Extração de DNA em Coluna de Média Capacidade Usando Racks de 24 Poços

Resumo

Este protocolo descreve um método custo-efetivo para acelerar a extração de DNA plasmídico. Ao utilizar racks personalizados impressos em 3D compatíveis com rotores padrão de placas de balde oscilante, os pesquisadores podem processar até 48 colunas de rotação com tampas ou até 116 colunas de spin sem tampas simultaneamente, reduzindo significativamente o tempo de manuseio em comparação com métodos manuais de microcentrífuga.

Resumo

A extração de colunas spin por membrana de sílica é o padrão para purificação de DNA de alta qualidade, mas é trabalhosa e difícil de escalar manualmente além de pequenos lotes. Robôs automatizados de manuseio de líquidos existentes ainda são frequentemente caros demais para laboratórios pequenos e médios. Este artigo apresenta uma abordagem simplificada e semi-automatizada usando racks projetados sob medida e impressos em 3D, que se encaixam em rotores padrão de placas de centrifugação.

O sistema sugerido permite o processamento paralelo de até 116 colunas comerciais de spin padrão. O design de rack acomoda uma configuração "aninhada", permitindo clarificação simultânea de lisado (via colunas de filtração) e ligação ao DNA (via colunas de sílice) em uma única etapa de centrifugação. Além disso, o projeto incorpora um reservatório compartilhado de resíduos, eliminando a necessidade de descartar o fluxo de tubos individuais durante as etapas de lavagem.

Esse método alcança rendimento e pureza de DNA comparáveis aos protocolos manuais padrão, mas reduz o tempo total de processamento em aproximadamente 50–70% para lotes de amostras maiores que 24 (60–90 min em vez de 120–180 min). O tempo total necessário para etapas incluindo filtração do lisado, lavagens e descarte de resíduos é reduzido em 5 a 10 minutos, independentemente do número de amostras processadas. Essa abordagem de hardware de código aberto faz a ponte entre minipreps manuais e automação cara.

Introdução

O isolamento de ácidos nucleicos usando matrizes de sílica foi elucidado pela primeira vez em 1979 por Vogelstein e Gillespie, que estabeleceram o princípio fundamental de adsorver fragmentos de DNA em pó de vidro na presença de altas concentrações de sais caotrópicos, especificamente iodeto^{de sódio 1}. Essa descoberta ofereceu uma alternativa mais segura e eficiente aos métodos tóxicos de extração de fenol-clorofórmio e aos laboriosos métodos de ultracentrifugação por gradiente de cloreto de césio que dominaram a época. Subsequentemente, Boom e seus coautores otimizaram significativamente essa metodologia ao introduzir tiocianato de guanidinium (GuSCN) como o principal agente^{caotrópico 2}. Essa inovação foi fundamental, pois o GuSCN atua simultaneamente como um potente desnaturalizante proteico para lisar células e como um forte inibidor de RNases e DNases, preservando assim a integridade dos ácidos nucleicos durante as fases iniciais de extração.

Desde seu início, essa tecnologia de extração em fase sólida — amplamente chamada de "método Boom" — passou por extensos aprimoramentos. Ele foi adaptado para isolar ácidos nucleicos de matrizes biológicas cada vez mais complexas, variando desde o plasmídeo^{bacteriano 3} e DNA genômico⁴ até DNA mitocondrial^{eucariótico 5} e DNA genômico de alto peso molecular. Além disso, a tecnologia foi ampliada para aplicações clínicas e forenses, incluindo o isolamento de DNA circulante livre de células do plasma⁶, a extração de DNA vegetal recalcitrante e RNA rico em^{polifenóis 7}, e a purificação de ácidos nucleicos^{virais 8}. Muitos kits comerciais que utilizam colunas de rotação também estão disponíveis.

