios de inclusão de organoides e parâmetros de análise em todos os grupos para garantir a reprodutibilidade.

4. Preparação de organoides para sequenciamento de RNA unicelular

  1. Seleção e recuperação de organoides
    1. Avaliação pré-dissociação
      1. Poços organoides selecionados que exibem morfologia tridimensional intacta sem colapso generalizado, contenham material suficiente para captura de célula única a jusante e não mostrem contaminação óbvia.
      2. Colete organoides em pontos experimentais correspondentes entre amostras controle e tratadas.
      3. Mantenha densidade de placa, cronograma de tratamento e condições de substituição de médio idênticas entre as amostras.
      4. Registre imagens em campo claro de cada uma selecionada muito antes da dissociação, usando configurações idênticas de microscópio, ampliação e critérios de seleção de campo.
    2. Remoção da matriz
      1. Aspire o meio de cultivo completamente de cada poço.
      2. Lave cada poço duas vezes com PBS gelado para remover o meio residual e os detritos.
      3. Adicione 1 mL de solução de recuperação de células geladas em cada poço.
      4. Incube no gelo por 20–30 minutos.
      5. Pipete suavemente a cada 5–7 minutos durante a incubação para facilitar a dissolução da matriz.
      6. Transfira material dissolvido para tubos pré-refrigerados usando uma ponta de tubo largo ou de pipeta cortada para minimizar o estresse de cisalhamento.
      7. Prossiga para a dissociação enzimática somente depois que a matriz estiver em grande parte dissolvida e restar um mínimo de resíduos visíveis de gel.
  2. Dissociação enzimática e preparação da suspensão de célula única
    1. Dissociação enzimática
      1. Centrifuge a suspensão organoide recuperada a 300 × g por 5 minutos a 4 °C.
      2. Remova o sobrenadante com cuidado, sem mexer na bola.
      3. Ressuspenda o pellet em 1 mL de enzima de dissociação celular recombinante.
      4. Incube a 37 °C por 5–10 minutos.
      5. Pipete suavemente 8–10 vezes a cada 2–3 minutos usando uma ponta P1000 de amplo calibre para promover a dissociação.
      6. Interrompa a digestão quando a maioria dos fragmentos organoides se dispersou em células individuais e restam apenas pequenos aglomerados residuais.
      7. Evite digestão prolongada para evitar a redução da viabilidade celular, artefatos transcricionais associados ao estresse e aumento da contaminação por RNA ambiente.
    2. Têmpera e filtração
      1. Adicione 4 mL de PBS gelado contendo 2% de soro fetal bovino para interromper a digestão.
      2. Filtre a suspensão por um filtro de célula de 40 μm.
      3. Lave uma vez com PBS para remover enzimas residuais, agregados e detritos.
      4. Realize a lise dos glóbulos vermelhos se houver contaminação por eritrócitos, seguindo as instruções do fabricante.
    3. Preparação de células e controle de qualidade
      1. Conte células usando exclusão de azul de tripano.
      2. Determine a viabilidade das células antes da preparação da biblioteca.
      3. Use apenas amostras com viabilidade ≥ 85%.
      4. Ajuste a concentração final da célula para 700–1.200 células/μL.
      5. Exclua amostras com detritos excessivos, células mortas abundantes, grandes agregados visíveis ou dissociação incompleta.
      6. Repita a filtragem antes da carga se houver agregados presentes.
      7. Controle de processo e amostras tratadas sob condições idênticas, incluindo a enzima de dissociação, tempo de digestão, frequência de pipeteamento, método de filtragem, concentração celular e estratégia de carga.
  3. Preparação e sequenciamento de bibliotecas de célula única
    1. Captura de célula única e preparação de bibliotecas
      1. Carregue a suspensão de célula única preparada em uma plataforma de captura de célula única baseada em gotículas, conforme as instruções do fabricante.
      2. Realize transcrição reversa, amplificação de cDNA e construção de bibliotecas usando o fluxo de trabalho 3′ de célula única correspondente.
    2. Parâmetros de sequenciamento
      1. Bibliotecas de sequências com profundidade de pelo menos 50.000 leituras por célula.
      2. Células de carga para alcançar uma recuperação de aproximadamente 6.000–10.000 células por biblioteca.
      3. Registre a química do sequenciamento, a estrutura de leitura e as configurações do instrumento.
  4. Critérios de qualidade para análise a jusante
    1. Certifique-se de que a preparação final tenha alta viabilidade celular, detritos mínimos e baixa carga agregada.
    2. Confirmar a adequação para análise transcriptômica de célula única a jusante da heterogeneidade celular e das transições entre estados celulares.

