Artigo de método

Detecção de Senescência usando luz refletida na fração vascular estromal adiposa

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DOI:

10.3791/70588

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5 de junho de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta microscopia confocal com luz refletida para a detecção objetiva, por célula única, da atividade beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) na fração vascular estromal isolada do tecido adiposo humano. O método é compatível com imunocitoquímica, incorpora controles de pH para avaliação quantitativa e, adicionalmente, oferece uma alternativa mais sensível e menos subjetiva à coloração convencional de SA-β-gal.

Resumo

A senescência celular é um estado induzido pelo estresse caracterizado por paralisação permanente do ciclo celular e pelo desenvolvimento de um perfil secretor distinto que impacta a função dos tecidos e contribui para o envelhecimento e doenças metabólicas. A atividade de β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) é amplamente utilizada como marcador de células senescentes; no entanto, ensaios convencionais SA-β-gal frequentemente dependem de avaliação visual subjetiva e fornecem informações quantitativas limitadas. Essas limitações são particularmente evidentes em populações celulares humanas primárias, como a fração vascular estromal (SVF) derivada do tecido adiposo, que contém uma mistura heterogênea de preadipócitos, células imunes e células endoteliais. Aqui, apresentamos uma abordagem otimizada de microscopia confocal com luz refletida para a detecção quantitativa e de alta resolução da atividade de SA-β-gal em células SVF humanas. Esse protocolo permite a análise objetiva de célula única da atividade SA-β-gal, possibilita imunocitoquímica simultânea para detecção multiplexada de marcadores adicionais de senescência ou linhagem, e incorpora controles com pH correspondente. Ao combinar essas características, esse método oferece uma abordagem sensível, reprodutível e quantitativa para estudar a senescência celular em populações celulares primárias heterogêneas. Ele oferece uma alternativa aprimorada à coloração convencional de SA-β galões.

Introdução

A senescência celular é uma resposta multifacetada que pode surgir de vários tipos de estresse, incluindo danos ao DNA, atrito de telômeros e ativação de oncogênios. Ela leva a uma parada estável do ciclo celular juntamente com aumento da resistência à apoptose, impulsionada em parte pela indução de proteínas antiapoptóticas 1,2. A senescência tem sido associada à melhora da sobrevivência celular em contextos onde a preservação da integridade dos tecidos é essencial, como reparo e manutenção 3,4. Além de seu papel na homeostase tecidual, a senescência também contribui para o desenvolvimento normal ao moldar o padrão embrionário 5,6 e como barreira à formação tumoral ao promover a eliminação de células danificadas ou potencialmentemalignas 7,8,9. Embora a senescência possa desempenhar funções benéficas, vários estudos destacaram um aspecto contrastante no qual as células senescentes adquirem um perfil secretor pró-inflamatório que pode perturbar o metabolismo local, danificar o tecido ao redor e até apoiar a progressãotumoral 10,11,12,13.

A senescência foi detectada em diversos tipos celulares em múltiplos tecidos e frequentemente está associada ao envelhecimento, doenças, disfunção tecidular ou câncer. No fígado, a senescência das células estreladas hepáticas demonstrou promover a progressão tumoral ao alterar a homeostase metabólica por meio de fatoressecretados 14,15. Estudos que examinamhepatócitos 16 ou biópsias hepáticas17 indicam que a senescência nessas células pode contribuir para comorbidades metabólicas, como doença esteatótica associada à disfunção metabólica do fígado e esteatopatite associada à disfunção. Além disso, a relação entre diabetes tipo 2 e senescência ganhou atenção significativa na última década, com evidências ligando a senescência a complicações relacionadas ao diabetes em células β pancreáticas,hepatócitos 16 eadipócitos 18,19,20,21. Esses achados destacam a importância de identificar com precisão as células senescentes nos tecidos metabólicos, onde seu acúmulo e heterogeneidade contribuem para a progressão da doença e para o direcionamentoterapêutico 22.