O mecanismo fisicoquímico subjacente a esse processo depende da ruptura da estrutura da água por íons caotrópicos. Na presença de alta força iônica e baixo pH, as cascas de hidratação que cercam tanto a espinha dorsal de fosfato de ácido nucleico quanto a superfície de sílica são removidas (desidratação). Isso facilita a formação de pontes cátiônicas — tipicamente mediadas por cátions Na⁺ ou caotrópicos — entre os grupos silanol carregados negativamente na superfície da sílica e os grupos fosfato do ácido nucleico. A seletividade em relação ao tipo de ácido nucleico (DNA vs. RNA) e ao comprimento dos fragmentos é alcançada por meio da modulação precisa da química do tampão. Por exemplo, concentrações específicas de sal e níveis de pH podem favorecer a ligação de longas fitas genômicas em relação a oligonucleotídeos curtos, ou diferenciar entre RNA e DNA. Além disso, iterações modernas dessa tecnologia frequentemente empregam superfícies de sílica modificadas para aprimorar as isotermas de adsorção diferencial de espécies específicas de ácidos nucleicos.

O fluxo de trabalho canônico para a purificação de ácidos nucleicos à base de sílica ocorre por quatro fases distintas: (1) Lise, onde o material biológico de partida é homogeneizado e as estruturas celulares são desintegradas, frequentemente usando condições alcalinas ou detergentes (SDS/Triton); (2) Esclarecimento, onde detritos celulares, proteínas precipitadas e polissacarídeos são removidos para evitar o entupimento da coluna; (3) Ligação, onde o sobrenadante é ajustado com sais caotrópicos e etanol para promover a adsorção à membrana de sílica; e (4) Lavagem, onde os ácidos nucleicos ligados à membrana são enxaguados com tampões à base de álcool para remover sais residuais e inibidores antes da elusão em um tampão de baixa força iônica.

Embora a química desse processo seja robusta, o manuseio mecânico das colunas de spin individuais continua sendo um gargalo significativo para fluxos de trabalho de média taxa (24–100 amostras), criando uma lacuna entre o processamento manual e sistemas automatizados de manuseio de líquidos caros. Abordagens existentes para simplificar a extração manual de ácidos nucleicos baseadas em colunas incluem coletores de vácuo e estações de trabalho robóticas para purificação^automatizada 9,10,11,12.

Os coletores a vácuo estão tipicamente disponíveis em configuração de acesso aleatório equipados com adaptadores de plugue Luer de 20 a 24 para colunas centrífugas, ou em um projeto destinado ao uso com placas de 96 poços. Coletores de vácuo configurados para 20–24 amostras aceleram a etapa de lavagem da coluna durante a purificação do DNA em comparação com a centrifugação, pois eliminam a necessidade de remover colunas do rotor. Embora esse método seja conveniente, a contaminação cruzada pode ocorrer porque a ponta de drenagem da coluna entra em contato com a abertura Luer do coletor de vácuo. Se o DNA de uma coluna entrar na abertura de Luer, pode ser transferido para outra coluna de amostra durante o uso subsequente da variedade. Para evitar contaminação, os fabricantes recomendam acessórios^{adicionais 10,13}; no entanto, esses fatores complicam a montagem do sistema de extração e frequentemente são omitidos.

Os coletores a vácuo projetados para o formato de 96 poços apresentam uma construção diferente e são destinados não a colunas de microcentrífugas, mas sim a placas compatíveis de extração de DNA de 96 poços, nas quais os poços contêm uma membrana de sílica. Neste caso, a extração de DNA é realizada usando kits de isolamento de DNA pré-embalados no formato^{de 96 poços 14}. Esses kits oferecem alta produtividade, mas têm aplicabilidade limitada, já que processar menos de 96 amostras é frequentemente impraticável.

Estações de trabalho robóticas automatizadas para extração de ácidos nucleicos são, sem dúvida, o método mais conveniente para purificação de DNA, pois exigem participação mínima do operador, economizando tempo dos pesquisadores e minimizando fatores estocásticos como contaminação. Infelizmente, a maioria das estações de extração não possui universalidade e opera exclusivamente com kits dedicados. Essas estações de trabalho são usadas principalmente em laboratórios de diagnóstico, mas não são econômicas para a maioria dos laboratórios acadêmicos de pequeno a médio porte.