5. Processamento básico e controle de qualidade de dados de sequenciamento de RNA de célula única

  1. Processamento primário
    1. Geração de matriz de contagem
      1. Processe dados brutos de sequenciamento usando o pipeline recomendado para a plataforma selecionada.
      2. Gerar uma matriz de contagem gene por célula.
      3. Gravar a versão do software, construir o genoma de referência e liberar a anotação da transcrição.
    2. Avaliação inicial de qualidade em nível de biblioteca
      1. Resuma métricas de sequenciamento para cada biblioteca, incluindo leituras totais, número estimado de células recuperadas, genes medianos por célula, UMIs medianas por célula e saturação do sequenciamento (se aplicável).
      2. Use configurações idênticas de genoma de referência e anotação em todas as amostras.
  2. Controle de qualidade em nível de célula
    1. Filtragem de células de baixa qualidade
      1. Avalie para cada célula o número de genes detectados, a contagem total de UMI, a proporção de transcritos mitocondriais e a evidência de doublets ou multiplets.
      2. Exclua células com contagens genéticas extremamente baixas, contagens extremamente baixas de UMI ou frações anormalmente altas de transcritos mitocondriais.
      3. Defina limiares de filtragem com base na distribuição do conjunto de dados.
      4. Aplique limiares idênticos em todos os grupos de tratamento correspondentes.
    2. Remoção de prováveis doublets
      1. Identifique duplas prováveis usando um método computacional apropriado.
      2. Remova doublets usando um fluxo de detecção compatível com a plataforma.
      3. Aplique a mesma estratégia de detecção de doublet em todas as amostras.
  3. Normalização, agrupamento e anotação
    1. Normalização de dados
      1. Normalize a matriz de contagem filtrada usando um fluxo de trabalho padrão de RNA-seq de célula única.
      2. Aplicar procedimentos de normalização idênticos em todas as amostras.
    2. Redução de dimensionalidade e agrupamento
      1. Realize redução de dimensionalidade.
      2. Realizar agrupamento não supervisionado para identificar as principais populações transcricionais.
      3. Visualize estados da célula usando um método de embedding de baixa dimensão, como o UMAP.
    3. Identificação de genes marcadores
      1. Identifique genes marcadores usando análise de expressão diferencial entre clusters.
      2. Atribuir interpretação biológica aos principais estados celulares epiteliais com base na expressão dos marcadores.
  4. Análise comparativa das condições de tratamento
    1. Integração de metadados
      1. Anote cada célula com condição de tratamento, linha organoide derivada do paciente e lote de processamento.
      2. Mantenha uma estrutura consistente de metadados em todas as amostras.
    2. Análise das mudanças associadas ao tratamento
      1. Compare amostras controle e tratadas.
      2. Identificar a remodelação transcricional associada ao tratamento.
      3. Identificar mudanças na composição do estado da célula.
      4. Identificar populações celulares candidatas associadas à adaptação terapêutica.
      5. Interprete os resultados juntamente com leituras baseadas em morfologia e viabilidade.
  5. Saída da análise de dados
    1. Gerar uma matriz de contagem gene a célula controlada pela qualidade.
    2. Gerar visualizações de baixa dimensão de populações transcricionalmente distintas.
    3. Identifique genes marcadores para grandes aglomerados.
    4. Mantenha consistência entre todas as amostras no genoma de referência, fluxo de trabalho de pré-processamento, critérios de filtragem, estratégia de agrupamento e critérios de anotação.
    5. Documente quaisquer desvios específicos de amostra em relação ao fluxo de trabalho padrão.

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Resultados

A Figura 1 descreve a geração e caracterização dos organoides do carcinoma hepatocelular (CCS). Na Figura 1A, tecidos tumorais derivados do paciente foram usados para estabelecer culturas organoides para análise histológica e estudos de tratamento. A Figura 1B mostra imagens em campo claro dos organoides nos dias 1 e 6 após a recuperação, demonstrando sobrevivência e expansão sob condições padrão de...

