Uma Plataforma Digital de Eletroporação Microfluídica para Edição do Genoma CRISPR de Baixa Entrada e Transfecção de mRNA em Células T em Suspensão e Modelos de Células 3D

Resumo

Este protocolo descreve a edição miniaturizada do genoma CRISPR–Cas9 do receptor TCRα/β em células T humanas primárias usando 'DMF-ection', uma plataforma de eletroporação microfluídica digital (DMF). O método permite edição gênica paralela, de baixa entrada e alta viabilidade, e é ainda mais adaptável para a entrega de mRNA em esferoides 3D multicelulares.

Resumo

A eletroporação microfluídica digital (DMF) permite a manipulação genética precisa e de baixo volume das células de mamíferos, minimizando a entrada celular em até 100 vezes e preservando a viabilidade. Este estudo apresenta um fluxo de trabalho de transfecção baseado em DMF de alta produtividade para a eliminação mediada por CRISPR do locus TRAC em células T em suspensão humana primária e para a transfecção de mRNA de esferoides HEK293T tridimensionais. Utilizando RNAs guia CRISPR depositados espacialmente e montagem de ribonucleoproteína (RNP) no cartucho, a perturbação eficiente do locus TRAC foi alcançada em populações de células T CD4⁺ e CD8⁺ usando apenas 10.000 células por condição, com viabilidade pós-edição superior a 85%. Caracterizações biofísicas usando análises induzidas por fluxo e dispersão de Taylor revelaram que aditivos poliméricos estabilizam complexos Cas9–sgRNA sob condições de tampão de eletroporação, apoiando a edição reprodutível em volumes submicrolitros. O fluxo de trabalho foi ainda adaptado para aplicações 3D ao entregar mRNA EGFP em esferoides HEK293T intactos, resultando em fluorescência robusta e espacialmente uniforme sem prejudicar o crescimento ou a morfologia dos esferoides. Juntos, esses resultados demonstram que a eletroporação por DMF possibilita a edição eficiente do genoma e a entrega de mRNA tanto em células imunes em suspensão quanto em esferoides multicelulares. Essa plataforma oferece uma solução escalável e de baixa entrada para aplicações em terapia com células CAR-T, genômica funcional e modelos celulares 3D avançados.

Introdução

A edição gênica em células humanas primárias é cada vez mais central tanto para o desenvolvimento terapêutico quanto para a pesquisa básica, incluindo aplicações em imunoengenharia, modelagem de doenças raras e genômica^{funcional 1}. Embora a eletroporação permita uma edição genômica altamente eficiente, sistemas convencionais baseados em cuvetas normalmente exigem até milhões de células por condição, restringindo seu uso para amostras derivadas de pacientes e populações imunes^{raras 2}. Além disso, esses sistemas são pouco adequados para triagem em grande escala devido a limitações em taxa de transferência, automação e consumo de^{reagentes 3}.

A eletroporação microfluídica emergiu como uma abordagem promissora para edição genômica de baixa entrada⁴. No entanto, a maioria das plataformas existentes depende de arquiteturas de fluxo contínuo que envolvem manuseio complexo de fluidos, flexibilidade limitada na mistura de reagentes e requisitos relativamente altos de célula por condição. Em contraste, a microfluídica digital (DMF) permite a manipulação ativa de gotículas discretas em escala de nanolitros em uma matriz plana de eletrodos, possibilitando controle preciso sobre a composição da reação, o tempo e a localização espacial. Este formato plug-and-play baseado em gotículas é bem adequado para fluxos de trabalho de baixo volume e alta produtividade, onde a conservação de células primárias e reagentes é^{essencial 5}.

Trabalhos recentes demonstraram a viabilidade da entrega intracelular baseada em DMF usando arquiteturas de eletroporação tri-gotas que geram campos elétricos localizados e de baixa corrente para entrega eficiente de RNP e mRNA, minimizando o estresse térmico^{e eletroquímico 6,7,8}. Com base nessa base, foi desenvolvida uma plataforma de eletroporação DMF de próxima geração, denominada 'DMF-ection', com 48 sítios de reação endereçáveis de forma independente, compatibilidade total de automação e fabricação escalável de^{cartuchos 9} (Figura 1). O cartucho DMF consiste em uma placa inferior de PCB e uma placa plástica superior separadas por uma junta, montadas por encaixes de alinhamento em uma única orientação correta (Figura 1A). O layout 48-plex está organizado em oito famílias idênticas (Figura 1A–H), cada uma contendo seis sítios de eletroporação endereçáveis independentemente, suportando até 48 condições de edição paralela por cartucho (Figura 1B). Bibliotecas de RNA-guia são depositadas na superfície do substrato usando um dispensador acústico antes da montagem do cartucho. A precisão posicional da deposição foi confirmada em todos os 48 locais, com posições de queda agrupadas dentro de um desvio submilimétrico do ponto médio do eletrodo (Figura 1C), apoiando a montagem confiável de RNP no cartucho. Após o carregamento, células e gotículas de eletrodos líquidos são acionadas no cartucho para formar a geometria de eletroporação tri-gota (Figura 1D). Após a eletroporação, as células são descarregadas em placas de cultura para recuperação e análise a jusante, incluindo citometria de fluxo, sequenciamento e microscopia (Figura 1E). Esse sistema permite a edição genômica de alta eficiência usando até 100 vezes menos células do que métodos padrão baseados em cuvettes, ampliando significativamente o acesso à engenharia genômica em aplicações de baixa entrada e alta produtividade.

Este estudo avalia o desempenho da plataforma ao entregar múltiplas cargas biomoleculares, incluindo mRNA e complexos ribonucleoproteicoínos (RNP) CRISPR–Cas9, alcançando transfecção eficiente e perturbação gênica. Além das células T primárias, a DMF-ection fornece uma estrutura generalizável para a entrega de ácidos nucleicos em estruturas multicelulares complexas. Esferoides tridimensionais (3D) e modelos do tipo organoide impõem barreiras significativas à penetração de reagentes devido à sua arquitetura e fragilidade, e abordagens convencionais de eletroporação frequentemente interrompem a morfologia ou geram entrega heterogênea. Para avaliar se os mesmos princípios miniaturizados de eletroporação usados na edição de células T se estendem a tecidos estruturados, o fluxo de trabalho DMF foi aplicado a esferoides de HEK293T 3D. Esses experimentos demonstraram que a eletroumedição baseada em DMF pode posicionar suavemente esferoides intactos dentro de geometrias de três gotículas e suportar a entrega uniforme de mRNA, preservando a estrutura e o crescimento. Embora esses resultados estejam fora do protocolo primário de células T descrito aqui, eles ilustram a aplicabilidade mais ampla da eletroporação programável de DMF para sistemas celulares 3D emergentes relevantes para descoberta de fármacos e modelagem de doenças.