Assim, há uma lacuna na prática laboratorial para métodos de extração de DNA de média capacidade capazes de processar entre 12 e 96 amostras em menos de 1 hora. Apresentamos um rack de 24 poços que permite o isolamento manual de até 48 amostras usando colunas de spin com limite e até 116 amostras usando colunas de spin sem limite. Uma centrífuga com rotor de placa de balde oscilante e uma microcentrífuga de ângulo fixo são usadas como equipamento adicional. O procedimento para purificação do DNA plasmídico é apresentado como exemplo de uso de racks de 24 poços, já que o isolamento de DNA plasmídico inclui uma etapa de esclarecimento para remover detritos de células lisadas, o que dificulta a automatização do processo. No entanto, esses racks podem ser usados praticamente em qualquer método de extração de ácidos nucleicos em coluna.

Protocolo

1. Preparação de equipamentos impressos em 3D

1. Imprima o rack usando uma impressora 3D de filamento fundido com um bico de 0,4 mm. Use filamento genérico de PLA, PETG ou ABS com 100% de preenchimento. Defina a altura da camada para 0,1 mm e ative o suavizamento da superfície. Ajuste as configurações de impressão para garantir estanqueidade e estabilidade mecânica.
   NOTA: Arquivos STL para componentes de rack são fornecidos no Arquivo Suplementar 1. Siga os parâmetros de impressão especificados para o Reservatório Base. Teste o reservatório antes do uso, enchendo-o com etanol a 70% e centrifugando por períodos crescentes (1, 2, 5, 10 e 30 min) para confirmar a ausência de vazamento ou dano estrutural.
2. Cole os componentes do Reservatório Base juntos para formar uma unidade selada.

2. Cultura bacteriana e lise

1. Inocular os transformantes de E. coli em 3–5 mL de meio LB contendo antibióticos apropriados. Incube durante a noite (12–16 h) a 37 °C com agitação.
2. Colhe as células por centrifugação a 2.000 × g por 10 minutos. Descarte o supernadante.
   NOTA: Pellets celulares podem ser armazenados a −20 °C antes do processamento.
3. Adicione 250 μL de buffer de resuspensão (Buffer P1 com RNase A) ao pellet. Resuspenda completamente por vórtice ou pipeteamento.
4. Adicione 250 μL de buffer de lise (Buffer P2). Misture invertendo suavemente o tubo 4–6 vezes.
   NOTA: Evite misturas vigorosas para evitar o cisalhamento do DNA genômico.
5. Adicione 350 μL de buffer de neutralização (Buffer N3). Misture imediatamente bem por inversão.
   NOTA: Deve se formar um precipitado branco, indicando neutralização bem-sucedida.

3. Montagem da unidade de filtragem

1. Coloque colunas de ligação de DNA na camada de suporte da coluna do rack.
2. Posicione as tampas das colunas em ranhuras designadas para fixá-las durante a centrifugação.
3. Coloque as colunas de clarificação/filtro na camada da coluna de filtro diretamente acima das colunas de ligação.
   NOTA: Se não houver colunas de filtro disponíveis, centrifuge o lisado em microtubos e transfira o sobrenadante para as colunas de ligação.

4. Eliminação do lisado e ligação ao DNA

1. Transfira o lisado neutralizado do Passo 2.5 para as colunas de filtração.
2. Coloque o suporte montado em um rotor de placa de balde oscilante.
   ATENÇÃO: Garanta o equilíbrio adequado usando um suporte de contrapeso de massa igual e configuração idêntica.
3. Centrifuge a 2.000 × g por 1 minuto em temperatura ambiente.
4. Remova o suporte da centrífuga.
5. Remova e descarte a camada da coluna do filtro.

5. Lavar

1. Descarte o fluxo do reservatório para um recipiente de resíduos. Remonte o suporte com colunas de encadernação.
2. Adicione 500–700 μL de buffer de lavagem a cada coluna de ligação usando uma pipeta multicanal.
3. Centrifuge a 2.000 × g por 1 minuto.
4. Descarte o fluxo do reservatório.
5. Repita a lavagem adicionando buffer de lavagem a cada coluna e centrifugando a 2.000 × g por 1 minuto.
   NOTA: Colunas podem ser armazenadas em temperatura ambiente ou a 4 °C após a lavagem.