As mudanças de sinalização e expressão proteica associadas à senescência são frequentemente específicas para células e tecidos; no entanto, várias características são amplamente características das células senescentes. Um dos marcadores mais amplamente utilizados é o aumento da atividade enzimática da β-galactosidase no pH 6,0, referida como β-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal)23. β-galactosidase é uma hidrolase lisossômica presente em todas as células e normalmente ativa no pH ácido (~4,5–5,0), onde contribui para a degradação de substratos glicosilados. A característica definidora da SA-β-gal é a retenção da atividade da β-galactosidase sob condições de pH subótimas. No ensaio clássico, as células são incubadas com o substrato sintético 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactopiranósido (X-gal) no pH 6,0, onde a atividade enzimática é reduzida na maioria das células, mas permanece detectável nas células senescentes. Isso leva à formação de um precipitado azul insolúvel que pode ser visualizadomicroscopicamente como 24.

Embora esse ensaio tenha sido amplamente adotado, a detecção do precipitado X-gal tradicionalmente dependia da microscopia de campo claro. A detecção em campo claro depende da identificação visual do precipitado azul e, portanto, possui sensibilidade limitada para sinais de baixo nível e estados de senescência precoce. Em contraste, a imagem por luz refletida captura a densidade óptica do precipitado X-gal, permitindo a detecção quantitativa em uma faixa dinâmica mais ampla. Mais recentemente, substratos fluorogênicos foram desenvolvidos para melhorar a sensibilidade25. No entanto, essas abordagens tipicamente medem a atividade da β-galactosidase em condições que não preservam a definição clássica dependente do pH de SA-β-gal. Como resultado, podem aumentar a intensidade do sinal, mas reduzir a especificidade para a senescência. Em contraste, a opacidade inerente do precipitado X-gal permite sua detecção usando imagens confocais de luz refletida, proporcionando uma leitura mais sensível e quantitativa, mantendo a definição enzimática original de SA-β-gal26.

Ao longo dos anos, outras marcas da senescência foram identificadas, incluindo aumento da expressão dos inibidores de quinases dependentes de ciclina P16 e P21, bem como o fator de transcrição P53, que regula a parada do ciclo celular e outros programasde senescência 27,28,29,30,31,32,33. Esses avanços levaram a uma definição mais robusta de senescência, na qual as células são tipicamente classificadas com base na presença combinada de múltiplos marcadores. Na prática, porém, esses marcadores são frequentemente medidos usando diferentes modalidades: marcadores nucleares, como P16 e P21, são tipicamente detectados por técnicas baseadas em fluorescência, enquanto a atividade SA-β-gal tradicionalmente é avaliada por microscopia de campo claro. Essa separação limitou a capacidade de avaliar múltiplas características de senescência dentro da mesma célula. A imagem com luz refletida supera essa limitação ao permitir a integração direta da detecção de SA-β-gal com marcadores baseados em fluorescência dentro de um único fluxo de trabalho de imagem, facilitando uma avaliação mais robusta e biologicamente significativa da senescência em populações celulares heterogêneas.

Embora Dedic e colegas abordem várias limitações da imagem tradicional SA-β-gal, incluindo maior sensibilidade, uso de controles com pH correspondente para limiar objetivo e compatibilidade com imunocitoquímica, seu método confocal de luz refletida foi otimizado especificamente para adipócitos madurosisolados 26. No entanto, a senescência no tecido adiposo não se restringe aosadipócitos 34,35, e informações adicionais podem ser obtidas examinando a fração vascular estromal (SVF). A SVF compreende pré-adipócitos, populações endoteliais e fibroblasticas, e diversas células imunológicas, todas as quais podem sofrer senescência e contribuir para a remodelação adiposa, inflamação e alteração da sinalização metabólica. Caracterizar a senescência dentro desse compartimento heterogêneo é, portanto, importante para ligar processos específicos do tipo celular a resultados em nível tecidular e sistêmicos.