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Discussão

Para garantir reprodutibilidade, eficiência e análise transcriptômica de célula única de alta qualidade, várias etapas técnicas desse fluxo de trabalho exigem controle cuidadoso. A consistência durante a reativação e expansão dos organoides HCC derivados do paciente é essencial, pois variações na densidade de semeadura, composição da matriz da membrana basal e tempo de cultura podem influenciar a morfologia dos organoides, o crescimento e as respostas de tratamento ajus...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

Essa pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), pela Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (2023A1515011416) e pela Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangzhou (2024A04J6575). Alguns elementos esquemáticos foram criados usando o Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) e foram adaptados pelos autores. Ilustrações esquemáticas foram criadas usando Figdraw (https://www.figdraw.com) e adaptadas pelos autores.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
[Leu15]-gastrina I humanaMerckG9145
Microtubos de 1,5 mLMerckAXYMCT150LC
1X Buffer de Lise de Glóbulos VermelhosThermo Fisher Scientific00-4333-57
Frascos criogênicos de 2,0ml com fio internoNest607001
A8301 (inibidor de TGFb)Tocris Biociências2939
Anticorpo policlonal AFPProteintech14550-1-AP
Anticorpo anti-albumina [ALB/2144]Abcamab236492
Anticorpo anti-HNF-4-alfa [EPR16885] - Grau ChIPAbcamab181604
Anticorpo anti-pré-albumina [EPR3219]Abcamab92469
Anticorpo anti-SOX9 [EPR14335-78]Abcamab185966
Suplemento de B27 (503), sem vitamina AThermo Fisher Scientific12587010
Solução de Recuperação Celular, 100 mLCorning354253Reagente usado para dissolver a matriz de membrana basal e recuperar organoides antes do re-placagem ou processamento a jusante
CellTiter-Glo®   Ensaio de Viabilidade de Células 3DPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Biblioteca & Biblioteca Kit de Esferas de Gel v3.110x GenômicaCG000227
Filtro de Células de Corning, 40 e mu; m, Blue, S, IND, 1/50Corning431750
Placas de fixação múltipla de poço Costar transparente de 24 poços e fundo plano, ultra-baixo, enroladas individualmente, estéreisCorning3473
Cultrex Redução do Fator de Crescimento BME, Tipo 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Matriz extracelular usada para apoiar a cultura organoide tridimensional e a formação de cúpulas
DMSOMerckC6164Solvente usado para preparar soluções para medicamentos e controle de veículos
Eagle Medium Modificado de Dulbecco/F-12 de HamThermo Fisher Scientific12634028DMEM/F-12 Avançado
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Inibidor da tirosina quinase usado para tratamento de organoides e perturbação terapêutica
FBS do Valor do Soro Fetal BovinoGibcoA5256701
ForskolinTocris Biociências1099
Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
Kit de Coloração de Hematoxilina e EosinaBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Microscópio Motorizado de Fluorescência Leica DM6 BLeicaN/A
Suplemento N2 (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acetilcisteínaMerckA0737-5MG
NicotinamidaMerckN0636
Tubos centrífugos de polipropileno cônico estéreis Nunc 15 mLThermo Fisher Scientific339651
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Soro Tamponado com FosfatoGENOM BIOGNM20012Tampão usado para lavar organoides e preparar amostras para processamento a jusante
EGF humano recombinantePeprotechAF-100-15
FGF10 humano recombinantePeprotech100-26
HGF humano recombinantePeprotech100-39
Noggin humano recombinantePeprotech120-10C
Inibidor de rho quinase Y-27632 dihidrocloretoMerckY0503Inibidor de ROCK usado para melhorar a sobrevivência dos organoides após descongelamento ou passagem
Meio condicionado R-spodin1(Broutier et al.)N/ASecreção de linhas celulares
Trypan Blue Stain, filtrado por membrana a 0,4% Preparado em soro salino a 0,85%Gibco15250061
TrypLE Express Enzima (1x), sem fenol vermelhoThermo Fisher Scientific12604013Substituto da tripsina
Meio condicionado Wnt-3a(Broutier et al.)N/ASecreção de linhas celulares

Referências

  1. Villanueva, A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 380 (15), 1450-1462 (2019).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Safri, F., et al. Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications. Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).
  5. Zhang, X. F., et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).
  6. Thorel, L., et al. Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology. Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).
  7. Liu, Y., et al. A decade of liver organoids: advances in disease modeling. Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).
  8. Li, L., et al. Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity. JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).
  9. Yang, H., et al. Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).
  10. Xing, L., et al. RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives. Hepatoma Res. 10, 24 (2024).
  11. Aissa, A. F., et al. Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer. Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).
  12. Zhang, C. Y., et al. Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery. J Vis Exp. (198), e65785 (2023).
  13. Wang, Q., et al. Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments. Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).
  14. Yang, C., et al. Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research. Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).
  15. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  16. Yip, S., et al. Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids. Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).
  17. Zhou, C., et al. Standardization of organoid culture in cancer research. Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).

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