6. Secagem e elução

1. Remova as colunas de ligação do suporte e transfira-as para tubos coletores de 2 mL.
2. Centrifuge a >10.000 × g por 1 minuto para secar a membrana.
3. Transfira colunas para tubos limpos de 1,5 mL.
4. Adicione 50 μL de tampão de elução ou água diretamente à membrana. Incube por 1 minuto em temperatura ambiente.
5. Centrifuge a >10.000 × g por 1 minuto para eluir DNA.

7. Opcional: Co-precipitação com dióxido de titânio

1. Misture o tampão de lise com pó de dióxido de titânio na proporção volume-massa de 2:1.
2. Adicione 250 μL da suspensão de dióxido de titânio ao lisado. Mistura por inversão.
3. Adicione 350 μL de tampão de neutralização e misture bem.
4. Centrifuge a 2.000 × g por 1 minuto.
5. Colete o sobrenadante sem perturbar o precipitado.
6. Transfira o sobrenadante para a coluna de ligação.

Resultados

Variações do suporte
Desenvolvemos quatro versões de racks adequadas para uma ampla variedade de modelos de centrífugas, permitindo o uso de recursos disponíveis em diferentes ambientes laboratoriais e acomodando as preferências dos usuários. Todos os racks apresentam um formato de 24 poços, mas, dependendo da versão, incluem posições adicionais para as colunas. Dimensões detalhadas e compatibilidade são fornecidas no Arquivo Suplementar 2. Uma imagem de alta resolução do rack montado é fornecida na Figura Suplementar S1.

A versão básica em rack (Figura 1) é a configuração mais produtiva. Ele é composto por quatro partes e tem dimensões de 88 × 130 × 77 mm. Ele permite o uso simultâneo de até 48 colunas com maiúsculas ou até 116 colunas sem maiúsculas. Os componentes do rack são projetados para facilitar o uso e minimizar efeitos indesejados durante a centrifugação. Colunas de spin são colocadas na camada da coluna, que possui sulcos para inserir tampas; Essas mesmas ranhuras também podem acomodar colunas sem tampas. A camada de colunas fica sobre o reservatório. A abertura de drenagem das colunas está posicionada acima do recorte do reservatório, o que ajuda a reduzir os respingos entre colunas adjacentes. O líquido drena por uma abertura no fundo do recorte para o reservatório. A capacidade do reservatório é de aproximadamente 100 mL, acomodando duas etapas de lavagem com alta carga na coluna. A camada de colunas de filtro pode ser colocada acima da camada de coluna quando necessário, com as colunas de filtro posicionadas acima e em contato com as colunas de ligação. A tampa sela a camada que contém o filtro ou colunas de ligação, limitando o fluxo de ar durante a rotação da centrífuga. A versão básica de rack é compatível com rotores de balde A-2-DWP (por exemplo, Eppendorf 5804), rotor 1770 (por exemplo, HETTICH Rotina 380) ou sistemas equivalentes.

A versão mini rack (Figura 2) é adequada para uma ampla variedade de rotores de balde de centrífuga. Ele é composto por três partes e tem dimensões mínimas de 82,5 × 128 × 58 mm (com a camada da coluna do filtro). Permite o uso de até 48 colunas com maiúsculas ou até 90 colunas sem maiúsculas. A geometria desta versão é semelhante à do rack básico, mas as fileiras externas das posições das colunas são removidas e substituídas por sulcos para as tampas das colunas. A capacidade do reservatório varia dependendo da versão impressa. O menor reservatório (20 mL) acomoda uma etapa de lavagem para aproximadamente 30 colunas; reservatórios maiores permitem maior vazão. A camada da coluna do filtro possui bordas arredondadas para permitir o movimento da balde do rotor em centrífugas menores. A versão mini rack é compatível com rotores de balde UC-124 (por exemplo, Accumax iFuge UC02) ou sistemas equivalentes. Quando usado sem a camada de coluna do filtro, o rack é compatível com rotores de balde A-2-MTP (por exemplo, Eppendorf 5430) ou seus equivalentes.