Protocolo

As células T humanas primárias usadas neste protocolo foram obtidas de fornecedores comerciais sob consentimento informado do doador e em conformidade com as diretrizes institucionais, éticas e regulatórias aplicáveis. Todo o manuseio de materiais biológicos de origem humana foi realizado de acordo com os protocolos institucionais de biossegurança. Os pesquisadores que implementam este protocolo são responsáveis por garantir que o uso de células humanas primárias esteja em conformidade com os requisitos do conselho de revisão institucional local (IRB) ou comitê de ética, regulamentos de biossegurança aplicáveis e qualquer legislação nacional ou regional relevante que rega o uso de material biológico humano. Nenhuma informação identificável pelo paciente foi associada ao material celular utilizado neste estudo.

1. Preparação e ativação das células T humanas primárias

1. O descongelamento criopreservou rapidamente células T primárias humanas CD3⁺ em um banho-maria a 37 °C. Transfira as células para um meio basal de células T pré-aquecidas e centrifuge a 180 × g por 10 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda a pastilha em meio fresco.
2. Determine a concentração e viabilidade celular usando um contador automático de células.
3. Ressuspenda células a 1 × 10⁶ células/mL em meio de cultura de células T suplementado com um estímulo ativador de células T CD3/CD28 com anticorpo tetramérico solúvel (segundo instruções do fornecedor) e 200 IU/mL de IL-2. Incubar células por 72 horas a 37 °C, 5% CO₂.
   NOTA: Mantenha a densidade celular entre 0,5–2 × 10⁶ células/mL durante a ativação. Realizar ativação em placas U-bottom de 96 poços para otimizar a eficiência do contato célula-ativador e da ativação.

2. Preparação de manchas de RNA-guia no substrato do DMF (spotting acústico do dispensador)

1. Reconstituir sgRNA liofilizado em água livre de nuclease para uma concentração de estoque de 100 μM. Em um tubo separado, prepare um estoque de 100 mg/mL de ácido poli-L-glutâmico (PGA, sal de sódio, MW 15.000–50.000 Da) em água livre de nuclease. Combine estoque de sgRNA e PGA em uma razão de volume 5:4 (sgRNA: PGA) que resulta em uma concentração final de sgRNA de 55,6 pmol/μL e uma concentração final de PGA de 44,4 mg/mL em água livre de nuclease. Vortex brevemente e centrifugar a 1.000 × g por 30 s e aliquotas em volumes descartáveis, armazenando alíquotas não utilizadas a −80 °C por até 6 meses.
   NOTA: Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
2. Adicione a mistura guia-PGA a uma placa de fonte acústica de baixo volume morto em poços correspondentes ao layout desejado do local de reação.
3. Transfira 40 nL (equivalente a 2,2 pmol sgRNA) da mistura guia-PGA para cada região de detecção alvo do substrato DMF usando um dispensador acústico calibrado.
   NOTA: A 55,6 pmol/μL, 40 nL entrega 2,2 pmol sgRNA por local (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Guias secas são reconstituídas durante a fusão de gotas no cartucho; A resuspensão completa é confirmada pela eficiência consistente de edição entre os sites.
4. Em um armário de segurança biológica, deixe as gotículas manchadas secarem completamente ao ar em temperatura ambiente até que não reste líquido visível (aproximadamente 5 min).
   NOTA: Não use fluxo de ar forçado ou calor, pois isso pode desalojar ou degradar o RNA guia.
5. Montar o cartucho DMF.
   1. Em um armário de segurança biológica, alinhe a placa superior sobre o substrato manchado combinando as características assimétricas de encaixe plástica da placa superior com as ranhuras na placa inferior. Aplique pressão uniforme e simultânea ao longo das bordas curtas até que um estalo mecânico distinto seja sentido, confirmando o engato total das características de travamento.
      NOTA: O cartucho foi projetado com uma única orientação correta; Montagem incorreta não vai produzir o estalido. Segure os substratos pelas bordas o tempo todo para evitar contaminação ou danos às superfícies funcionais e evite que os substratos deslizem uns contra os outros, pois isso pode riscar os revestimentos superficiais.
   2. Ponto de verificação: Confirme a montagem correta com o encaixe mecânico.
      NOTA: Não há um indicador elétrico pré-corrido da integridade do revestimento; quaisquer falhas funcionais resultantes de montagem inadequada são detectadas automaticamente e reportadas no relatório de controle de qualidade pós-execução.
      Ponto de pausa: Armazene cartuchos montados não utilizados em um pacote selado com dessecante (pacotes de gel de sílica) em temperatura ambiente por até 48 horas.

3. Preparação da célula

1. Prepare 1 mL de tampão de transfecção completo fresco antes de cada uso, combinando tampão de eletroporação compatível com DMF com o surfactante biocompatível não iônico fornecido em uma proporção de 20:1 (v/v) (tampão de eletroporação: surfactante), obtendo uma concentração final de surfactante de 0,05% (v/v). Misture delicadamente e mantenha no gelo.
   NOTA: O buffer de transfecção compatível com DMF usado aqui é um buffer isotônico de baixa condutividade (condutividade: 3,5 mS/cm, osmolalidade: 305 mOsm/L). Pesquisadores que utilizam buffers alternativos devem verificar a compatibilidade com a atuação do DMF e a viabilidade da célula. O surfactante biocompatível não iônico serve para reduzir a fixação de gotículas; se o surfactante fornecido não for utilizado, um substituto adequado.
2. Lave as células T ativadas uma vez com Tampão de Transfecção (que não contém surfactante). Centrifugar a 180 × g por 5 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em Buffer de Transfecção Completa (contendo surfactante) a 1,0 × 10⁷ células/mL em um volume total de 100 μL por cartucho. Fique no gelo.
3. Imediatamente antes de carregar no cartucho, adicione nuclease Cas9 diretamente aos 100 μL da suspensão de células T e misture pipeteando suavemente; Fique no gelo.
   NOTA: Para células T primárias, o Cas9 é carregado a 42 pmol por volume de cartucho de 100 μL (0,42 pmol/μL). Cada sítio de eletroporação processa aproximadamente 1 μL de suspensão celular, entregando 0,42 pmol Cas9 por edição. Otimize essa dose ao se adaptar a outros tipos de células imunes (veja a Tabela 1).

