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Artigo de método

Um método de fotometria de fibra bicolorida para registrar a atividade dos neurônios dos astrócitos em múltiplas regiões cerebrais durante comportamentos de aprendizagem e memória

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DOI:

10.3791/70582

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28 de abril de 2026

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1Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine/Advanced Institute for Brain and Intelligence, School of Medicine, Guangxi University, 2Brain Research Center and State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Third Military Medical University, 3Department of Neurology, Gansu Provincial Central Hospital

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo fornece uma descrição abrangente de um método para o registro simultâneo de sinais de cálcio de neurônios e astrócitos em múltiplas regiões cerebrais relacionadas à memória e demonstra sua aplicação durante um paradigma de aprendizagem e comportamento da memória.

Resumo

O aprendizado e a memória dependem criticamente da coordenação entre neurônios e astrócitos em regiões cerebrais distribuídas. Os astrócitos modulam a transmissão sináptica e a excitabilidade neuronal, contribuindo assim para a codificação e consolidação de informações dentro dos circuitos relacionados à memória. As correlações intra e inter-regionais entre astrócitos e neurônios são cruciais para entender a memória e os distúrbios cognitivos. No entanto, o monitoramento simultâneo da atividade astrocítica e neuronal em múltiplas regiões durante o comportamento da memória continua sendo tecnicamente desafiador. Aqui, é apresentado um método que facilita o registro concomitante desses sinais de cálcio de astrócitos e neurônios em várias regiões relacionadas à memória. Essa estratégia combina indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs) específicos de tipo celular, um sistema de fotometria de fibra multicanal e acompanhamento comportamental sincronizado para alcançar o monitoramento em tempo real da atividade neuronal e astrocítica no córtex pré-frontal medial (mPFC), região CA1 do hipocampo e córtex entorhinal medial (MEC). Resultados representativos demonstram dinâmica coordenada do cálcio entre regiões e tipos celulares durante a tarefa de reconhecimento de objetos. Esse método fornece uma estrutura experimental reproduzível e eficiente para investigar as interações astrócito-neurônio subjacentes aos processos de aprendizagem e memória.

Introdução

Aprendizagem e memória são processos cognitivos fundamentais que envolvem adquirir, armazenar e recuperar informações, cruciais para a formação de comportamentos adaptativos. Esses processos sustentam uma variedade de funções complexas, como navegação espacial, reconhecimento de objetos, associação contextual e tomada de decisões. Além disso, doenças disfuncionais cognitivas, incluindo Alzheimer, doenças cognitivas relacionadas à idade e lesão cerebral traumática, apresentam anormalidades na formação damemória 1,2,3. Portanto, uma compreensão abrangente da base neural da aprendizagem e da memória exige elucidar a interação dinâmica entre diferentes tipos celulares. Essa interação ocorre dentro e entre essas regiões durante a codificação e recuperação da informação.

Tradicionalmente, acreditava-se que a formação da memória era predominantemente determinada pela atividade neuronal. No entanto, pesquisas extensas demonstraram que os astrócitos regulam significativamente a codificação, consolidação e recuperação da informação. Eles conseguem isso modulando a transmissão sináptica, regulando a excitabilidade neuronal, liberando gliotransmissores e fornecendo suporte metabólico 4,5,6,7,8. Os astrócitos interagem dinamicamente com os neurônios, e a comunicação bidirecional é coletivamente chamada de "rede astrócito-neurônio"9,10,11. Portanto, compreender as interações coordenadas entre astrócitos e neurônios é crucial para compreender os mecanismos celulares e de rede de aprendizagem e memória.