A versão sem reservatório (não coberta) (Figura 3) é adequada para usuários com experiência limitada em impressão 3D, pois o reservatório é substituído por um recipiente externo, como uma caixa de ponta de pipeta. Esta versão consiste em três partes e mede 79 × 115 × 61,5 mm. Permite o uso de até 48 colunas com maicuras ou até 78 colunas sem maiúsculas. A geometria é semelhante às versões anteriores, mas não possui um reservatório integrado. Em vez disso, um recipiente adequado é usado para a coleta de resíduos. As camadas de coluna e filtro têm menos posições de assento, e a camada de filtro inclui assentos cônicos para evitar interferência com o movimento do rotor. A base é projetada para caber em recipientes padrão e pode ser estabilizada usando espaçadores laterais. A compatibilidade depende do recipiente selecionado, mas inclui rotores de balde A-2-DWP (por exemplo, Eppendorf 5804), rotor 1770 (por exemplo, HETTICH Rotina 380) e rotores de balde UC-124 (por exemplo, Accumax iFuge UC02).

A versão de rack de tampas (Figura 4) é a configuração mais simples e é usada junto com placas de 24 poços profundos de 5 mL ou 10 mL. Consiste em um único componente com dimensões de 73 × 109 × 4 mm e permite o uso de até 48 colunas. Esta versão é compatível com qualquer rotor de centrífuga que suporte o formato de placa correspondente.

Rendimento e pureza
A extração de DNA foi realizada em culturas de E. coli usando tanto o protocolo padrão de microcentrífuga manual quanto o método baseado em rack. A análise espectrofotométrica mostrou que a qualidade do DNA extraído usando os racks era comparável à obtida com o método padrão. As razões típicas A260/A280 variavam entre 1,8 e 1,9 para ambas as abordagens. O rendimento total do plasmídeo (μg) não mostrou diferença significativa entre o método convencional e a extração usando as configurações de rack (Figura 5); dados brutos são fornecidos no Arquivo Suplementar 2. A conformação plasmídica também foi preservada, com distribuições semelhantes de formas relaxadas, linearizadas e superenroladas (Figura 6).

Análise de contaminação cruzada
Para avaliar a possível contaminação cruzada, foi realizado um experimento de tabuleiro de xadrez. As colunas foram carregadas alternadamente com uma solução de brometo de etídio de alta concentração (simulando DNA de alto título) e água. Após a centrifugação a 2.000 × g, a distribuição do corante foi confinada à área de resíduos diretamente abaixo das colunas carregadas, e nenhum sinal visível foi detectado em poços adjacentes ou nas pontas das colunas vizinhas (Figura 7). Essas observações indicam que o design da cremalheira reduz a probabilidade de respingo e transferência de colunas cruzadas nas condições testadas.

Para avaliar ainda mais a contaminação, foi realizada PCR em tempo real usando um amplicão como agente contaminante (ver Arquivo Suplementar 2). A amplificação foi detectada apenas em eluados das colunas às quais o amplicão havia sido adicionado (Figura 8). Sob as condições testadas, não foi detectada contaminação cruzada; no entanto, o desempenho pode variar dependendo do fluxo de trabalho e do tipo de amostra.