Componente	Concentração final por edição
Cas9	0,42 pmol em uma gota de ~1 μL
sgRNA	2,1 PMOL (de 40 nL Spot)
PGA	44,4 mg/mL de estoque na mistura para manchas
Tensioativo	0,05% (v/v)
Entrada de célula	~10.000 células

Tabela 1: Tabela resumida das concentrações finais em cada gotícula de transfecção.

4. Transfecção na plataforma de DMF-ecção

1. Usando uma pipeta multicanal, dispense 10 μL da mistura T-célula/Cas9 em cada uma das 8 portas de carga das células, e 10 μL de tampão de transfecção completo nas 16 portas de carga de eletrodos líquidos (conforme mostrado na Figura 1).
2. Ajuste a voltagem para 500 V, duração do pulso para 3 ms e número de pulsos para 2. Inicie a sequência de eletroporação conforme as instruções da plataforma.
   1. Checkpoint: Revise o relatório de controle de qualidade pós-corrida imediatamente após a corrida. Falhas esporádicas (<10% dos sites) não requerem intervenção. Se as falhas forem sistemáticas, substitua o cartucho pela placa de controle de qualidade fornecida, execute a Verificação de Saúde do Sistema (~2 min) e entre em contato com o suporte técnico caso os problemas persistam.

5. Descarregamento e recuperação de células T editadas

1. Usando um manipulador de líquidos, transfira células eletroporadas de cada local de reação para uma placa U-bottom de 96 poços contendo 150 μL de meio basal de células T pré-aquecidas, suplementado com 200 IU/mL de IL-2.
2. Incubar células por 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂ para permitir a renovação proteica e mudanças na expressão dos receptores na superfície.

6. Análise de citometria de fluxo do TRAC knockout

1. Transfira as células para uma placa inferior cônica estéril de 96 poços para reduzir a perda celular entre as lavagens. Lave as células duas vezes com o Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) centrifugando a 400 × g por 5 minutos e removendo o sobrenadante invertendo suavemente a placa cônica inferior. As células permanecerão em pellets na placa.
2. Prepare uma mistura mestre de coloração superficial contendo anticorpos anti-CD4, anti-CD8 e anti-TCRα/β em Buffer de Citometria de Fluxo nas concentrações recomendadas pelo fabricante. Adicione 25 μL da mistura master por poço e incube por 20 minutos a 4 °C protegido da luz. Lave duas vezes com 1× PBS (sem FBS) centrifugando a 400 × g por 5 minutos. Resuspenda as células em 100 μL de 1× PBS contendo um corante de viabilidade em 1:1.000 (v/v) e incube por 10 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz.
   NOTA: Placas cônicas inferiores são eficazes para pelletar células; Verifique se as células estão bem ressuspensas em todas as etapas.
3. Lave as células duas vezes com o Tampão de Citometria de Fluxo e ressuspenda em 150–200 μL por amostra para aquisição.
4. Configure o citômetro com linhas de laser e conjuntos de filtros apropriados para os fluorocromos usados (por exemplo, excitação de 488 nm para corante de viabilidade; 405 nm ou 488 nm para marcadores de superfície, conforme apropriado). Ajuste as tensões usando controles de compensação de uma única coloração e uma amostra não corada. Colete no mínimo 5.000 eventos de singlets ao vivo por amostra. Gate sequencial em: singletes de dispersão → células vivas (corante de viabilidade negativo) → CD4⁺ ou CD8⁺ → expressão TCRα/β.
   NOTA: Sob condições padrão, o total de eventos ao vivo adquiridos pode variar de 5.000 a mais de 10.000 por amostra após perdas durante lavagem e coloração, dado que as células tiveram tempo para proliferar.
5. Determine a perturbação do gene TRAC medindo a frequência das células TCRα/β-negativas nas populações CD4⁺ e CD8⁺. Reporte a eficiência de knockout como a porcentagem de células TCRα/β-negativas em relação à porta singlete viva para cada subconjunto.

Resultados

Desfechos esperados
A eletroporação de 10.000 células T ativadas por condição normalmente resulta em >85% de eficiência de eliminação TRAC com viabilidade de >95% 72 horas após a transfecção. A citometria de fluxo revela uma clara perda de coloração TCRα/β na condição de direcionamento TRAC em relação aos controles de sgRNA (NTC) não direcionados e aos controles não expostos a campos elétricos. Salvo indicação em contrário, n representa execuções independentes de DMF-ection realizadas em dias separados. Réplicas técnicas da mesma sequência de cartuchos foram médias antes da análise estatística e não contribuem independentemente para n. Todos os experimentos com células T relatados aqui foram realizados usando células criopreservadas provenientes de um único doador saudável. A variabilidade de doador para doador usando a mesma plataforma é ainda^{mais caracterizada 9}.

Estabilidade melhorada da ribonucleoproteína Cas9–sgRNA sob condições de eletroporação devido a aditivos de polímeros aniônicos
Um requisito central de design da microfluídica digital é uma superfície altamente hidrofóbica, que permite que gotas deslizem livremente durante a eletroumedição. Embora essa propriedade seja essencial para o movimento das gotas e para a atuação precisa, ela cria desafios para a carga dos reagentes. Para aplicações de rastreamento em array, é fundamental que bibliotecas de cargas úteis definidas pelo usuário possam ser depositadas diretamente na superfície do cartucho. Isso permite que layouts de reagentes espelhem o design da biblioteca do usuário e garante que o fluxo de trabalho microfluídico digital execute experimentos em arrays sem necessidade de transferência adicional ou intervenção manual. A dispensa de nano dispensador acústico é muito adequada para essa tarefa, pois pode fornecer volumes de nanolitros com alta precisão posicional em grandes arrays em várias superfícies. No entanto, quando gotas atingem a superfície hidrofóbica do cartucho, elas frequentemente ricocheteiam, formam gotas ou não se espalham uniformemente, levando a deposição e recuperação inconsistentes. Essa variabilidade é mais evidente em volumes intermediários de gotículas que variam de 40 nL a 120 nL (Figura 2A, n = 3 por condição, *** valor p < 0,01), onde se hipotetiza que a energia cinética da gota é alta o suficiente para causar rebote, mas a adesão superficial é insuficiente para ancorar o líquido. Como resultado, a deposição direta no cartucho em doses mais altas de carga útil pode ser pouco confiável sem modificações adicionais. Para mitigar esse efeito, reagentes foram suplementados com o polímero bioseguro poli-L-glutâmico ácido (PGA). O PGA é um polipeptídeo biodegradável e carregado negativamente amplamente utilizado como estabilizador em formulações farmacêuticas, com excelente compatibilidade para fluxos de trabalho de células vivas. A espinha dorsal carregada é hipotetizada para diminuir o ângulo de contato das gotículas e promover uma dispersão mais uniforme, reduzindo o rebote e melhorando a adesão da superfície. Com a presença do PGA, os volumes depositados de fluoresceína escalaram linearmente com a absorção, e a variação foi significativamente reduzida entre os cartuchos. Análises estatísticas confirmaram que a PGA melhorou significativamente a reprodutibilidade em volumes de detecção de 40, 90 e 120 nL (***p < 0,001, ****p < 0,0001), enquanto gotículas muito pequenas (10–20 nL) mostraram pouca diferença, já que o rebote é menos pronunciado em energias cinéticas baixas.