Aprendizagem e memória dependem da integração dinâmica de informações em múltiplas regiões cerebrais. As interações entre astrócitos e neurônios não se limitam a microcircuitos locais, mas se estendem por regiões cerebrais distribuídas implicadas na memória, incluindo o córtex pré-frontal medial (mPFC), a região CA1 do hipocampo e o córtex entorinal medial (MEC). A mPFC tem sido implicada na consolidação da memória e na regulação da memória de longo prazo; CA1 é central para a codificação e reativação episódica da memória; e o MEC serve como um centro para integração de informações espaciais e multimodais, fornecendo entradas essenciais para o circuito hipocampo-cortical 12,13,14,15,16. Evidências acumuladas sugerem que os astrócitos nessas regiões participam de dinâmicas coordenadas entre regiões com neurônios, desempenhando papéis-chave no fluxo de informação e nas transições de estado durante o aprendizado e a memória17,18.

Embora o reconhecimento da função sinérgica de astrócitos e neurônios no processamento da memória tenha aumentado, um desafio técnico significativo permanece em monitorar simultaneamente a atividade do cálcio tanto em astrócitos quanto em neurônios em múltiplas regiões cerebrais associadas à memória durante o comportamento de animais em movimento livre. A imagem de dois fótons oferece alta resolução espacial, mas é limitada pela profundidade e fixação da cabeça19,20; a eletrofisiologia multicanal permite registros de alta resolução temporal, mas carece de especificidade de tipo celular e não consegue distinguir sinais de cálcio astrocíticos. Assim, foi desenvolvido um método que permite o registro simultâneo de sinais de cálcio astrocítico e neuronal em múltiplas regiões cerebrais relacionadas à memória em camundongos em movimento livre. Indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs) relatam mudanças conformacionais intracelulares dependentes de Ca2+ a Ca 2+ em CaM/M13 que modulam a fluorescência dos fluoróforos geneticamente codificados. Abordagens GECI de dupla cor utilizam indicadores espectralmente separáveis, como sensores de cálcio verde e vermelho, juntamente com promotores específicos de tipo celular para permitir o registro simultâneo da atividade de Ca2+ astrocítica e neuronal dentro da mesma região cerebral. Ao combinar GECIs de dupla cor específicos para tipo celular (GCaMP6f e jRGECO1a) e um sistema de fotometria de fibras multicanal, foi alcançado o monitoramento em tempo real da atividade de cálcio em neurônios e astrócitos em mPFC, CA1 e MEC. Além disso, tomando como exemplo a nova tarefa de reconhecimento de objetos (NOR), foi demonstrada a dinâmica coordenada do cálcio entre regiões e tipos celulares do cérebro em tarefas de aprendizagem. Esse método é um protocolo reproduzível, confiável e escalável para investigar a atividade do conjunto de neurônios e astrócitos em regiões cerebrais durante o aprendizado e a memória.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Terceira Universidade Médica Militar (Aprovação de Ética Animal nº: AMUWEC20230126) e foram realizados de acordo com o Guia da Terceira Universidade Médica Militar para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, garantindo o tratamento ético dos animais. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

Para garantir a segurança do experimentador, todos os procedimentos experimentais envolvendo animais vivos e vetores virais foram realizados usando roupas de proteção, luvas estéreis e máscara. Todos os instrumentos foram completamente esterilizados antes do uso, e superfícies experimentais foram limpas com etanol a 70% antes e depois de cada experimento. Os materiais restantes foram descartados de acordo com as regulamentações institucionais de descarte de resíduos. Todos os reagentes e equipamentos eram manuseados para evitar contato direto com pele ou olhos.

1. Preparação de animais e manuseio viral

  1. Camundongos C57BL/6 de 4 meses (ambos os sexos) em um ciclo de 12 horas claro/escuro com acesso ad libitum a comida e água.
  2. Descongelar aliquotas de AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f ou AAV9-hSyn-jRGECO1a no gelo a 0–4 °C imediatamente antes do uso.
  3. Conecte uma micropipeta de vidro puxado (diâmetro da ponta 15–25 μm) a uma seringa e monte-a em uma bomba de microinjeção.
  4. Coloque o rato em uma plataforma cirúrgica estéril e desinfete todos os instrumentos com 70% de etanol.

2. Injeção viral estereotáxica

NOTA: Uma estratégia de injeção viral em duas etapas foi utilizada neste estudo. Sob as condições experimentais atuais, essa estratégia pode ser implementada de forma confiável e estável, e o padrão de expressão resultante é consistente com o perfil esperado de promotor específico para o tipo celular.