Figura 1: Versão básica do esquema de montagem de rack. Vista CAD explodida mostrando a (A) Tamponha, (B) Camada da Coluna do Filtro, (C) Camada do Suporte da Coluna e (D) Reservatório da Base. O suporte é composto por quatro partes com dimensões de 88 × 130 × 77 mm e permite o uso simultâneo de até 48 colunas com tampas ou até 116 colunas sem tampas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Versão mini do esquema de montagem de rack. Vista CAD explodida mostrando a camada (A) da coluna do filtro, (b) camada do suporte da coluna e (c) reservatório base. Esta versão é geometricamente semelhante à versão básica, mas as duas fileiras laterais dos assentos das colunas foram removidas e substituídas por sulcos para as tampas das colunas. Consiste em três partes, tem dimensões mínimas de 82,5 × 128 × 58 mm (com a camada da coluna do filtro) e permite o uso de até 48 colunas com tampas ou até 90 colunas sem tampas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Versão sem reservatório (descoberta) do esquema de montagem do rack. Vista CAD explodida mostrando a camada (A) da coluna do filtro, (B) camada do suporte da coluna, (C) base e (D) caixa da ponta da pipeta. Esta versão substitui o reservatório integrado por um recipiente externo, como uma caixa de ponta de pipeta. Consiste em três partes, tem dimensões de 79 × 115 × 61,5 mm, e permite o uso de até 48 colunas com tampas ou até 78 colunas sem tampas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Versão com capacho dos racks de 24 poços. Vista superior (esquerda) e vista inferior (direita). Esta é a versão de rack mais simples, usada junto com placas de 24 poços profundos de 5 mL ou 10 mL. Consiste em uma única peça com dimensões de 73 × 109 × 4 mm e permite o uso de até 48 colunas com ou sem tampas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Comparação entre rendimento e pureza do DNA. Análise espectrofotométrica do rendimento plasmídico (μg/mL). Não foi observada diferença estatisticamente significativa no rendimento total dos plasmídeos entre o método convencional e a extração usando as configurações de rack. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Comparação da qualidade do DNA. As formas de DNA foram visualizadas por eletroforese em gel de agarose. As formas relaxadas, linearizadas e superenroladas do DNA são semelhantes entre a extração manual padrão e a extração baseada em rack. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Avaliação de contaminação cruzada. Vista do reservatório de resíduos após a centrifugação, mostrando piscinas de resíduos discretas sem sobreposição. As colunas foram carregadas com uma solução de brometo de etídio de alta concentração (simulando DNA de alto título) e água. Nenhum corante foi observado em poços de "água" adjacentes ou nas pontas das colunas vizinhas após a centrifugação, indicando redução de respingos e transferência entre colunas sob as condições testadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 8: Análise da contaminação cruzada usando PCR quantitativa. As curvas de amplificação para amostras contendo o agente contaminante são mostradas em vermelho, enquanto amostras contendo apenas água são mostradas em verde. A amplificação foi detectada apenas em amostras contendo o agente contaminante. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Arquivos de modelos 3D para designs de rack. Este conjunto de arquivos contém arquivos STL para todas as configurações de rack, incluindo a versão básica de rack, versão mini rack (com múltiplas variantes de altura de reservatório), versão sem reservatório e versão de rack de tampon. Componentes individuais (por exemplo, reservatório base, camada de suporte de coluna, camada de filtro de coluna e tampo) são fornecidos para impressão 3D. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Dados e métodos de suporte. Este conjunto de arquivos contém a tabela de compatibilidade de centrífugas, procedimentos detalhados de teste de contaminação cruzada, conjuntos de dados de produção de DNA bruto e arquivos de saída de instrumentos PCR associados à análise de contaminação. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S1: Versão básica em rack (totalmente montada). Imagem de alta resolução da configuração básica do rack totalmente montada, ilustrando a estrutura geral e a disposição dos componentes. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo aborda a "lacuna de throughput" em muitos laboratórios de biologia molecular. Embora placas filtrantes de 96 poços sejam mais rápidas, podem apresentar menores capacidades de ligação ou concentrações finais reduzidas em comparação com colunas de spin^{individuais 14}. Ao adaptar colunas de rotação padrão para um formato de rotor de placa, esse método combina o alto rendimento das colunas com a velocidade dos fluxos de trabalho baseados em placas.

Os racks são mais vantajosos ao processar mais de 12 amostras. A principal inovação do protocolo é o uso de racks de 24 poços, que simplificam e aceleram a extração de ácidos nucleicos baseados em colunas ao empregar um reservatório compartilhado para o descarte de soluções sobrenadantes e de lavagem. Ao usar os racks, o tempo necessário para realizar essas etapas para 14–116 amostras é comparável ao necessário para 2–12 amostras. Além disso, o esforço do operador é reduzido, pois etapas repetitivas como remover tubos individuais, transferir colunas, descartar soluções de lavagem e abrir tampas são minimizadas. Como os componentes originais do kit (soluções e colunas de spin) permanecem inalterados, espera-se uma qualidade de DNA comparável e é apoiada pelos resultados apresentados.