Em seguida, a adição de aditivos poliméricos usados no fluxo de trabalho do DMF foi avaliada quanto à sua influência no comportamento da ribonucleoproteína (RNP) do Cas9–sgRNA sob as condições de tampão de baixo volume usadas para eletroporação. Para isso, foi utilizada a tecnologia de análise de dispersão induzida por fluxo (FIDA). O FIDA foi selecionado por fornecer uma medição precisa em fase de solução do raio hidrodinâmico e da afinidade de ligação, permitindo que as interações proteína-ácido nucleico sejam quantificadas sob as mesmas condições de tampão usadas em um contexto experimental. O FIDA demonstrou que o sgRNA livre exibia um raio hidrodinâmico (Rh) de 3,45 ± 0,26 nm, consistente com uma espécie pequena de RNA de fita simples. A titulação com Cas9 produziu um complexo RNP estável com um Rh de 15,32 ± 0,46 nm e afinidade de ligação sub-nanomolar (KD = 0,70 ± 0,14 nM) (Figura 2).

Para avaliar o efeito da estabilização polimérica, o ácido poli-L-glutâmico (PGA) foi adicionado ao RNA-guia antes da formação do RNP. A presença de PGA reduziu a aparente afinidade entre Cas9 e sgRNA (K_D = 67,7 ± 9,5 nM) e diminuiu o tamanho do complexo para aproximadamente 10 nm (Figura 2A , painel direito). Embora a afinidade reduzida sugira complexos menos fortemente associados, o_{R h} menor e mais uniforme indicava que a PGA impede a formação de conjuntos de RNP sobredimensionados (Figura 2B).

Em seguida, a estabilidade do RNP foi avaliada sob condições de eletroporação usando análise de dispersão de Taylor (Figura 2C). Sem polímero, misturas Cas9–sgRNA produziram Taylorgramas largos e mal ajustados, indicativos de agregação (Figura 2B). Em contraste, a adição de 0,0025 mg/mL PGA resultou em perfis de dispersão monodispersa bem definidos (R² = 0,999) com_{R h} ~ 9,6 nm. Esses resultados demonstram que a PGA previne a agregação e melhora a uniformidade do RNP, apoiando assim a eletroporação reprodutível em escala de nanolitros. Essa estabilização fornece uma justificativa mecanicista para as altas eficiências de edição observadas em experimentos de células T a jusante.

Eficiência de edição dependente da dose em células T primárias

Embora experimentos FIDA tenham indicado que a PGA reduz a eficiência da montagem de RNP, os resultados funcionais da edição foram hipotetizados como menos afetados, já que a eletroporação é tipicamente realizada com excesso de RNA-guia em relação ao Cas9. Portanto, o volume de entrada PGA–RNP foi avaliado quanto ao impacto na eficiência de eliminação em células T humanas primárias no locus TRAC (Figura 2D). Em quatro cartuchos, a eficiência de edição foi consistentemente alta (>75–80%) em entradas RNP de 40 nL (2,1 pmol), 20 nL (1,05 pmol) e 10 nL (0,53 pmol), com variabilidade mínima entre os subconjuntos CD4⁺ e CD8⁺ . Mesmo em 5 nL (0,26 pmol), a edição permaneceu robusta, embora uma redução modesta tenha sido observada em comparação com doses maiores. Na menor dose testada (2,5 nL, 0,13 pmol), a eficiência de edição diminuiu substancialmente, estagnando perto de ~60% TRAC KO. Os controles confirmaram a especificidade da edição: poços sem eletroporação (0V) e controles fora do cartucho (OCC) apresentavam apenas knockout em fundo. A frequência elevada de TCR-negativo observada na população CD8⁺ do controle fora do cartucho (OCC) provavelmente reflete a downmodulação basal específica do doador após a ativação, independentemente da eletroporação ou edição gênica, já que essas células não foram expostas ao cartucho. Juntos, esses resultados demonstram que a DMF-ection possibilita uma edição eficiente mediada por CRISPR em entradas RNP em escala de nanolitros. Importante, a edição foi comparável entre as células T CD4⁺ e CD8⁺ , destacando a aplicabilidade da plataforma em subconjuntos de células T e sugerindo que o uso de RNP pode ser reduzido em mais de uma ordem de magnitude sem comprometer a eficiência do knockout.

Perturbação gênica eficiente em células T CD4⁺ e CD8⁺ primárias usando DMF-ection miniaturizada
Para validar o desempenho do fluxo de trabalho DMF-ection com mais profundidade, foi avaliado o knockout mediado por CRISPR–Cas9 do locus TRAC em células T primárias humanas CD4⁺ e CD8⁺, utilizando apenas 10.000 células ativadas por condição. Três grupos experimentais foram incluídos: a condição guia de direcionamento do TRAC (TRAC KO), um controle não direcionado (NTC) para levar em conta efeitos não específicos da entrega RNP, e um controle fora do cartucho (OCC) para estabelecer a expressão basal de TCRα/β em células não tratadas e não manipuladas. Uma estratégia padrão de portão foi aplicada para identificar singlets vivos, seguidos pelos subconjuntos CD4⁺ e CD8⁺ e a expressão de TCRα/β (Figura 3A). A perturbação gênica de alta eficiência do locus TRAC foi alcançada em ambos os subconjuntos de células T ao longo de 40 execuções independentes de eletroporação. Em células T CD4⁺, a eficiência de knockout do TRAC atingiu 88,4 ± 4,9%, comparada a 3,2 ± 4,7% em NTC e 9,8 ± 5,1% em condições de OCC. Um resultado comparável foi observado em células T CD8⁺, onde o TRAC KO atingiu 89,8 ± 4,2%, contra 4,2 ± 7,4% (NTC) e 20,2 ± 4,9% (OCC) (Figura 3B, à esquerda). Importante destacar que a eletroporação não produziu citotoxicidade substancial em todas as condições. A viabilidade ultrapassou 96% em todos os grupos, sem diferença significativa entre as condições TRAC KO (97,1 ± 1%), NTC (96,8 ± 1%) e OCC (97 ± 1%) (Figura 3B, à direita). Juntos, esses dados demonstram que a eletroporação por DMF possibilita uma perturbação robusta e de alta eficiência do TRAC, ao mesmo tempo em que preserva a viabilidade celular em múltiplas execuções independentes. As células T humanas primárias foram obtidas de fontes comerciais com consentimento informado do doador e de acordo com as diretrizes éticas institucionais e do fornecedor.