Aqui, estendemos a detecção de SA-β-gal refletida para células SVF, possibilitando sua aplicação em múltiplos tipos celulares de tecido adiposo. Ao combinar essa abordagem com imunocitoquímica, o método possibilita a análise integrada de célula única da atividade SA-β-gal juntamente com linhagem e marcadores funcionais em amostras humanas primárias.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com os estatutos da Declaração de Helsinque. O estudo foi aprovado pelo comitê regional de ética em Estocolmo, DNR 2012/50-31.

1. Preparação da célula

  1. Use células da fração vascular estromal (SVF) isoladas do tecido adiposo humano por digestão de colagênase.
    NOTA: O rendimento celular varia dependendo do tamanho da biópsia e da composição do tecido; no entanto, aproximadamente 1,0 × 106 células SVF são tipicamente obtidas por cada 10 g de tecido adiposo.

2. Coloração X-gal e preparações de lâminas

  1. Fixe as células em 1 mL de paraformaldeído (PFA) a 2% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por 20 minutos em temperatura ambiente (RT) em um balancí.
  2. Centrifuge a 600 × g por 10 minutos e remova o sobrenadante.
  3. Prepare a solução de coloração X-gal usando o kit de coloração senescência β-Galactosidase, conforme as instruções do fabricante.
  4. Divida a solução de coloração em 3 tubos (1 mL cada) e ajuste o pH para 5, 6 e 8 com 1 M HCl e 1 M NaOH. Meça o pH usando um medidor calibrado.
  5. Adicione a solução X-gal a 0,5 × 106 células para condição e incube por 24 horas a 37 °C sem CO2.
  6. Centrifuge a 600 × g por 10 minutos e remova o sobrenadante.
  7. Lave as células com PBS (pH 7), centrifuge a 600 × g por 10 minutos e remova o sobrenadante.
  8. Prepare solução primária de anticorpos (CD31 [1:200] ou controle IgG [1:333]) em soro de burro normal (NDS) com 5%. Incube as células durante a noite a 4 °C.
  9. Lave as células 3 vezes em PBST (0,1%) por 10 minutos em RT em um balanço.
  10. Prepare solução secundária de anticorpos (anti-camundongo Alexa Fluor 555 [1:500]) e aglutinina do germe de trigo (WGA [1:200]) em 5% de NDS. Incubar por 1 hora no RT em um balanço.
  11. Centrifuge a 600 × g por 10 minutos e remova a solução secundária de anticorpos para manchar.
  12. Lave as células 3 vezes em PBST (0,1%) por 10 minutos em um balancim no RT.
  13. Centrifuge a 600 × g por 10 minutos e remova o sobrenadante.
  14. Resuspenda as células no antifade.
  15. Pipete a suspensão celular em lâminas de microscópio.
  16. Deixe o meio de montagem curar durante a noite na RT para imobilizar as células.
  17. Adicione 100 μL de glicerol 100%, coloque uma capa de cobertura por cima e fele com esmalte.

3. Microscopia

NOTA: Células de imagem usando um microscópio confocal configuradas para detecção de luz refletida. O sinal de luz refletida deve ser coletado no comprimento de onda da excitação ou próximo ao seu comprimento usando um divisor de feixe fornecido pelo fabricante ou configuração de espelho dicróico. Use uma meta de 30× com óleo de silicone (abertura numérica 1,05) para todos os experimentos.

  1. Selecione a configuração do divisor de feixe T90/R10 no software do microscópio.
  2. Use excitação de 633 nm e colete luz refletida entre 635–645 nm.
  3. Adquira sinal Hoechst usando excitação de 405 nm.
  4. Adquira sinal WGA usando excitação de 488 nm.
  5. Adquira o sinal CD31 usando excitação de 555 nm.
  6. Defina o tamanho do passo Z para o ótimo do sistema (0,74 μm) e defina uma pilha Z baseada no sinal de membrana para capturar o volume total da célula.
  7. Adquira imagens usando configurações idênticas de aquisição para todas as amostras. Salve arquivos no formato nativo do microscópio (por exemplo, .oir) sem compressão.