A impressão 3D dos racks de 24 poços é viável com equipamentos padrão, mas pode exigir experiência para as versões básica e mini. As versões sem reservatório e com capacete são mais simples e podem ser produzidas com experiência mínima de impressão. Uma consideração fundamental na modelagem por deposição fundida é a formação de microlacunas entre camadas, que podem comprometer a estanqueidade sob centrifugação. Os testes indicaram que 100% de preenchimento, uma espessura da parede do reservatório de 7 mm e uma altura da camada de 0,1 mm fornecem estanqueidade suficiente. Aquecer a base de impressão e aplicar alisamento de superfície melhorou ainda mais o desempenho de vedação. Em contraste, as abordagens de vedação pós-impressão usando resinas epóxi ou solventes orgânicos não foram eficazes, pois a deformação durante a centrifugação levou a trincas e vazamentos. Espessura insuficiente da parede também pode resultar em falha estrutural e perda de estanqueidade, potencialmente levando ao desequilíbrio das centrífugas. Portanto, recomenda-se o teste pré-uso dos componentes impressos.

As quatro versões em rack são adequadas para uma ampla gama de centrífugas com rotores de balde, permitindo que os usuários escolham a configuração que melhor se adequa aos seus equipamentos e necessidades de rendimento. A versão básica em rack oferece a maior produtividade, mas requer centrífugas maiores e maior qualidade de impressão. A versão mini reduz o tamanho das centrífugas, mas também diminui o débito. A versão sem reservatório simplifica a fabricação e é compatível com recipientes comumente disponíveis, como caixas de pontas de pipeta, embora a compatibilidade dependa da geometria do recipiente. A versão cap-rack é a configuração mais simples, mas não pode ser usada com colunas de filtro.

Colunas de filtro que não se ligam a ácidos nucleicos podem ser menos facilmente disponíveis do que colunas de ligação^{padrão 9}. Na ausência deles, podem ser necessárias etapas adicionais de esclarecimento, aumentando o tempo total de processamento. Alternativamente, podem ser usadas ponteiras de pipeta de filtro (1000 μL) ou o protocolo de dióxido de titânio.

Os racks de extração funcionam como um complemento mecânico aos fluxos de trabalho padrão de extração de DNA⁹ e não alteram a composição do tampão ou a química da coluna (exceto na variante de dióxido de titânio). Assim, não se espera impacto substancial na qualidade do DNA, o que é consistente com a eletroforese em gel de agarose, e comparações de resultados mostrando formas e quantidades de plasmídeos semelhantes em relação ao método padrão.

Embora o uso de um reservatório de resíduos compartilhado introduza um risco potencial de contaminação cruzada, isso não foi observado nas condições testadas. Um elemento chave do projeto é a geometria "chaminé" das saídas das colunas, que mantém a separação entre as pontas da coluna e a superfície do líquido residual. Para preservar essa separação, o reservatório não deve ser supercarregado, e recomenda-se esvaziar após cada fluxo completo.

Uma limitação do método é a velocidade máxima dos rotores de balde oscilante (tipicamente 2.000 × g). Embora seja suficiente para etapas de amarração e lavagem, essa velocidade não é adequada para a secagem completa da membrana. Portanto, é necessário um passo final de centrifugação em alta velocidade em uma microcentrífuga de ângulo fixo. Apesar desse passo adicional, a economia de tempo total continua substancial para lotes que ultrapassam 24 amostras.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
3D Printer Filament	NIT, Russia	-	PETG ou PLA recomendado
Buffer N3	Qiagen, Netherlands	19064
Buffer P1	Qiagen, Netherlands	19051
Buffer P2	Qiagen, Netherlands	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, China
Elution Buffer	Qiagen, Netherlands	19086
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf, Germany	22626001	Rotor de ângulo fixo
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf, Germany	22625080	Rotor de placa de cesta oscilante
Ethidium Bromide	Biolabmix, Russia	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filter Pipette Tip	GenFollower, China	E-FTB1000	Parte das Colunas de Filtro
Miniprep Without Filter Barrier Spin Column	JVLAB, China	-	Parte das Colunas de Filtro
Phenol Red	Lenreactiv, Russia	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Czech Republic
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen, Netherlands	27115
RNase A	Qiagen, Netherlands	19101
Wash Buffer	Qiagen, Netherlands	19065