Manuseio de esferoides HEK293T com microfluídica digital
Em seguida, o fluxo de trabalho de eletroporação microfluídica digital foi avaliado para aplicações com estruturas tridimensionais multicelulares. Esferoides ocos HEK293T foram formados semeando aproximadamente 100 células por poço em microplacas de baixa fixação e cultivando por 24 horas para permitir a formação de esferoides (Figura 4A). Esferoides formados eram posteriormente coletados, ressuspensos e carregados no cartucho microfluídico digital para eletroporação. Após o tratamento, os esferoides foram descarregados em uma placa de 96 poços para imagens a jusante e análise de crescimento.

Para alcançar uma recuperação média de um esferoide por poço após a eletroporação, um número excessivo de esferoides foi intencionalmente carregado no cartucho para compensar a perda de material durante o manuseio e transferência. Aproximadamente 192 esferoides foram resuspensos em 100 μL de buffer de eletroporação e carregados no cartucho. Cada família de reações recebeu ~9,3 μL da suspensão, correspondendo a ~18 esferoides, com gotículas individuais contendo ~1 μL (1–2 esferoides por gotícula). Como aproximadamente metade dos esferoides permanecia na porta de carregamento durante a operação do cartucho, essa estratégia de carregamento resultava em uma média de ~1 esferoide por sítio de eletroporação tri-gotícula.

A análise da recuperação de esferoides indicou que 0–1 esferoides eram tipicamente descarregados por poço após a eletroporação, correspondendo a aproximadamente 4–6 esferoides recuperados por família de reação (Figura 4B , painel à esquerda). Essa recuperação é menor que o máximo teórico e reflete perdas ocorridas durante a lavagem, aspiração de sobrenadante e retenção de esferoides na porta de carga. Essas perdas são atribuídas ao pequeno diâmetro do esferoide (~100 μm) e à dificuldade inerente de manter a distribuição uniforme de estruturas não unicelulares dentro da suspensão. Como resultado, alguns esferoides permanecem distribuídos de forma desigual ou não conseguem entrar na região das três gotículas. Carregar um número excessivo de esferoides garantiu que pelo menos um esferoide estivesse presente na maioria dos sítios de eletroporação, permitindo uma análise consistente a jusante, como demonstrado pela imagem no microscópio do esferoide corado com DAPI no cartucho microfluídico (Figura 4B, painel direito). Otimização adicional do processo pode reduzir o número de esferoides necessários para alcançar a recuperação equivalente. Apesar dessas perdas de manuseio, o fluxo de trabalho permitiu posicionamento suave dos esferoides intactos dentro da geometria de eletroporação tri-gotícula.

Entrega e viabilidade de mRNA de EGFP em esferoides HEK293T
A entrega eficiente de mRNA de EGFP em HEK293T esferoides foi observada após eletroporação (50 ng de mRNA de GFP por esferoide). A microscopia de fluorescência realizada 24 h após a eletroporação revelou expressão robusta e espacialmente uniforme de GFP em esferoides eletroporados, enquanto nenhuma fluorescência detectável foi observada em condições de controle de 0 V ou fora do cartucho (Figura 4C, painel esquerdo). A análise quantitativa da intensidade média de fluorescência (MFI) normalizada por área esferoide confirmou transfecção bem-sucedida sob ambos os conjuntos de parâmetros de eletroporação testados (Figura 4C, painel central). Especificamente, esferoides eletroporados a 500 V, 2 ms, 2 pulsos apresentaram um MFI de 6,96 × ^10-5 ± 3,50 × ^10-5, enquanto os eletroporados a 375 V, 6 ms, 1 pulso apresentaram MFI de 5,05 × ^10-5 ± 3,29 × ^10-5. Nenhuma fluorescência mensurável foi detectada em condições de controle (0 ± 0). Ambas as condições de eletroporação produziram fluorescência significativamente maior em comparação com os controles (p < 0,05), sem diferença estatisticamente significativa entre os parâmetros do pulso. Para avaliar se a eletroporação afetava negativamente o crescimento dos esferóides ou a integridade estrutural, os diâmetros dos esferóides foram medidos diariamente durante 5 dias após o tratamento. Esferoides eletroporados apresentaram cinética de crescimento comparável aos controles não tratados, indicando que a transfecção de mRNA não prejudicou a viabilidade ou a capacidade proliferativa dos esferoides (Figura 4C, painel direito). Juntos, esses resultados demonstram que a eletroporação microfluídica digital permite a entrega eficiente de mRNA em esferoides multicelulares intactos, preservando a integridade estrutural e o crescimento, apoiando a viabilidade de estender essa plataforma para modelos celulares tridimensionais.

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão. A significância estatística foi determinada usando ANOVA unidirecional com correção post hoc de Tukey para comparações múltiplas, com um limiar de significância de p < 0,05. Valores N representam réplicas biológicas independentes (doadores separados ou tiragens independentes de cartuchos) conforme especificado na figura.