4. Análise de imagens

NOTA: Analise imagens usando ImageJ e CellProfiler.

  1. Dividir canais no ImageJ para gerar Z-stacks para cada canal (405, 488, 555, 633).
  2. Gerar projeções de intensidade somada usando a função Z Project e exportar como arquivos TIFF de 16 bits.
  3. Importar imagens para o CellProfiler (versão 4.2.8) para segmentação automatizada de células e quantificação da intensidade da luz refletida por célula (Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2).
  4. Exporte as medições de intensidade para uma planilha para análise a jusante.

5. Pontuação SA-β-gal

  1. Defina o limiar para positividade SA-β-gal como a intensidade média da luz refletida da condição de pH 8 mais três desvios padrão.
  2. Classifique células na condição de pH 6 com valores de intensidade acima desse limiar como SA-β-gal positivos.

Resultados

A coloração refletida SA-β-gal em células SVF humanas produziu padrões claros e reprodutíveis nas três condições controladas por pH. A coloração CD31 foi incluída para identificar células endoteliais dentro da SVF, permitindo que essas células fossem distintas de outras populações. Embora apenas um pequeno número de células CD31-positivas estivesse presente, o marcador confirmou a presença de células endoteliais e demonstrou a compatibilidade do método com amostras primárias heterogêneas.

A condição de pH 5 gerou um sinal forte na maioria das células, consistente com alta atividade endógena de beta galactosidase em pH ácido (Figura 1Aa–Ac). No pH 6, condição usada para avaliar a atividade SA-β-gal, a intensidade da coloração foi reduzida em comparação ao pH 5, e apenas um subconjunto de células apresentou sinal acima do fundo (Figura 1Ba–Bc). Essa mudança tanto na intensidade quanto na frequência do sinal é consistente com a dependência esperada do pH do ensaio e permite a identificação de células com atividade retida de SA-β-galactosidase sob condições subótimas. A condição de pH 8 produziu sinal de luz refletida mínimo, com a maioria das células próximas ou em níveis de fundo (Figura 1Ca–Cc). Essa condição foi usada para definir o limiar para positividade SA-β-gal, indicado pela linha vermelha pontilhada na Figura 1A c,Bc,Cc.

Para análise quantitativa, o limiar para atividade SA-β-gal foi definido como a intensidade média da luz refletida da condição de pH 8 mais três desvios padrão. Células na condição de pH 6 com valores de intensidade acima desse limite foram classificadas como SA-β-gal positivas. Essa abordagem fornece um corte objetivo e baseado em dados que leva em conta o sinal de fundo e minimiza a classificação de falsos positivos.

Para avaliar a sensibilidade e compatibilidade da detecção com a imunocitoquímica, foram comparadas imagens de luz refletida e campo claro em todas as condições de pH. No pH 5 (Figura 2Aa–Ad), a luz refletida revelou forte precipitado X-gal, enquanto o campo claro detectou apenas os depósitos mais proeminentes. No pH 6 (Figura 2Ba–Bd), a luz refletida identificou células SA-β-gal positivas que não eram detectáveis de forma confiável por campo claro, onde o sinal parecia fraco ou difuso. No pH 8 (Figura 2Ca–Cd), a luz refletida detectou sinal mínimo, consistente com baixa atividade enzimática, enquanto campo claro não revelou precipitado detectável. Essas observações indicam que a imagem por luz refletida proporciona melhor detecção do precipitado X-gal, especialmente em níveis intermediários e baixos de atividade.

O ensaio de luz refletida SA-β-galões também foi realizado em uma placa de 96 poços (Figura Suplementar 3). Essa configuração resultou em aumento do sinal de fundo devido à reflexão na superfície plástica, reduzindo o contraste entre células positivas e negativas. Imperfeições superficiais, como riscos, aumentam ainda mais a reflexão do fundo (Figura Suplementar 3, setas pretas). Como resultado, a análise quantitativa foi menos confiável em comparação com a imagem em lábios de vidro. Se for necessário um formato de placa, placas com fundo de vidro são recomendadas para detecção ótima de sinais.