  1. Primeira cirurgia: AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f (Título: 7 ×10 12 vg/mL) para astrócitos
    1. Induza anestesia com 3% de isoflurano em uma câmara, depois mantenha a anestesia com 0,8%–1,2% de isoflurano via cone nasal (seguindo protocolos institucionalmente aprovados).
    2. Mantenha a temperatura corporal entre 37–38 °C usando uma bolsa térmica e aplique pomada oftálmica para evitar a dessecação da córnea.
    3. Remova os pelos do couro cabeludo e desinfete bem a pele. Faça uma incisão na linha média para revelar a superfície do crânio.
    4. Coloque a cabeça no instrumento estereotáxico, ajuste os pontos bregma e lambda para o mesmo plano horizontal e ajuste ainda mais a estrutura para garantir que os pontos laterais de 2 mm em relação ao bregma em ambos os lados fiquem nivelados.
    5. Identifique coordenadas estereotáxicas usando um atlas cerebral de camundongo, tendo o bregma como ponto de referência.
      mPFC: AP +1,8 mm, ML +0,3 mm, DV −3,0 mm
      CA1: AP −2,1 mm, ML +1,6 mm, DV −1,2 mm
      MEC: AP −4,5 mm, ML −2,9 mm, DV −2,0 mm
    6. Fure uma craniotomia circular de 0,6 mm (diâmetro) acima de cada local, mantenha a dura-máter úmida e intacta após abrir o crânio.
    7. Encha o vírus GCaMP6f na seringa a 5 nL/s e instale a seringa no braço estereotáxico.
    8. Abaixe a pipeta devagar, injete 150 nL a 0,6 nL/s, segure por 8 minutos e depois retire a 0,1 mm/s. Repita esse procedimento para todas as regiões.
    9. Fele a incisão com adesivo de tecido e deixe 2 semanas para a expressão viral.
  2. Cirurgia secundária: injeção de neurônios AAV9-hSyn-jRGECO1a (Título: 1 × 1013 vg/mL).
    NOTA: A cirurgia foi realizada 14 dias após a primeira injeção do vírus.
    1. Induzir e manter a anestesia conforme descrito acima (Passo 2.1.1).
    2. Mantenha a temperatura corporal e proteja os olhos.
    3. Reabra o couro cabeludo ao longo da linha média e nivele o crânio.
      NOTA: O crânio foi nivelado alinhando o bregma e o lambda no mesmo plano horizontal.
    4. Detritos de tecido transparentes nos mesmos locais das janelas de craniotomia da primeira cirurgia, expondo a dura-máter intacta.
    5. Ajuste as coordenadas usando bregma como ponto de referência, realize injeções estritamente nas mesmas coordenadas e profundidades descritas anteriormente.
    6. Preencha o vírus jRGECO1a a 5 nL/s e instale a seringa.
    7. Injete 150 nL a 0,6 nL/s, mantenha por 8 minutos e retire lentamente. Repita esse procedimento para todas as regiões e permita 3 semanas para a expressão viral.

3. Implantação de sonda de fotometria de fibra multi-site

NOTA: Realize imediatamente após a injeção de jRGECO1a.

  1. Instale a virula de fibra óptica em um suporte estereotáxico.
  2. Posicione a fibra (1,25 mm de ferrulha, núcleo de 200 μm, NA 0,39) 100–150 μm acima da profundidade de injeção viral:
    mPFC: AP +1,8 mm, ML +0,3 mm, DV −2,9 mm
    CA1: AP −2,1 mm, ML +1,6 mm, DV −1,1 mm
    MEC: AP −4,5 mm, ML −2,9 mm, DV −1,9 mm
  3. Sele a craniotomia com adesivo de tecido e fixe a virula com cimento dentário.

4. Gravação de fotometria de fibra multicanal

NOTA: Para garantir a estabilidade e expressão completa dos dois indicadores de cálcio, foi realizada fotometria de fibra óptica multicanal três semanas após a segunda injeção do vírus para registro.