Figura 1. Arquitetura e fluxo de trabalho da plataforma de eletroporação DMF. (A) Fotografia do cartucho DMF. (B) Esquema anotado do layout montado do cartucho 48-plex (imagem central), mostrando a organização (A–H) de oito famílias idênticas, cada uma contendo seis sítios de eletroporação endereçáveis independentemente, com portas de carregamento de eletrodos líquidos, portas de carregamento de células, ânodo, cátodo e regiões de nano pontos rotuladas (imagem inserida à esquerda). Características-chave, incluindo portas de carga, portas de descarga e encaixes de montagem, são identificadas. O cartucho é montado encaixando as duas placas em uma única orientação correta até que um engajamento mecânico distinto seja sentido. Imagem à direita: mapa de dispensadores do manuseador de líquidos mostrando posições codificadas por cores para portas de carga (vermelho), portas de descarga (rosa) e regiões de detecção de alvos (azul). (C) Esquerda: imagem mostrando a precisão posicional da dispensação acústica em todos os 48 locais (n = 48), com as posições da queda representadas em relação ao ponto médio do eletrodo (mm). O agrupamento apertado confirma a precisão da deposição submilimétrica. À direita: imagens representativas mostrando um ponto corretamente centralizado antes da reidratação pela gota celular (topo) e durante a reidratação, onde a gota é movida para frente e para trás onde está o guia para resuspender (seta inferior, seta vermelha). (D) Imagem em vista superior de regiões discretas de eletroporação, mostrando o movimento passo a passo das gotículas a partir de (i) reidratação da carga útil ao mover a gota para frente e para trás sobre o RNA-guia depositado, (ii) movimento até o local de eletroporação, entre o ânodo e o cátodo, onde a gotícula da célula se conecta com as duas gotículas de eletrodo líquido laterais e é pulsada, e (iii) o tri-drop completo se movendo para seu porto de descarga antes da recuperação pelo manuseador de líquidos. (E) Esquema de fluxo de trabalho de ponta a ponta. O RNA-guia é depositado sobre o substrato do cartucho usando um dispensador acústico. As células e a carga útil são preparadas e carregadas no cartucho usando um manuseador automático de líquidos. A eletroporação é realizada na plataforma DMF. As células são descarregadas em uma placa de 96 poços e transferidas para uma incubadora para recuperação. A análise a jusante é realizada usando citometria de fluxo, microscopia, sequenciamento de próxima geração ou outras leituras apropriadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2. Impacto da suplementação de polímeros na deposição e montagem de RNP. (A) A suplementação de polímeros melhora a fidelidade da deposição acústica. Absorção da fluoresceína após deposição e reconstituição em quatro cartuchos independentes, com ou sem ácido poli-L-glutâmico. A variância foi reduzida em volumes intermediários (40–120 nL) na presença de PGA. 
(B) Impacto da PGA na montagem de Cas9–sgRNA. Curvas de ligação de afinidade FIDA medindo o raio hidrodinâmico (Rh) na ausência (painel esquerdo) ou presença (painel direito) de PGA. O sgRNA livre exibiu Rh de 3,45 ± 0,26 nm, enquanto a titulação Cas9 gerou tamanho do complexo RNP de 15,32 ± 0,46 nm (Kd = 0,70 ± 0,14 nM). A adição de PGA reduziu o tamanho do complexo e enfraqueceu a afinidade de ligação de forma dependente da concentração. Com a adição de 0,005 mg/mL de PGA, o sgRNA livre exibiu Rh de 4,31 ± 0,07 nm, enquanto a titulação Cas9 gerou tamanho do complexo RNP de 10,21 ± 0,38 nm (K_d = 67,7 ± 9,5 nM). Experimentos foram realizados em um tampão de eletroporação de baixa condutividade com 0,05% de F-68 plurônico. A fluorescência foi detectada em 480 nm usando o módulo LED integrado. Um capilar permanentemente revestido (Ø 75 μm, L = 100 cm) foi usado em todos os experimentos. Para testar o efeito dos polímeros polianiônicos na montagem de RNP, PGA foi adicionado às misturas de ensaio em concentrações de 0,0025 mg/mL e 0,005 mg/mL. Essas condições foram selecionadas para modelar a faixa usada em microfluídica digital, eletrowettagem e tampões de eletroporação. Para análise direta de ligação, foi usado sgRNA marcado com FAM de 10 nM, direcionado ao locus TRAC, como indicador fluorescente. Concentrações crescentes de nuclease Cas9 (até 500 nM) foram ajustadas em relação ao indicador em um ensaio CapMix para gerar perfis de dispersão para formação de complexos. Todos os experimentos foram realizados a 25 °C, com cada ponto de dados consumindo 40 nL de Indicador e ~12 μL de analito (Cas9). Experimentos foram realizados com a seguinte sequência: (1) lavagem com ácido fosfórico a 0,1% a 3.500 mbar por 30 segundos; (2) lavagem com tampão de ensaio a 3.500 mbar por 30 s; (3) preenchendo o capilar com analito a 3.500 mbar por 20 segundos; (4) injetar o indicador a 50 mbar por 10 s; (5) mobilizar e medir com analito a 400 mbar por 180 s. Os raios hidrodinâmicos foram calculados usando a largura do pico extraída em metade da altura máxima e constantes de dissociação (K_D) foram determinadas por regressão não linear ajustando a um modelo de ligação 1:1. (C) Efeito da PGA na estabilidade da RNP. Perfis de dispersão de Taylor de complexos Cas9–sgRNA com e sem PGA, realizados com nuclease Cas9 de 500 nM e sgRNA marcado com 50 nM com FAM. Na ausência de PGA, nenhum complexo estável foi observado, como indicado pela formação crescente de grandes agregados junto com um sinal decrescente do complexo ao longo do tempo (à esquerda). A adição de 0,0025 mg/mL PGA resultou em um Taylorgram monodisperso bem definido com agregação mínima medindo um R_h ~ 9,6 nm (R² = 0,999, certo). A estabilidade complexa foi avaliada sob condições padrão de eletroporação (500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA) com ou sem 0,0025 mg/mL de PGA. As amostras foram pré-misturadas e mantidas a 4 °C na bandeja de entrada enquanto as injeções foram realizadas em intervalos de 10 minutos ao longo de várias horas. Experimentos foram realizados com a seguinte sequência: (1) lavagem com ácido fosfórico a 0,1% a 3.500 mbar por 30 segundos; (2) lavagem com tampão de ensaio a 3.500 mbar por 30 s; (3) preenchendo o capilar com analito (tampão de ensaio) a 3.500 mbar por 20 segundos; (4) injetar o indicador a 50 mbar por 10 s; (5) mobilizar e medir com analito a 400 mbar por 180 s. A formação instável do complexo foi demonstrada pela formação de grandes agregados (picos no Taylorgram) e sinal decrescente. Complexos estáveis foram identificados por Taylorgrams monodispersos bem ajustados (R)² > 0,99), e R_h os valores foram extraídos de perfis ajustados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3. Eficiência e viabilidade de eliminação alfa/beta do TCR em células T humanas primárias. (A) Estratégia representativa de citometria de fluxo para singlets vivos, subconjuntos de células T CD4⁺ e CD8⁺, e expressão de TCRα/β em condições controle (sgRNA não direcionado) e experimentais (sgRNA TRAC). As células foram indexadas sequencialmente em FSC/SSC, singlets, viabilidade e populações CD4⁺ ou CD8⁺ antes da avaliação da expressão superficial TCRα/β. (B) Esquerda: TCRα/β eficiência de eliminação em subconjuntos de células T CD4⁺ e CD8⁺ sob três condições: TRAC KO, controle sem mira (NTC) e controle fora do cartucho (OCC). CD4⁺: TRAC KO = 88,4 ± 4,9% (n = 40), NTC = 3,2 ± 4,7% (n = 24), OCC = 9,8 ± 5,1% (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89,8 ± 4,2% (n = 40), NTC = 4,2 ± 7,4% (n = 24), OCC = 20,2 ± 4,9% (n = 18). Direita: Viabilidade pós-eletroporação em todas as condições, com acesso a singlets. Viabilidade: TRAC KO = 97,1 ± 1% (n = 40), NTC = 96,8 ± 1% (n = 24), OCC = 97 ± 1% (n = 18). Os pontos de dados individuais são mostrados com média e SD. n representa execuções independentes de eletroporação em múltiplos cartuchos e dias. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4. Entrega eficiente de mRNA em HEK293T esferoides usando DMF-ection. (A) Diagrama de fluxo de trabalho que descreve o processo de formação de esferoides e realização da transfecção de esferoides. Cem células HEK293T são carregadas por poço em microplacas esferoides especializadas e cultivadas por 24 horas para formar esferoides de 100 μm de diâmetro. Esferoides (192) são descarregados e ressuspensos em 100 μL de buffer de transfecção. Essa suspensão, com carga útil apropriada, é carregada no cartucho DMF-ection guiado a 9,3 μL por família. Uma vez que a eletroporação ocorre, as amostras são descarregadas em uma placa de 96 poços para análise a jusante. (B) Esquerda: Número de esferoides descarregados por família no cartucho DMF-ection em comparação com controles de cartucho fora do cartucho pipetado manualmente. Meio: Imagem fluorescente do tri-drop, onde um quadrado vermelho maior delimita o tri-drop, e o oval vermelho circula o esferoide. Direita: Imagem fluorescente mostrando a porta de carregamento com esferoides carregados (círculos azuis). (C) Painel esquerdo: Imagens em campo claro de esferoides HEK293T intactos antes da eletroporação e imagens de fluorescência de esferoides 24 horas após a eletroporação do mRNA do EGFP , comparadas a 0 V e controles fora do cartucho. (D) Painel superior: Quantificação da intensidade média de fluorescência normalizada para a área esferoide para duas condições de eletroporação (500 V, 2 ms, 2 pulsos; 375 V, 6 ms, 1 pulso). Não há diferença significativa entre condições eletroporadas, mas todas as condições eletroporadas são significativamente diferentes de 0 V e controles fora do cartucho (500 V 2 ms 2 pulso: 6,955 × ^10-5 ± 3,502 × ^10-5, 375 V 6 ms 1 pulso: 5,045 × ^10-5 ± 3,294 × ^10-5, 0 V: 0 ± 0, controle fora do cartucho: 0 ± 0 (*p < 0,05). As imagens eram processadas usando o pacote de processamento de imagem^{FIJI 10}. (500 V, 2 ms, 2 pulsos: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 pulso: n = 4; Controle fora do cartucho: n = 3; Controle 0 V: n = 3). (D) Painel inferior: Diâmetro do esferoide após eletroporação durante 5 dias em diferentes condições. O diâmetro foi medido usando FIJI a partir de imagens de contrato de fase tiradas com ampliação de 20x com um microscópio invertido. (500 V, 2 ms, 2 pulsos: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 pulso: n = 4; Controle fora do cartucho: n = 3; Controle 0 V: n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Esse protocolo descreve um fluxo de trabalho miniaturizado de eletroporação microfluídica digital que permite a entrega intracelular eficiente em células T humanas primárias usando gotículas em escala de nanolitros. Uma vantagem central desse método é a capacidade de realizar a edição do genoma CRISPR–Cas9 usando apenas 10.000 células por reação, reduzindo drasticamente os requisitos de material em comparação com a eletroporação convencional. A arquitetura baseada em gotículas suporta automação, garantindo o manuseio reprodutível de reagentes e a montagem de reações em múltiplos sítios paralelos.