Juntos, esses resultados mostram uma clara separação entre a condição de pH 5 fortemente positiva, o sinal intermediário no pH 6 e o fundo mínimo no pH 8. Esse padrão é consistente com o comportamento esperado do ensaio e apoia o uso de imagens por luz refletida para a detecção da atividade de SA-β-gal em populações celulares primárias heterogêneas.

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Figura 1: Detecção dependente de pH por luz refletida SA-β-gal em células SVF.
WGA (Aa, Ba, Ca) e imagens de luz refletida (Ab, Bb, Cb) detectam precipitado X-gal em condições de pH 5, 6 e 8. O sinal é mais forte no pH 5, reduzido no pH 6 e mínimo no pH 8. A quantificação da intensidade da luz refletida (Ac, Bc, Cc) mostra a distribuição da atividade da β-galactosidase sob cada condição. Cada ponto representa uma única célula, e a linha vermelha pontilhada indica o limiar usado para classificar células SA-β-gal-positivas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Comparação entre luz refletida e detecção de SA-β-gal em campo claro em células SVF. Imagens ampliadas de células SVF coloridas com X-gal nos pH 5, 6 e 8 mostram coloração WGA (Aa, Ba, Ca), coloração CD31 (Ab, Bb, Cb) para identificar células endoteliais, imagens de luz refletida (Ac, Bc, Cc) para detectar precipitado X-gal, e imagens correspondentes de campo claro (Ad, Bd, Cd). A imagem de luz refletida detecta precipitado de X-gal em diferentes condições, enquanto o campo claro revela principalmente depósitos de maior intensidade e oferece detecção limitada em níveis de sinal mais baixos. A coloração CD31 é observada tanto em condições de pH 5 quanto de pH 6, permitindo a identificação de células endoteliais. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura suplementar 1: Visão geral do pipeline do CellProfer. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Fluxo de trabalho para segmentação de núcleos e células. Imagens representativas de (A) núcleos coloridos por Hoechst e (B) segmentação correspondente do núcleo. (C) Segmentação celular baseada na coloração de membrana. (D) Sobreposição de núcleos e limites celulares. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Imagem de luz refletida SA-β-gal em uma placa plástica de fundo de 96 poços. (A) coloração WGA e (B) imagem de luz refletida de células SVF coradas por X-gal em uma placa padrão de fundo plástico de 96 poços. Observa-se um aumento do sinal de fundo em comparação com imagens em vidro, consistente com a reflexão da luz na superfície plástica, o que reduz o contraste para a detecção de SA-β-gal. Riscos superficiais (setas pretas) aumentam ainda mais o sinal de fundo (B). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

β-galactosidase associada à senescência é um dos marcadores mais amplamente utilizados para identificar células senescentes; no entanto, métodos tradicionais de detecção em campo claro são limitados por baixa sensibilidade e alto grau de subjetividade. A imagem por luz refletida de células SVF coloridas por X-gal oferece uma abordagem mais sensível e reprodutível para medir a atividade SA-β-gal no nível de célula única, mantendo a compatibilidade com a coloração por anticorpos fluorescentes. Ao otimizar esse método para SVF, a atividade SA-β-gal pode ser detectada junto com marcadores específicos de células, como CD31, permitindo a análise de populações celulares primárias heterogêneas sem a necessidade de separação celular.

Vários parâmetros técnicos são críticos para uma implementação confiável. A calibração precisa do pH da solução de coloração X-gal é essencial, pois pequenos desvios podem alterar a atividade enzimática e afetar a detecção de sinais. O medidor de pH deve ser calibrado imediatamente antes do uso com tampões padrão (por exemplo, pH 4,0 e pH 7,0), e o pH da solução de coloração deve ser verificado após a preparação. Além disso, a aquisição do Z-stack deve capturar o volume total da célula, pois a cobertura incompleta leva à subestimação da intensidade da luz refletida. Os parâmetros de imagem, incluindo potência do laser e ganho do detector, devem ser otimizados para maximizar o sinal sem saturação e mantidos consistentes entre as amostras.