  1. Habitue os camundongos ao sistema de fibras e faça a arena uma vez por dia durante três dias.
    1. Após 3 semanas de expressão viral, anestesie brevemente o camundongo com isoflurano a 3%.
    2. Conecte uma extremidade da fibra óptica agrupada ao sistema de aquisição de fotometria da fibra.
    3. Ajuste a luz de excitação para dois comprimentos de onda: 470 nm e 560 nm.
    4. Defina a frequência de aquisição para 30 Hz.
    5. Conecte os três ramos na outra extremidade da fibra agrupada a três regiões cerebrais: Canal 1 para mPFC, Canal 2 para CA1, Canal 3 para MEC.
    6. Coloque os camundongos em uma área aberta com um comprimento lateral de 50 cm e permita a exploração livre.
    7. Após 10 minutos, desconecte a fibra e leve os ratos de volta para suas gaiolas em casa.
  2. Gravação de fotometria de fibra durante a Tarefa de Reconhecimento de Objetos Inovadores
    NOTA: Limpe a plataforma e os objetos com etanol 75% antes de cada teste.
    1. Coloque dois objetos idênticos em quadrantes diagonalmente opostos.
    2. Conecte o feixe de fibras em um estado levemente anestesiado.
    3. Deixe os ratos explorarem objetos por 10 minutos e depois devolva-os às gaiolas sem remover a fibra.
    4. Realize gravação de fotometria de fibras durante o novo teste de reconhecimento de objetos em camundongos.
      NOTA: Exclua o julgamento se artefatos de movimento forem excessivos para dados de registro estáveis.
      1. Ajuste os lasers de estimulação:
        470 nm para GCaMP6f (astrócitos)
        560 nm para jRGECO1a (neurônios)
      2. Grave sinais de cálcio a 30 Hz, sincronizados com o rastreamento de vídeo a 30 Hz. Posicione um diodo laser dentro do quadro de vídeo (fora do campo visual do mouse) ao iniciar a aquisição para servir como marcador temporal.
      3. Dez minutos após a fase de aprendizado, substitua um objeto por um novo e coloque o mouse de volta por 10 minutos de exploração enquanto grava.
      4. Desconecte a fibra com uma virula cerâmica e traga os ratos de volta para as gaiolas de casa.

5. Processamento e análise de dados

NOTA: Classifique um transitório de Ca2⁺ em gravações de fotometria de fibra como um sinal genuíno somente se sua amplitude exceder três vezes o desvio padrão da bandade ruído 21,22,23. Protocolo24:D efine do Teste de Reconhecimento de Objetos (NORT) como eventos em que camundongos fazem contato físico com o objeto, seja cutucando-o ou cheirando-o com o nariz. Para quantificação do sinal, defina a linha de base como o sinal médio durante a janela de -2 a -1 s (em relação ao início da interação em t=0). Defina a janela de análise peri-evento para que vá de 2 s antes até 4 s após o início de cada interação com o objeto, seguindo protocolos estabelecidos.

  1. Importar traços de fluorescência para o software de análise.
    NOTA: O processamento de sinais de fluorescência foi realizado usando software de análise proprietário, seguindo fluxos de trabalho padrão de fotometria de fibra. O software em si não é de código aberto e não pode ser compartilhado. Para considerações metodológicas gerais sobre processamento de sinais de fotometria de fibra, veja os relatórios metodológicosrecentes 25.
  2. Realize a correção de linha de base e alinhe os sinais de cálcio ao início da tarefa NOR usando vídeo sincronizado.
  3. Converter ΔF/F para escores Z para comparações inter-regionais e de dupla cor9:
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    NOTA:
    (ΔF/F)média: média de ΔF/F.
    (ΔF/F)Padrão: desvio padrão de ΔF/F.
    F raw: intensidade de fluorescência bruta.
    Linha de base F: intensidade de fluorescência de base (média sobre o período de base predefinido).
  4. Quantifique métricas como área sob a curva (AUC) para as respostas de astrócitos e cálcio neuronal durante a exploração de objetos novos versus familiares.