Em estudos anteriores, a comparação direta da plataforma DMF-ection em relação a um sistema amplamente utilizado demonstrou que a nucleofecção convencional produziu menos de 2% de células T GFP-positivas a 10.000 células por edição, enquanto a plataforma DMF-ection alcançou eficiência de transfecção de >90% sob as mesmas condições de baixa entrada. Para uma tela em arranjo de 192 condições, a plataforma DMF exigia 25 vezes menos células e aproximadamente 50 vezes menos Cas9 por condição do que os métodos^{convencionais 9}. Essas comparações destacam as vantagens materiais da eletroporação DMF miniaturizada para aplicações de baixa entrada e triagem

Etapas críticas e solução de problemas
Vários passos são fundamentais para o sucesso. A calibração precisa do manuseador acústico de líquidos garante a deposição precisa do RNA-guia sobre o substrato do cartucho, essencial para uma montagem consistente do RNP. Se o spotting for inconsistente ou as gotículas não aderirem ao substrato, verifique se o PGA está incluído na mistura de RNA-guia na concentração correta (final de 5 mg/mL) e que o dispensador acústico está calibrado para a geometria específica da placa fonte. Spotting inconsistente em volumes intermediários (40–120 nL) é mais comumente causado pelo rebote de gotículas na superfície hidrofóbica; aumentar levemente a concentração de PGA ou reduzir a altura do dispensador pode resolver isso.

Manter a concentração celular correta antes da carga é importante, pois desvios na densidade podem prejudicar a formação de gotículas e reduzir a eficiência da edição. Se a eficiência de edição cair abaixo de 75%, primeiro verifique se a ativação das células T foi suficiente (confirme a regulação para cima do CD25 e CD69 por citometria de fluxo antes da eletroporação) e confirme que Cas9 e sgRNA foram combinados imediatamente antes da carga, e não antecipadamente.

Aditivos poliméricos desempenham um papel importante na estabilização dos complexos Cas9–sgRNA sob as condições do tampão de^{eletroporação 11}. Embora a PGA reduza a afinidade nominal de ligação, seu efeito estabilizador melhora a reprodutibilidade e previne a agregação em volumes de nanolitros. Isso representa um parâmetro ajustável para pesquisadores que adaptam o fluxo de trabalho a outros complexos proteína–RNA.