Comparado a ensaios alternativos de senescência, a imagem com luz refletida oferece várias vantagens. A detecção de SA-β-gal em campo claro depende da identificação visual do precipitado e, portanto, tem sensibilidade limitada e não é facilmente compatível com análise multiplexada. Em contraste, a imagem por luz refletida detecta a densidade óptica do precipitado X-gal enquanto preserva a definição enzimática dependente do pH de SA-β-gal. Isso permite a detecção simultânea da atividade SA-β-gal juntamente com marcadores baseados em fluorescência, possibilitando que a senescência seja avaliada usando múltiplas características dentro de células individuais.

Apesar dessas vantagens, o método apresenta limitações. A imagem com luz refletida detecta a densidade óptica do precipitado X-gal, mas não consegue distinguir definitivamente esse sinal de outras estruturas intracelulares densas, tornando condições controladas por pH essenciais. A condição pH 8 fornece uma linha base para a luz refletida de fundo e suporta a discriminação entre sinais específicos e inespecíficos. A abordagem também requer um microscópio confocal com capacidades adequadas de detecção de luz refletida, que podem não estar disponíveis em todos os sistemas. Além disso, as propriedades da superfície de imagem podem afetar a qualidade do sinal: placas de fundo plástico aumentam o fundo devido à reflexão e reduzem o contraste, enquanto superfícies de vidro proporcionam detecção mais confiável.

Esse método se baseia no trabalho de Dedic et al., que estabeleceram imagens de luz refletida para a detecção de SA-β-gal em adipócitos maduros, e estende a abordagem para uma gama mais ampla de tiposcelulares 26. A aplicação em SVF recém-isolados demonstra que a detecção de precipitado X-gal por luz refletida é compatível com diversas populações primárias de células humanas. A capacidade de combinar a detecção de SA-β-gal com marcadores de linhagem como CD31 permite ainda mais a análise de subpopulações definidas dentro de tecidos heterogêneos.

Embora a variabilidade entre doadores seja esperada em amostras humanas primárias, o objetivo deste estudo é estabelecer a implementação técnica do método, em vez de caracterizar a variabilidade biológica. Aplicações futuras em múltiplas amostras biológicas ou condições experimentais devem incorporar análises estatísticas apropriadas. Além disso, a validação em modelos estabelecidos de indução de senescência e a integração com marcadores ortogonais de senescência refinarão ainda mais a interpretação da atividade SA-β-gal em populações celulares complexas.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos a Liv Eidsmo e Keira Melican por fornecerem acesso a biópsias de tecidos humanos, e a Lena Appelsved pela assistência no processamento das amostras. Este estudo foi apoiado por bolsas para a KLS do Conselho Sueco de Pesquisa (2022-01236), do Programa Estratégico de Pesquisa em Diabetes do Instituto Karolinska (C5471162), da Fundação Novo Nordisk (C5475033), do Prêmio Scholar da Fundação Vallee (C5471234), da Fundação Mark Aspire Grant (C5477023), da Sociedade Sueca do Câncer (22 2420), do Programa Estratégico de Pesquisa em Células-Tronco e Regeneração no Instituto Karolinska (C5472022) e da Fundação Knut e Alice Wallenberg (2020.0118; 2023.0536).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1.5 mL tubesBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC
5 mL tubesEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96-well plateCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 primary antibodyAbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
Confocal microscope with reflected light capabilitiesEvidentFV-4000
CoverslipsEprediaBB02400500A113MNZOCoverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
Fixation bufferSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
IncubatorStuartS130HHybridization oven/shaker
Microscopy slidesAvantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
Mounting mediaInvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype controlR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH meterMeterLabR21M002 PHM210 standard pH meter 
Pipette tips (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL filtered pipette tips
Pipette tips (200 µL)Corning4823200µL filtered pipette tips
SABG KitCell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
Secondary antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
Water bathRowe ScientificSWB20DStandard water bath
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm

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