6. Verificação histológica após registro

  1. Anestesie o camundongo com uma overdose de pentobarbital até que a perda completa dos reflexos seja confirmada.
  2. Realize perfusão transcárdica com soro fisiológico normal, seguida de 4% de paraformaldeído (PFA).
  3. Dissecar o cérebro cuidadosamente e fixá-lo em 4% de PFA a 4 °C por 12–24 horas.
  4. Transfira o cérebro para 30% de sacarose em PBS a 4 °C até que o tecido afunde para crioproteção.
  5. Imerga o cérebro em um composto de temperatura de corte ideal, congele-o e corte as seções coronais (40 μm de espessura) usando um criostato.
  6. Realize coloração por imunofluorescência para verificar a expressão viral e a colocação das fibras.

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Resultados

Com base no protocolo descrito acima, foi realizada uma gravação de fibra multi-local em duas cores, direcionada ao mPFC, CA1 e MEC de camundongos C57 de 4 meses de idade. No presente estudo, implementamos uma estratégia de injeção viral em duas etapas para introduzir sequencialmente os dois indicadores. Sob nossas condições experimentais, essa estratégia pode ser implementada de forma confiável e estável, e o padrão de expressão resultante é consistente com o perfil esperado de promotor...

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Discussão

Neste estudo, foi desenvolvido um método para o registro simultâneo da atividade calcinal astrocítica e neuronal em múltiplas áreas cerebrais relevantes para a memória de camundongos durante comportamentos de aprendizagem e relacionados à memória. Diferente da imagem de regiãoúnica 28 ou das técnicas eletrofisiológicas, a gravação síncrona multi-região captura dinâmicas coordenadas através de redes de memória distribuída, provando assim ser uma ferramenta poderosa...

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Divulgações

Nenhum conflito de interesse, financeiro ou de outra natureza, é declarado pelos autores.

Agradecimentos

A Sra. Jia Lou é reconhecida por sua assistência técnica, e a Sai Te Xin Si (ferramenta de IA) é reconhecida por sua assistência na edição de idiomas. Esse trabalho recebeu apoio da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (bolsa nº 82371485, 82588301, 32400932) e da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing, China (bolsa nº CSTB2024NSCQ-JQX0024, 2024NSCQ-MSX1104).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
75 RN 5uL SYR W/O NEEDLEHamilton7634-01Conecta-se à micropipeta para injeção viral
AAV5-GfaABC1D-GCaMP6fAddgene52925Expressão de GCaMP6f específica de astrócitos
AAV9-hSyn-NES-jRGECO1aAddgene100854Indicador de cálcio neuroespecífico com deslocamento para vermelho
Bepanthen Eye and Nasal OintmentBepanthenMA0008Previne a secagem da córnea
Bundled optical fibers with ceramic sleevesInperBFO-1x3-W1.25Conecta as fibras implantadas ao sistema de fotometria
CameraMind VisionMV-SUA502C-TVídeos comportamentais sincronizados com sinais de cálcio
Dental cementNISSINSuper-Bond C&BUsado para fixar ferrules no crânio
Ferrule holderInperSCH-1.25Mantém a ferrule cerâmica firmemente durante a implantação
Isoflurane vaporizer & Anesthesia systemRWD Life ScienceR510-29Para indução e manutenção da anestesia
Multi-channel fiber photometry systemRWD Life ScienceR821Para gravação de duas cores
OFRS softwareRWD Life ScienceAnalisa sinais de cálcio registrados
Optical fibersRWD Life ScienceR-FOC-BL200C-39NImplantadas na região cerebral alvo
Stereotaxic instrumentRWD Life Science68801Usado para injeção viral precisa e implantação de fibras
Syringe pumpKD Scientific788130Fornece vírus em taxas controladas
Tissue glue3M Animal Care Products1469SB VetbondPara fechamento de incisões

Referências

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