Solução de problemas
Falha na ponte de gotículas
Revise o relatório instrumental de controle de qualidade pós-execução após cada experimento. A ausência de corrente detectada indica falha na ponte de ponte, seja por gotículas insuficientes ou falha de fusão, e é automaticamente sinalizada pelo sistema. Os locais afetados não podem ser recuperados dentro da mesma corrida. Se as falhas forem esporádicas (<10%), nenhuma ação é necessária; Distribui replicações entre múltiplos cartuchos para minimizar o impacto. Se as falhas forem sistemáticas, execute a placa de controle de qualidade e a verificação de saúde do sistema e entre em contato com o suporte técnico caso os problemas persistam.

Spotting inconsistente de sgRNA
Após a dispensação, confirme visualmente que todas as gotículas esperadas estão presentes, centralizadas dentro dos limites dos eletrodos e livres de gotículas satélite. Inclua PGA na mistura de RNA guia para evitar a polidispersão. Para gotículas ausentes, verifique o relatório de funcionamento do dispensador e redistribua se necessário. Para formação pobre do menisco, mantenha no mínimo 5 μL por poço, gire a placa brevemente e bata suavemente em uma superfície plana. Trabalhe no gelo e fele as placas quando não estiverem em uso para evitar evaporação.

Eficiência de edição reduzida
Se for observada redução na eficiência de edição, faça a solução de problemas na seguinte ordem: (1) valide as condições de entrega usando o mRNA P do EGFantes de prosseguir com o RNP; (2) confirmar que a corrente de controle de qualidade medida corresponde aos valores esperados; (3) densidade celular de titulação, RNA guia e concentração de Cas9; (4) confirmar alta viabilidade das células imediatamente antes do carregamento; (5) verificar a integridade do reagente e as condições de armazenamento; (6) confirmar que o método de leitura é apropriado para a densidade celular e o alvo de interesse.

Adaptando a plataforma para tipos e modelos celulares alternativos
Para outros tipos primários de células imunológicas, como células NK ou células T reguladoras, os parâmetros de eletroporação exigirão otimização. O tamanho da célula é um determinante importante do limiar do campo elétrico necessário para a permeabilização de membrana: células menores exigem intensidades de campo maiores, enquanto células maiores são permeabilizadas em tensões mais baixas — uma relação bem documentada na biofísica da eletroporação. Como ponto de partida para tipos de células menores que células CD3⁺ ativadas, mantenha ou aumente levemente a tensão (500–550 V) enquanto mantenha a duração do pulso curta (2–3 ms) para evitar estresse térmico excessivo. Para células maiores, reduza a tensão para 350–400 V e module a duração do pulso sem exceder 10 ms. Além disso, a microotimização no nível do doador é prática comum na eletroporação, e parâmetros validados em células doadoras saudáveis podem não se traduzir diretamente para material doente ou derivado do paciente. Células de doadores com malignidades hematológicas, infecção crônica ou imunodeficiência frequentemente apresentam propriedades biofísicas alteradas, e a eficiência e viabilidade da edição devem ser reavaliadas para cada novo doador, especialmente ao trabalhar com amostras não saudáveis ou clínicas. A viabilidade celular deve ser avaliada em 24 e 72 horas após a eletroporação, com parâmetros ajustados iterativamente. A dosagem de Cas9 também pode precisar ser aumentada em 1,5–2× em relação ao protocolo de células T se a eficiência de entrega RNP for reduzida.

Para modelos 3D maiores ou mais densos, como organoides com diâmetro superior a 200 μm, a junta do cartucho pode exigir modificações para acomodar o aumento do tamanho da estrutura e barreiras de difusão. Usuários que tentam tais aplicações devem considerar pré-dissociar camadas celulares externas para melhorar a penetração do reagente ou aplicar múltiplas condições de pulso em sequência. Entre em contato com o autor correspondente para orientações sobre a adaptação da geometria das gotículas e parâmetros de pulso para estruturas além do diâmetro esferoide de 100 μm validado aqui.

Relevância translacional
O potencial translacional desse fluxo de trabalho vai além do simples knockout. A plataforma foi aplicada ao knock-in de reparo dirigido por homologia de um construto GFP de 4 kb e um CAR anti-HER2 funcional no locus TRAC em células T primárias, bem como a uma tela CRISPR com 45 alvos identificando novos reguladores do exaustão das células T^{CD4⁺ 9}. Essas aplicações ilustram um caminho desde a otimização em nível de protocolo até a descoberta funcional em modelos celulares primários clinicamente relevantes. No entanto, limitações importantes permanecem: desfechos funcionais como taxas de interrupção alélica por sequenciamento, secreção de citocinas e enfratimento in vivo não foram avaliados no protocolo atual e representam os próximos passos necessários para a tradução terapêutica. Além disso, embora a plataforma suporte 48 reações paralelas por cartucho, será necessária paralelização múltiplos cartuchos para telas maiores.

Limitações
Como em qualquer plataforma miniaturizada, certas limitações práticas devem ser reconhecidas. A fenotipagem a jusante deve ser adaptada à pequena escala de reação; A aquisição da citometria de fluxo pode exigir etapas adicionais de concentração ou agrupamento de poços replicados para alcançar contagens suficientes de eventos. As configurações de eletroporação da plataforma também podem exigir otimização para tipos de células com alta sensibilidade a campos elétricos, e os usuários devem tratar os parâmetros publicados como pontos de partida, em vez de valores universalmente fixos. Por fim, a coloração formal de viabilidade em pontos de tempo pós-eletroporação estendidos não foi realizada para o fluxo de trabalho esferoide apresentado aqui; O rastreamento de crescimento baseado no diâmetro foi usado como uma medida substituta da integridade estrutural e representa uma direção importante para futuras caracterizações.

No geral, a DMF-ection, um método de transfecção não viral, oferece uma abordagem poderosa e flexível para edição do genoma e entrega de mRNA em ambientes de baixa entrada e alta produtividade. Sua compatibilidade com células T primárias, modelos 3D estruturados e manuseio automatizado de líquidos amplia as oportunidades em engenharia de terapia celular, triagem multi-condição CRISPR e genômica funcional miniaturizada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentação
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Protocolo de esferoides
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Protocolo de esferoides
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 em 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentação
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Cultura de esferoides
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfecção
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentação
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentação
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Cultura de esferoides
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentação
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Protocolo de esferoides
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	Suplemento de mídia para células T
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Sangue periférico, criopreservado, células T Helper pan CD3+, negativamente selecionadas
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	Mídia de ativação de células T
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	Mídia de ativação de células T
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentação
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentação
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 em 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 em 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Cultura de esferoides
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Protocolo de esferoides
Surfactant F	DropGenie		Transfecção- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Protocolo de esferoides